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荧光素酶的种类以及应用介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
在细胞和基因的微观世界中研究探索，遗传报告基因是非常有用的"可视化和量化"工具，具有广泛的应用。荧光素酶（萤光素酶）以出色的灵敏度、使用方便、可以定量检测而成为理想的报告基因。 荧光素酶不是特定的分子，是一类中能催化产生生物发光的酶的统称，不同来源的荧光素酶各有特点，可催化底物发出不同颜色的光，有的还可以配合进行双色发光检测。这种酶最早的来源，也是最有代表性一种来自学名为Photinus pyrali'的北美萤火虫体内的萤光素酶，之所以称为萤光素酶，一方面也有助于区分需要激发光源才可以生成激发荧光的荧光蛋白，而萤光素酶是一个催化底物分解的发光反应，荧光素酶在细胞内没有背景，因此可以检测非常微弱的表达，灵敏度更高。不过，随着发光检测设备的不断推进和升级，生物发光灵敏度高，检测方便的优势使得这类酶与荧光蛋白一起渐有取代其他报告基因的趋势。于是，越来越多新的并非来自萤火虫的新荧光素酶进入市场，不再是“萤光”的天下了。 种类更多 来自萤火虫的荧光素酶是最经典的荧光素酶，这个61KD单体酶无需修饰直接具有酶活，催化反应依赖ATP，很适合作为遗传报告基因，也最为人熟知；此外还有Renilla（海肾）荧光素酶，只有36KD大小的蛋白，底物是腔肠素，只需要氧气，不需要ATP，发蓝色光，一直是萤火虫荧光素酶的替代，并常与萤火虫荧光素酶组合成为双色检测，或者作为内对照。 那么，让我们来看看现在有哪些新荧光素酶了？ 1. Gaussia荧光素酶，这是一种分泌型的蓝色荧光素酶，蛋白分子量更小，只有22KD，含有天然的分泌型信号肽，可以引导荧光素酶分泌到细胞培养上清中，从而无需裂解细胞即可检测报告基因活性。所表达的荧光素酶85%以上都会分泌至胞外，不过由于这种分泌型荧光素酶产生的信号比来自Firefly（萤火虫）或Renilla（海肾）的信号强很多倍，所以还可以在细胞裂解物中检测到细胞内残留的荧光素酶。分泌表达为检测带来很大的方便——不需要裂解珍贵的细胞，即可作活细胞实
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高架十字迷宫实验应用及ZS行为学实验视频分析系统
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
高架十字迷宫实验应用 高架十字迷宫实验应用 一、实验概述 高架十字迷宫是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧形成矛盾冲突行为来考察动物的焦虑状态。高架十字迷宫具有一对开臂和一对闭臂，啮齿类动物由于嗜暗性会倾向于在闭臂中活动，但出于好奇心和探究性又会在开臂中活动，在面对新奇刺激时 二、实验仪器 仪器型号为ZS-3000，仪器由十字迷宫组件、摄像装置以及ZS动物行为轨迹分析系统组成 十字迷宫组件两条相对开放臂，材质采用高级医用有机板制作，接触面不反光，可使用酒精清洗除味； ZS为用户提供了两种跟踪算法：灰度法和背景减法，稳定可靠的头、中、尾三点跟踪算法，甚至可以可识别果蝇幼虫等微小生物。 三、实验方法及应用 实验开始时将小鼠从中央格面向闭合臂放入迷宫，记录ZS行为学软件进行数据分析。 进入开放臂次数及停留时间与大鼠的焦虑情绪成负相关，进入开放臂次数越少，停留时间越短，说明老鼠的焦虑情绪越严重。 ZS行为学实验视频分析系统是北京众实迪创科技发展有限责任公司新推出的集视频采集、行为学分析、参数记录及数据统计为一体的新一代行为学实验分析系统。该系统通过可灵活配置的摄像组件，采集模拟或数字摄像机影像，并借助计算机视觉相关算法对影响进行分析和评估，获取被试动物的行为学参数。系统对主流统计软件提供数据接口，实验数据可导出分析，同时带有针对动物实验分析的统计分析报表模块，方便用户快速完成数据的采集分析和电子归档。 系统采用模块化设计，用户可根据需要定义实验场景，通过区域设定和实验条件设定，完成多样化实验步骤，并可根据场景定义和区域定义自动记录实验数据及实验录像。既可通过高清数字摄像系统进行视频数据采集，也可分析预先录制好的视频文件，便于演示与教学。 统一化设计的实验平台，安装简易便捷，方便清洁同时也为用户节约了实验设备占用场地空间。系统可重复测量而不影响其它行为分析，轻松了解实验
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动物行为学实验方法文献综述
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
前言 人生活在世界中，有各种各样的行为。这些行为构成了我们生活的社会环境。动物也有很多行为，繁殖行为、觅食行为、趋避行为、战斗行为、利他行为等等。动物行为学就是研究动物行为的一门学科。通过学习前人对动物行为学的研究得出的规律，能够以观察、实验的方式了解动物的状态、需求等。作为一门经验性学科，实验方法尤为重要。本文作为0迷宫(zero maze)视频分析系统的文献综述，在阅读了12篇动物行为学分析论文之后选择性提取了包括0迷宫在内的几种常规实验方法，详细做了描述。动物行为学实验方法文献综述 2 正文 动物行为学实验主要有学习记忆类、药物成瘾类、抗焦虑抑郁类、抗疲劳类、神经精神类、痛觉测试类共六大类。其中抗焦虑抑郁类又可作为大部分动物行为学实验的前置实验，作为每一组动物的焦虑度的一个评判。当然洞板实验测得的探索性也可以作为一组动物的生理心理指标的。 2.1 学习记忆类 学习记忆类实验要求实验动物与实验员之间已经建立熟识的条件，保证实验员与动物的接触不会对实验动物产生试验中的干扰因素。动物行为学实验方法文献综述 2.1.1 洞板实验 洞板试验是基于大鼠喜欢探洞的天性而设计的，它能有效反映大鼠对新环境的探索能力(Kameiet al, 2004; Calamandrei etal,1996)。实验箱分内外两层，外层为隔音用；内层中间有一方形中空塑料柱用以限制动物的部分活动。内层有22只水平方向的光电管。光电管对面设红外线光源。一组光电管距底板40mm用来记录活动量、向前运动等。另一组光电管距底板125cm用以记录动物站立式的探究活动。箱的4个角各有一个光电管，用以记录拐角处的活动。底板下面0.5cm处由光电管记录大鼠的探洞次数和时间 试验时间30分钟将实验动物放入洞板装置中同时开始测量记录，每隔两分钟读取一次探洞次数用来做探洞次数—时间曲线图。动物行为学实验方法文献综述 洞板实验实际结果中可以看出随着时间推后，探洞频率会降低，如果几天重复再同一装置中测量也能看到
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原核表达（原理、材料与实验方案）的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、原理 1、E .coli 表达系统 E .coli 是重要的原核表达体系。在重组基因转化入E .coli 菌株以后，通过温度的控制，诱导其在宿主菌内表达目的蛋白质，将表达样品进行SDS-PAGE 以检测表达蛋白质。 2、外源基因的诱导表达 提高外源基因表达水平的基本手段之一，就是将宿主菌的生长与外源基因的表达分成两个阶段，以减轻宿主菌的负荷。常用的有温度诱导和药物诱导。本实验采用异丙基硫代-β-D-半乳糖昔（IPTG）诱导外源基因表达。 不同的表达质粒表达方法并不完全相同，因启动子不同，诱导表达要根据具体情况而定。 二、材料 1、诱导表达材料 (1 )LB （Luria—Bertani）)培养基 酵母膏 (Yeast extract)5g 蛋白胨 (Peptone)10g NaCl10g 琼脂 (Agar)1-2% 蒸馏水 (Distilled water)1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌 (2 )IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 ml 蒸馏水中，0 .22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 ml /份，－20 ℃ 保存。 (3 )l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI (pH 6 .8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 % 溴酚蓝 10 % 甘油 2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ）酶溶法 （1）裂解缓冲液： 50 mmol / L Tris-CI (pH 8 .0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯甲基磺酰氟（PMSF ）。 （3）10 mg / ml 溶菌酶。 （4）脱氧胆酸。 （5）1 mg / ml DNase I。 2 ）超声破碎法 (1 )TE 缓冲液。 (2 )2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液： 100 mmol / L Tris-HCI (pH 8 .0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 % 溴酚蓝 20 % 甘油 三、实验方案 1、外源基因的诱导表达 (1 ）用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。 (2 ）按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到相应的宿主菌。 (3 ）筛选出含重组子的转化菌落，提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱，DNA 序列测定， 确定无误后进行下一步。 (4 ）如果表达载体的原核启动子为PL 启动子，
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感受态专题：磷酸钙法转染HEK293T细胞的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一.试剂配制 无菌水ddw： 高温灭菌； 分装； 2XHBS： 280mM NaCl 10mM KCl 1.5 mM Na2HPO4 12 mM glucose 50 mM HEPES Adjust the pH , every 0.05pH from 7.00 to 7.45 using 10N NaOH, then add ddw. to the final volume. 过滤灭菌，分装； 2M CaCl2： 过滤灭菌，分装。 二. 实验过程： 1. 铺细胞： 选择状态良好的293T细胞传代， 2-3x105个细胞/35mm dish。 2. 20-24h后，待细胞长至铺满瓶底约50-70%的时候，进行转染。下面就35mm dish为例，采用以下转染体系： ddw： 105ul plasmid： 2 ug （如0.5ug/ul， 即用4ul） 2M CaCl2： 16.5ul 2XHBS： 125ul 按上述顺序，往eppendorf管中依次加入上述四种试剂。 先将前三者混匀， 最后加2XHBS。 一种方法是，加2XHBS时要逐滴加入， 吹打至微现乳白色， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。 另一种方法是， 加入2XHBS后立即吹打约40下（不过这个要根据每个人的力道和吹打的频率而定， 建议做一个梯度实验，吹打不同的次数看哪次的转染效率高以后就按这个次数来吹打）， 之后步骤同上， 立即均匀滴入培养皿，轻轻摇匀后置于培养箱中，6-8h后换液。
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感受态专题：电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
材料和试剂 1. 恒温旋转式摇床 2. 三角烧瓶（容量为1或2L） 3. 50ml灭菌离心管 4. 低温高速离心机 5. SB培养基 细菌培养用胰化蛋白胨 20g 细菌培养用酵母提取物 5g NaCl 0.5g 去离子水 950ml 250mmol/L KCl溶液 10ml 以5N的NaOH调节溶液的pH值至7.0，加去离子水至1L，高压蒸气灭菌。 6. 20%葡萄糖溶液 7. 1mol/L MgCl2溶液 8. 10%甘油 操作步骤 1. 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆，接种于10m1 SB培养基中。 2. 37℃摇床培养过夜。 3. 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。 4. 37℃培养直到OD600=0.7～0.8。 5. 将培养物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃离心20min，弃上清。 6. 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中，4000r/min于4℃离心20min，弃上清。 7. 重复第（6）步骤。 8. 将菌体重悬于15ml 10%甘油，并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml细菌。迅速地将其吹打重悬； 9. 分装成200μl或40μl 的小份，操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。 10. 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率，应达到109cfu/μg DNA。
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感受态专题：电转化流程的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、电转化感受态细胞的制备 1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照） 2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。 3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。 5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。 6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。 8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。 9. 次日观察转化子生长情况，并记录。 二、连接产物纯化 1．将连接产物转移至一1.5ml Eppendorf管中，加入下列试剂: 10μl of ddH2O 2μl of 3M NaAC（PH5.2） 50μl of 无水乙醇 轻轻混匀，稍微离心并将其置于-20℃放置1小时以上； 2.4℃，top Speed 离心30分钟； 3.小心移去上清，避免接触到管底的沉淀物； 4.加入500μl70%的乙醇，轻轻颠倒几次洗涤沉淀（注：不要离心混匀）； 5.4℃，top Speed离心5分钟； 6.小心移去上清，将此Eppendorf管置空气中直至无乙醇气味； 7.加入10μlddH2O重新溶解沉淀，4℃短期保存，-20℃长期保存备用； 三、电转化 1.从-80℃冰箱中取出感受态细胞，置于冰上解冻； 2.取1 μl 纯化后的质粒于一1.5ml的离心管中，将其和0.1CM的电极杯一起置于冰上预冷。 3.将40～100ul解冻的感受态细胞转移至此1.5ml 的离心管中，小心混匀，冰上放置10min。 4.打开电转仪，调至Manual，调节电压
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感受态专题：细胞瞬时转染
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
原理： 通过脂质体介导转染法及电穿孔等基因转染技术，将靶基因导入细胞，一般在转染后48小时左右，靶基因即可在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。 应用： 观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能（短时间即可进行观察，但效应会很快丢失）。 一般流程： 1）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖。 2）细胞转染（脂质体、电穿孔、FuGENE6等） 3）48小时以后鉴定目的基因的表达情况。 前期准备： l构建好的外源基因载体，或目的基因基本信息。 l待转染的细胞系（1×106个细胞，可传代，倍增时间小于48小时）以及细胞培养条件的说明。 l若需要检测靶基因的表达，请提供相应抗体。 结果呈现：
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疯狂的小鼠视觉研究实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
疯狂的小鼠视觉研究实验 近些年，神经科学的发展迅速，然而在大脑视觉系统研究中多数研究人员使用的都是小鼠模型，因为小鼠是夜行动物、他们使用鼻子和胡须作为导航，因此一些人担心对小鼠视觉研究实验可能毫无意义! Nature：疯狂的小鼠视觉研究实验 几十年以来，科学家们都在致力于大脑视觉系统的研究，旨在了解视觉信号如何被大脑皮层处理。近十年前，美国的两位科学家开始以小鼠作为研究模型进行基础研究，尽管小鼠的大脑结构与人类相差甚远，但是这种研究不无意义。 当 Cris Niell 说他想研究小鼠是如何看东西的时候，并没有得到更多高级神经科学家的认可。小鼠是夜行动物，它们用鼻子和胡须为自己导航，因此许多研究人员认为关于小鼠的许多视觉实验是毫无意义的。通常情况下，研究人员都用猴子作为替代模型，因为猴子有处于正前方的视野和比小鼠更加敏锐的视觉。更重要的是科学家们可以依靠几十年的成熟的技术，将灵长类动物的实验结果运用到人类的视觉系统。“人们都说，在老小鼠身上研究视觉系统，这太疯狂了，”Niell 回忆说。 但他始终坚信这些啮齿动物能够为视觉系统的研究带来一些独特的东西。自 1960 年代以来，研究人员就利用猫和猴子做过一些研究，发现了大脑将信息从眼睛映射到意识的重要线索。但是想要在细胞水平上进行更加深入的研究，研究人员就必须能够控制和监测神经元，而在猫和猴子的复杂系统中很难做到这一点，在小鼠身上就相对容易得多。如果小鼠处理视觉刺激的进程与灵长类动物相似的话，我们就可以搞清楚大脑是如何在受到外来刺激后从大量的数据中提取信息——甚至弄清楚大脑是如何工作的。 在众多神经科学家对 Niell 的想法表示质疑的时候，他找到了一个支持者，旧金山加州大学的 Michael Stryker。Stryker 为 Niell 提供了在自己实验室里攻读博士后的机会，两人从 2005 年开始着手准备这一项疯狂的小鼠视觉实验。 将近十年后，这两位研究者拥有了更多的研究同仁。在去年举行的神经科
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寄生虫检测制片盒使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
寄生虫检测制片盒使用说明书 （改良加藤氏法） 用途：改良加藤氏法是世界卫生组织（WHO）推荐的检测寄生虫卵方法，可同时检测蛔虫卵、钩虫卵、肝吸虫卵等等。本检测制片盒辅助用于显微镜检测粪便中寄生虫虫卵，可提高寄生虫检测效果并能定量分析感染度。 检测盒组成： 1、复合染液1瓶 30毫升/瓶 2、定量板 100片 3、刮片 100片 4、尼龙网 100张 5、玻璃纸 100张 6、载璃片 100片 7、使用说明书 1 份 操作步骤： ⒈ 置尼龙网于受检粪样上，用刮片在尼龙网上轻刮，粪便细渣即由网片微孔中透至网片表面。 ⒉ 取定量板1片放在载玻片中部，用刮片将尼龙网上细粪渣填入定量板的中央孔中，填满刮平。 ⒊ 小心提起定量板，粪样即留在载玻片上。 ⒋ 取1张经复合染液浸渍24小时的玻璃纸盖在粪便均匀展开至玻璃纸边缘。 ⒌ 编号后置于30—40℃，30分钟后即可镜检。 结果判断： 以镜检每片检出的虫卵数的24倍数，即为每克粪便虫卵数（EPG） 注意事项： ⒈ 覆盖玻璃纸时应刮去上面多余的染液。 ⒉ 对薄壳虫卵，如钩虫卵等的透明时间最长不能超过2小时，避免因透明过度而漏检。 ⒊ 建议每份粪样做两张涂片，求其均值，再计算其EPG。 警示及提示性说明： 检测后的样本及其它废弃物应按医用垃圾有关管理规定妥善处理
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动物、植物、微生物中提取高质量的基因组DNA
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
基因组DNA的提取 概 述 基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP和PCR分析, DNA长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下),并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA时, 应考虑除去多糖和酚类物质。 本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA提取的一般方法。 1. 从植物组织提取基因组DNA 一、材料 水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。 二、设备 移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml离心管（有盖）及5ml和1.5ml离心管，弯成钩状的小玻棒。 三、试剂 1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris·Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。 2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g葡萄糖，6.9g二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul巯基乙醇，加水至300ml。
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感受态专题：细胞瞬时转染技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
原理： 通过脂质体介导转染法及电穿孔等基因转染技术，将靶基因导入细胞，一般在转染后48小时左右，靶基因即可在细胞内表达。根据不同的实验目的，48小时后即可进行靶基因表达的检测等实验。 应用： 观察目的基因及其表达蛋白在某种细胞中的功能（短时间即可进行观察，但效应会很快丢失）。 一般流程： 1）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖。 2）细胞转染（脂质体、电穿孔、FuGENE6等） 3）48小时以后鉴定目的基因的表达情况。 前期准备： l构建好的外源基因载体，或目的基因基本信息。 l待转染的细胞系（1×106个细胞，可传代，倍增时间小于48小时）以及细胞培养条件的说明。 l若需要检测靶基因的表达，请提供相应抗体。 结果呈现： 构建好的瞬时转染细胞及相关的外源基因表达分析。
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感受态专题：转化克隆的筛选和鉴定
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1．目的 学会用酶切法或PCR法筛选重组质粒转化成功的克隆菌。 2．原理 利用转化后宿主菌所获得的抗菌素抗性性状筛选出获得质粒的菌落克隆。再从这些菌落中鉴定出质粒上带有外源基因插入片断的克隆菌落。 3．器材 旋涡混合器，小镊子，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，超净工作台，酒精灯，无菌牙签，摇菌管。 4．试剂 LB培养基（加抗菌素），PCR用试剂，引物，质粒提取用试剂，酶切需要的限制性内且酶及其缓冲液，65%甘油（65%甘油，0.1mol/L MgSO4，0.025mol/L Tris-Cl pH8.0）。 5．实验准备 无菌dd water，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌）；牙签（灭菌），摇菌管（灭菌），100mg/mL氨苄青霉素。 6．操作步骤 方法一：酶切鉴定 （1）在超净工作台中取3支无菌摇菌管，各加入3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素），用记号笔写好编号。 （2）在超净工作台中将70%乙醇浸泡的小镊子头用酒精灯烤过，镊取一支无菌牙签。用牙签的尖部接触转化的平板培养基上的一个白色菌落，然后将牙签放入盛有3mL LB（含50mg/mL氨苄青霉素）的摇菌管中。用此法随机取3个白色菌落，分别装入3个摇菌管中。 （3）37℃摇菌过夜后，用碱裂解法分别提取质粒。摇菌管中的剩余菌液保留在4℃冰箱中。 （4）将提取到的3管质粒样品与空质粒同时电泳，根据分子量判断和选区有插入片段的质粒，然后可用酶切、与目的片段一同电泳来鉴定其上的外源插入片断大小是否与预期相符。 （5）将经过鉴定判断为正确的质粒保存。按照编号找到冰箱中原菌液。根据需要进行放大培养提取其质粒或进行诱导表达，或取500mL菌液与500mL 65%甘油混合后-80℃保存。 （6）在被细菌污染的桌面上喷洒70%乙醇，擦干桌面，写实验报告。 方法二：快速PCR筛选法 （1）在转化的平板培养基上随机选取3个边缘清晰的白色菌落，并用记号笔在其所在的培养皿底部玻
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感受态专题：真核细胞的转染实验步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
1. 在6孔板中接种1~3×105细胞/孔，加入2ml完全培养基，置CO2孵箱中37℃培养过夜。 2. 待细胞长到50-80%单层时，在无菌离心管中配制如下溶液： i. 溶液A：将4?g待转染的超纯DNA稀释到250?l无血清培养基中，静置5min ii. 溶液B：将2-25?l LipofectAMINE 稀释到250?l无血清培养基中，静置5min 3. 混合溶液A和B，轻轻混匀，室温放置15-45min。 4. 用2ml无血清培养基轻轻洗涤细胞，加入0.8ml无血清培养基/孔，将脂质体复合物滴加到孔中，轻轻摇晃混匀，置CO2孵箱中37℃孵育2-24hr。 5. 用完全培养基替换转染液，继续培养。 6. 24-72hr后检测蛋白质的表达或传代并加入选择性抗生素以筛选稳定表达株。
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感受态专题：感受态细胞的制备及溶液配制
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
实验试剂 LB培养基，KB培养基，10%甘油，液氮，0.1M CaC12 溶液 实验设备 超净工作台，摇床，离心机，250mL离心瓶，0. 5mL的离心管 实验材料 大肠杆菌，农杆菌和假单胞杆菌 实验步骤 1. 电击感受态细胞的制备 1) -80℃ 保存的大肠杆菌，农杆菌或者假单胞杆菌在固体平板上(DH5a，BL21在LB平板上，GV3101在LB/Gen; P.s. pv. tomato 0288-9和P. syringae pv. tabaci 6505在KB平板上)划线。 2) 接种单克隆于5-10mL液体培养基，37℃ (大肠杆菌)或者28℃ (农杆菌和假单胞杆菌)培养过夜。 3) 按照1:100-1:500转接到500-1000mL液体培养基，37℃ 培养3-4小时(大肠杆菌)或28℃ 培养8-10小时(农杆菌和假单胞杆菌转化)至细菌达到对数生长期。 4) 将菌液装入250mL离心瓶中，冰上放置30分钟后，4℃ 离心15分钟。 5) 弃上清，加入200mL 10%甘油，于冰上缓慢将菌摇散，4℃ 离心15分钟。 6) 重复前一步骤2-3次，最后弃上清，加入少量10%甘油重悬细菌。 7) 分装于0. 5mL的离心管中，每管40ul，液氮速冻，-80℃ 存放。 2. 热激感受态的制备 1) 挑取E.coli BL21单克隆接种到5mL LB培养液中，37℃ 振荡培养过夜。 2) 按照1:100-1:500转接到500-1000mL液体培养基，37℃ 培养3-4小时至细菌达到对数生长期。 3) 将菌液装入250mL离心瓶中，冰上放置30分钟后，4℃ 离心15分钟。 4) 弃上清，加20mL预冷的0.1M CaC12 溶液轻轻悬浮菌体，冰上放置15-30分钟后于4℃ 离心5分钟。 5) 弃上清，加2mL冰预冷的0.1M CaC12 溶液，重悬菌体。 6) 分装于0. 5mL的离心管中，每管40ul，液氮速冻，-80℃ 存放。
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