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如何使FISH达到最佳效果
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原理 FISH检测对被测样本没有特殊的要求。可以是来自骨髓的细胞，也可以是来自羊水的细胞；可以是冰冻切片的样本，也可以是经过石蜡包埋的样本。甚至可以利用尿液样本进行膀胱癌复发的预后。获取的样本细胞也无需经过培养扩增，FISH检测可以显示单个细胞核内染色体的异常情况。 二、样本的老化（目的是为了使FISH达到最佳效果） 1. 将样本片子放入2×SSC 37℃1小时 2. 将片子放入新制的胃蛋白酶工作液中（20ul 10%胃蛋白酶溶液中加入40ml0.01NHCl）37℃13分钟 3. 用磷酸盐平衡液（PBS）室温下清洗5分钟 4. 将片子放入快速固定液（0.95%甲醛：1ml的37%甲醛，0.18gMgCl2和39ml的PBS，4℃保存，一个月内使用）室温5分钟 5. 在室温下用PBS清洗5分钟 6. 晾干片子。为了加速晾干可以用带棉塞的巴氏移液管吹打玻片 7. 将片子浸泡在70%的乙醇中。用乙醇冲洗1分钟 8. 从70%乙醇中取出，依次放入85%、100%乙醇中重复以上步骤 9. 根据需要降解片子 三、实验所需试剂和耗材： 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 胃蛋白酶 HC0767 2 MgCl2 JT2113 7786-30-3 3 乙醇 CCF12679 127852-29-3 4 FT-200 200ul黄吸头 5 F-EP020 2ml圆底连盖离心
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碱裂解法提取质粒DNA
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验目的 1、掌握最常用的提取质粒DNA的方法和检测方法； 2、了解制备原理及各种试剂的作用。 二、实验原理 碱裂解法是基于DNA的变性与复性差异而达到分离目的的。碱性使质粒DNA变性，再将pH值调至中性使其复性，复性的为质粒DNA，而染色体DNA不会复性，缠结成网状物质，通过离心除去。 细菌质粒是一类双链、闭环的DNA，大小范围从1kb至200kb以上不等。各种质粒都是存在于细胞质中、独立于细胞染色体之外的自主复制的遗传成份，通常情况下可持续稳定地处于染色体外的游离状态，但在一定条件下也会可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。 质粒已成为目前最常用的基因克隆的载体分子，重要的条件是可获得大量纯化的质粒DNA分子。目前已有许多方法可用于质粒DNA的提取，本实验采用碱裂解法提取质粒DNA。 碱裂解法是一种应用最为广泛的制备质粒DNA的方法，碱变性抽提质粒DNA是基于染色体DNA与质粒DNA的变性与复性的差异而达到分离目的。在pH值高达12.6的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性。 质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离，当以pH4.8的NaAc/KAc高盐缓冲液去调节其pH值至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质－SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 三、实验方法 1）材料 含pUC19质粒的大肠杆菌，1.5ml塑料离心管，离心管架，枪头及盒、卫生纸。 2）设备 微量移液器(20μl，200μl，1000μl)， 台式高速离心机，恒温振荡摇床， 高压蒸汽消毒器(灭菌锅)， 涡旋振荡器，恒温水浴锅，双蒸水器，冰箱等。 3）试剂准备 1、 LB液体培养基：称取蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast extract) 5g，NaCl 10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 2. 氨
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硝酸银染色
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、硝酸银染色简单介绍 ※ 银染的方法很多，文献报道有一百多种。但是，确切的染色机理仍不清楚。一般原则是在碱性pH值环境中，银离子将还原为金属银，并且蛋白质表面将被着色。 ※ 由于银染的高灵敏度，其在凝胶上的斑点小于1 ug /蛋白质斑点，因此在二维凝胶分析中被广泛使用。找到目标蛋白斑点后，通过测试染色富集目标斑点，然后进行进一步的肽指纹分析（PMF）或序列确定。随着质谱技术的不断改进和发展，银染后直接测量 mol蛋白斑点并不困难。这是一种与质谱兼容的银染方法。 二，实验步骤如下： 实验步骤 溶液(250毫升 每 gel) Gel-Type 1.固定 量取25毫升 acetic acid, 100毫升 甲醇 125毫升 milli-Q 水 1摩 unbacked 2x15 最少 1摩 on film or glass support or 1.5 unbacked 2x60 最少 2.敏化 量取75毫升甲醇, 0.5g Na2SO3, 17g NaAc, milli-Q 水 to 250毫升 30 最少 60 最少 3.漂洗 取250毫升 milli-Q 水 3x5 最少 5x8 最少 4.银染 取0.625g AgNO3, milli-Q water to 250毫升 20 最少 60 最少 5.漂洗 取250毫升 milli-Q 水 2x1 最少 4x1 最少 6.显色 取6.25g Na2CO3 , 100μ formaldehyde, milli-Q 水 to 250毫升 4 最少 6 最少 7.终止 取3.65g EDTA；milli-Q 水 to 250 毫升 10 最少 40 最少 8.漂洗 取250毫升 milli-Q 水 3x5 最少 2x30 最少 三、硝酸银染色液使用注意事项： 1.许多银染程序都使用戊二醛，可以提高银染的敏感性和染色结果的再现性，但是由于戊二醛可以修饰蛋白质，因此会影响质谱鉴定和蛋白质斑点的分析； 2.确保所有的染色容器都绝对干净，可以使用玻璃或塑料作为染色容器。 3.水的纯度对染色结果的质量有很大影响，应至少使用两次蒸馏水（电导率
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血清脂类测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、血清脂类测定方法简单介绍： ※ 目前，仅将脂蛋白中总胆固醇的测定方法作为脂蛋白的定量依据，即确定HDL，LDL或VLDL中的胆固醇，它们被称为高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。 ）和低密度脂蛋白。 胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白胆固醇（VLDL-C）。这种类型的测量方法目前在临床中广泛使用，快速且相对准确。 shielding屏蔽直接测量法使用脂蛋白中的特定抗体和其他物质首先保护血浆中的LDL和VLDL免受胆固醇测量试剂的影响，同时无需离心分离直接测量未封装的HDL中的胆固醇在这种情况下，测定胆固醇含量HDL的速度快而准确。它是近年来发展起来的一项新技术，值得推广和应用。 ※ 测定血清总脂质血清总脂质主要包括FC，CE，PL和TG。除了帮助诊断脂质代谢紊乱和相关疾病外，血清总胆汁淤积还可以用于总脂质增加的原发性胆汁酸肝硬化，肾病综合征或急慢性肝炎以及总脂质降低的严重肝炎，肝硬化以及其他严重的肝脏损害，恶病质，甲状腺功能亢进和吸收不良综合征等疾病。总血脂通常随年龄增长而增加，40岁以上的人血脂显着增加，65-70岁的人血脂降低。不同的测量方法在正常参考值上有一定差异。测量方法有两种：一种是提取方法，通过脂质提取剂将血清脂质引入培养基中，然后进行定量。另一种是直接测量方法，即不需要提取。实验步骤如下： 1.脂质提取方法脂质存在于血清脂蛋白中。使用甲醇或乙醇分离与蛋白质结合的脂质，并使用甲醇或乙醇的非极性有机溶剂溶解脂质。非极性溶剂（例如Bloor溶剂（醚：酒精1：3，V / V）或FovCh溶剂（氯仿：甲醇2：1，v / V），醚氯仿的混合物可以改善脂质和蛋白质的切割结合能力达到提取目的。将血清脂质提取到有机溶液中后，将其蒸发至干，除去有机溶液，并通过加热进行氧化，然后对颜色进行定量。 2.直接脂质测定法，如磺基-磷酸-香兰素法，是在血清中加入浓硫酸加热，冷却后，加入试剂显色（即SPV反应）直接测定血清中总脂质。 三，胆固醇的测定： 血清中的胆固醇包括CE和FC，酯型CE占70
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HE染色石蜡切片的制作
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、HE染色石蜡切片简介 二、HE染色石蜡切片制作所需材料及试剂设备用具： 切片机、恒温箱、溶蜡箱、玻璃缸、载玻片、盖玻片、手术刀片、镊子、包埋盒。试 剂 ：10％福尔马林、酒精、二甲苯、固体石蜡、苏木精、酸水、氨水、酒精伊红染色剂型、加拿大树胶 三、HE染色石蜡切片制作步骤: 1.取材与固定取动物新鲜组织块(一般厚度不超过0．5厘米)投入预先配好的固定液中(10％福尔马林，Bouin氏固定液)使组织、细胞的蛋白质变性凝固，以防止细胞死后的自溶或细菌的分解，从而保持细胞本来的形态结构。2.脱水透明 一般用由低浓度到高浓度酒精作脱水剂，逐渐脱去组织块中的水份。再将组织块置于既溶于酒精，又溶于石蜡的透明剂二甲苯中透明，以二甲苯替换出组织块的中酒精，才能浸蜡包埋。3.浸蜡包埋将已透明的组织块置于已溶化的石蜡中，放入溶蜡箱保温。待石蜡完全浸入组织块后进行包埋：先制备好容器(如折叠一小纸盒)，倒入已溶化的石蜡，迅速夹取已浸透石蜡的组织块放入其中。冷却凝固成块即成。包埋好的组织块变硬，才能在切片机上切成很薄的切片。4.切片与贴片： 将包埋好的蜡块固定于切片机上，切成薄片，一般为5—8微米厚。切下的薄片往往皱折，要放到加热的水中烫平，再贴到载玻片上，放45℃恒温箱中烘干。5.脱蜡 常用HE染色，以增加组织细胞结构各部分的色彩差异，利于观察。苏木精(Hematoxylin，H)是一种碱性染料，可将细胞核和细胞内核糖体染成蓝紫色，被碱性染料染色的结构具有嗜碱性。伊红(Eosin，E)是一种酸性染料，能将细胞质染成红色或淡红色，被酸性染料染色的结构具有嗜酸性。染色前，须用二甲苯脱去切片中的石蜡，再经由高浓度到低浓度酒精，最后入蒸馏水，就可染色。6.染色HE染色过程是：①将已入蒸馏水后的切片放入苏木精水溶液中染色数分钟。②酸水及氨水中分色，各数秒钟。③流水冲洗1小时后入蒸馏水片刻。④入70％和90％酒精中脱水各10分钟。⑤入酒精伊红染色液染色2—3分钟。7.脱水透明： 染色后的切片经
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酵母菌落PCR方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验介绍 问：我很沮丧。我最近在做巴斯德毕赤酵母，但转化后没有合适的筛选方法。如果我使用基因组，这将花费时间和金钱，并且由于我转移电的机会非常低，我只有1％-10％，因此我想使用菌落PCR进行筛选，但很难打破酵母壁。如果**不好，基因组将不会被释放，也不会有阳性结果。 我检查了一些数据，说使用反复的冻融方法，直接挑出单个菌落就足够了吗？也有人说蜗牛酶被用来帮助消化。我对此不太清楚，所以请帮助大虾。现在我真的为此受了伤！ 答：蜗牛酶提取DNA后，PCR效果非常稳定 二、酵母DNA的提取 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 PH标准缓冲溶液(PH=7.00±0.02) HC1482 2 磷酸盐-SDS电泳缓冲液 HC1305 3 乙酸钾 127-08-2 JT0883 4 无水乙醇 64-17-5 JT26000 5 异丙醇 67-63-0 JT25997 6 酚氯仿 865-49-6 JW0132 7 0.9mol/l 山梨醇 50-70-4 SS0003 8 50mmol/l Tris 77-86-1 SS1426 9 50ml插口离心管 F-EP500-C 10 YEPD培养基 HC0991 1.向新鲜细菌中加入150ul（200ul）i25（30）ul蜗牛酶（30mg / ml），于37度，10分钟（30分钟水浴，间隔5分钟，摇晃一次），以避免细胞沉到底部管。 2. 10000rmp离心10min，除去上清液，在沉淀物中加入缓冲液I250ul 3.添加25ul 10％SDS。 65度，30分钟水浴。 4.加入25ul 5mol / lKAC，冰浴60分钟（可放置4度冰箱） 5. 12000rmp，15分钟，取上清液，在上清液中加入2-3倍体积的无水乙醇，混合并在-20度下放置一小时（可以过夜，取出后不要摇晃，直接离心） 6. 12000rmp，15min，弃去上清液。 7. 150ul，BufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min 8.将上清液转移到干净的离心管中，加入6ul（10ug / ul
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植物体内脱落酸、赤霉素的分离和测定实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、脱落酸、赤霉素的分离和测定实验介绍 在植物生命活动的研究中，经常需要准确地了解某种激素的含量和每种激素的比例。因此，植物内源激素的提取，分离和测定是植物生理实验技术中极为重要的内容。本实验以ABA和GA为例，介绍激素提取，分离和测定的基本原理和方法。 二、脱落酸、赤霉素的分离和测定实验原则 脱落酸（ABA）和赤霉素（GA）可以溶解在有机溶剂（例如丙酮，甲醇）中进行萃取，并将粗提物进行一系列分离技术（例如萃取，薄层色谱法或纸色谱法）等）将ABA和GA与其他成分分开。然后从生物学或物理化学上鉴定纯化的ABA和GA。 （1）生物学鉴定1. ABA能抑制植物器官的生长。在某些浓度条件下，抑制程度与浓度成线性关系。使用该线性关系，可以确定组织中ABA的含量。 2. GA可以刺激幼小植物的节间伸长，特别是矮化植物的茎。在一定的浓度范围内，茎伸长与GA浓度呈线性关系。因此，可以根据茎的伸长来确定GA的含量。 （2）理化鉴定：可采用气相色谱法。 三、脱落酸、赤霉素的分离和测定材料，仪器和试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 脱落酸 14375-45-2 JH0488 2 赤霉素 77-06-5 HXH501769 3 甲醇 67-56-1 JT25999 4 石油醚 8032-32-4 SS6155 5 乙酸乙酯 141-78-6 JT11988 6 HCl 2644-70-4 7 硅酸 1343-98-2 LSH78385 8 氯仿 865-49-6 JW0132 9 脱落酸 14375-45-2 JH0488 10 金属镓 7440-55-3 JT2264 11 乙醇 64-17-5 JT26000 12 正丁醇 71-36-3 JT25998 13 异丙醇 67-63-0 JT25997 14 氨水 1336-21-6 JT8652 （1）材料：植物叶片
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RT-PCR实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、RT-PCR实验简介： RT-PCR是将RNA的反转录(RT)和CDNA的聚合酶链式扩增(PCR)相结合的技术。 RT-PCR技术灵敏而且用途广泛,可用于检测细胞中基因表达水平,细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。 二、RT-PCR实验所需材料及试剂： EP管、离心机、氯仿、异丙醇、乙醇、DEPC水、溴化乙锭 三、RT-PCR实验步骤 （一）、总RNA提取 1.取200mg组织，将其放入1.5ml EP管中，加入1ml Trizol切碎。 2.震动30秒。 3.加入0.2ml氯仿，在室温下剧烈摇动30s 3分钟。 4. 12000×g，4℃离心15分钟。 5.吸出上层无色水相，并转移到另一个EP管（约0.5ml）中。 6.加入等体积的异丙醇，-20℃，30min。 7.在12000×g，4°C下离心10分钟，在试管底部可以看到微量的RNA沉淀 8.丢弃上清液，加入1ml的75％乙醇并摇匀。 9. 7500×g，在4℃下离心10分钟。 10.丢弃上清液，用滤纸小心吸收残留的液体，并在室温下干燥5-10分钟。 11.将沉淀物溶于20μlDEPC水中，取1μl，然后加入79μlDEPC水以测量OD260 / OD280 12.计算浓度和纯度，并保存在-70℃。 （二）、逆转录合成cDNA 快速混合并离心一次，冻存在-20℃冰箱冰柜中。 （三）、PCR反应 1.快速混合并离心一次，PCR产物在-20℃下保存。 2.取8μlPCR产物并加入5×上样缓冲液2μl2％琼脂糖凝胶电泳120V 3.100mA 30min溴化乙锭染色，凝胶成像仪成像和存储 四、实验所需试剂清单： 1 1.5ml尖底连盖高速离心管（灭菌） F-EP015-H 2 异丙醇 JT25997 3 甲醇中三氯甲烷 BDM000285 4 溴化乙锭(EB) SS1957 5 DEPC处理水 HC1335 6 乙醇 JT26000
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巴斯德人体观察实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、巴斯德人体观察实验简介： ※ 实验目的 1.掌握人体x体（巴氏体）载玻片的制备方法 2.观察并确定巴氏体的形态特征和位置，识别个人的性别。 ※ 实验原理 Pap体也称为X体：正常雌性，位于相间细胞核中，靠近核膜的内缘，大小约为1?1.5 um，呈三角形或椭圆形，数量为x染色体数减一， Pap体是由于女性X染色体之一的失活而形成的。 里昂的剂量理论说，女人有两个X染色体，但是表达的大多数遗传物质与只有一个X染色体的男人一样多。这是因为只有女性X染色体中的一条保持活跃，而另一条则复制较晚且没有活性。灭活的染色体在形态上是异染色体的，即DNA螺旋被紧紧地压紧，并且染色深而密，称为巴氏体。 二、巴斯德人体观察实验所需材料及试剂： 口腔粘膜细胞，发根鞘细胞显微镜，载玻片，盖玻片，牙签，移液器（甲醇：冰醋酸= 3：1），生理盐水，苯酚洋红染色 三、巴斯德人体观察实验步骤 1）材质 口腔粘膜细胞：对象用清水漱口几次，用干净的牙签刮除女性口腔内的粘膜，原位刮擦2至3次，第一次丢弃，然后第二次和第三次清洁幻灯片。 毛根细胞：提取具有毛囊（约2厘米）的女性头发，并将其插入载玻片上。 2）固定 在离心管中离心物料（口腔粘膜细胞），首先以2000 rpm离心20分钟，弃去上清液，加入新固定的固定液（甲醇：冰醋酸= 3：1），在37°C下静置30分钟，然后以1000 rpm离心。15分钟后弃去上清液，加入1ml固定液（甲醇：冰醋酸= 3：1）制成细胞悬液，将其放在载玻片上，将溶液（95％乙醇：乙醚= 1：1）固定1小时，然后风干。 3）染整 将一滴细胞悬液固定在载玻片上，固定20分钟，用蒸馏水清洗2至3分钟，在37℃水浴中用1N盐酸洗涤20分钟，风干，加入1至2滴染料溶液20至30分钟（请勿干燥），用水洗涤以除去染料溶液即可干燥。 直接涂抹：滴加染色液，室温20?30min（请勿干燥），盖上盖玻片并按。 毛细胞：拉出毛干，直接向毛囊细胞中加入5N盐酸，处理5分钟，吸去盐酸，加入染色液，染色20分钟，加盖玻片，然后按。 五，镜检
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蛋白质与DNA相互作用实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、蛋白质与DNA相互作用实验的简单介绍 许多细胞生命活动中，例如DNA复制，mRNA转录和修饰以及病毒感染等，都涉及DNA与蛋白质之间的相互作用。随着重组DNA技术的发展，已经分离出许多重要的基因。现在的关键问题是揭示环境因素和发育信号如何控制基因转录活性。 二，蛋白质与DNA相互作用实验目的： 1.鉴定和分析参与基因表达调控的DNA元素。 2.分离并鉴定这些顺式元素特异性结合的蛋白质因子。 这些问题的研究涉及DNA和蛋白质之间的相互作用。 研究DNA与蛋白质相互作用的实验方法包括： 1.凝胶阻滞实验。 2. DNase1占用空间实验。 3.甲基化干扰实验。 4.体内足迹测试。 5.下拉实验。 三，凝胶阻滞实验 1.概念：凝胶阻滞测定法（Gelretardationassay），被称为DNA迁移率变动测定法（DNAmobilityshiftassay）或谱带阻滞测定法（Bandretardationassay），是一种特殊的特殊实验，于1980年代初出现，用于研究DNA和蛋白质在体外的相互作用。凝胶电泳技术。 2.原则： 在凝胶电泳中，由于电场的作用，裸露的DNA分子移动到正电极的距离与它们的分子量的对数成反比。如果某个DNA分子与特殊蛋白质结合，由于分子量的增加，其在凝胶中的迁移将被阻止，因此到正电极的距离会相应缩短，因此在凝胶中会出现滞后带，从而是凝胶阻滞实验的基本原理。 3.流程： 首先准备细胞蛋白提取物（理论上含有特殊的转录因子），用放射性同位素标记待检测的DNA片段（含有转录因子结合位点），将该标记的探针DNA与细胞蛋白提取物一起孵育，从而生成DNA-蛋白复合物，在保持DNA-蛋白质结合的条件下进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，最后，进行放射自显影以分析电泳结果 4.实验结果分析： （1）如果放射性标记的条带集中在凝胶底部，则表明细胞提取物中没有可与探针DNA结合的转录因子蛋白。 （2）如果凝胶顶部出现放射性标记的条带，则表明细胞提取物中存在可以与探针DNA结合的转录因子蛋白。 5. DNA竞争实验： DNA竞争实验（DNA竞争测定）的具体方法如下
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大豆分离蛋白的提取方法（借鉴）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、大豆分离蛋白的提取方法简介 大豆的蛋白含量较高而且营养丰富，一般含蛋白30%——50%。大豆蛋白含有8种人体必需氨基酸，且比例比较合理，只是赖氨酸相对稍高，而蛋氨酸和半胱氨酸含量较低。目前大豆蛋白已成为一种重要的蛋白资源，特别是大豆分离蛋白含蛋白质90%以上，是一种优良的食品原料。 大豆分离蛋白主要由11S球蛋白（Glycinin）和7S球蛋白（β-con-glycinin）组成，大约占整个大豆籽粒贮存蛋白的70%。这两种球蛋白的组成、结构和构象不同，大豆分离蛋白的功能特性也不同。大豆分离蛋白在提取、加工和贮运过程中会发生物理和化学变化，这些适当的改变可以提高大豆蛋白在食品中应用的功能特性。 二，大豆分离蛋白的提取方法 2.1 大豆分离蛋白的提取碱提酸沉法 大豆分离蛋白的传统提取方法是碱提酸沉法。将脱脂豆粕与蒸馏水以1:10的比例混合，用NaOH调整混合物的pH为7——9，充分搅拌浸提碱溶大豆蛋白，离心分离，用稀HCI调整上清液的pH值为4.5— —4.8，沉淀出蛋白质，离心分离，沉淀重新溶于pH7.0——8.0的NaOH溶液中，喷雾或冷冻干燥即得大豆分离蛋白，其蛋白含量可达90%以上，得率24%—— 38%。 2.2 大豆分离蛋白的提取膜分离方法 聂幼华等研究了用膜分离技术制取大豆分离蛋白。先用Ca(OH)2的稀溶液浸提脱脂大豆粕，蛋白浸出率可达80%左右。将浸提液进行循环超滤分离，截留液的浓度可达13%左右。把截留液喷雾或冷冻干燥，即得大豆分离蛋白产品，其蛋白含量可达95%以上。与传统的碱提酸沉法比较，产物得率高，质量好，能耗少，废水排放污染也一定程度上得到解决。 2.3 大豆分离蛋白的提取双极膜电解法（Bipolar Membrane Electroacidification） 这种方法是在电渗析的基础上发展而来的。双极膜由3层组成：阴离子交换膜和阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层。在电流作用下，水分子在双极膜上电离为H+和OH-，由于膜选择透过阴离子或阳离子，导致溶液的pH值降低，达到大豆蛋白质的等电点而使蛋白质沉淀。这种方
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TUNEL法检测细胞凋亡（实验简介,实验步骤,所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、TUNEL法检测细胞凋亡实验简介 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。 二、TUNEL法检测细胞凋亡实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、蛋白酶K、苏木素、甲基绿、甘油 三、TUNEL法检测细胞凋亡实验步骤 1.用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min； 3.PBS漂洗2次； 4.用蛋白酶K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min； 5.PBS漂洗2次； 6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。 7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。 8.PBS漂洗3次； 9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm） 10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。 11.PBS漂洗3次； 12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min； 13.PBS漂洗3次； 14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数并拍照。 四、TUNEL法检测细胞凋亡
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SP法做免疫组化实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、SP法做免疫组化实验简介 SP法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。 按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。 二、实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）、苏木素 三、实验步骤 1、烤片，68℃，20分钟 2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯20min⇒二甲苯20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min 3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min； 4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。 5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。 6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）； 滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min； 7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min； 8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。 四、实验所需试剂清单 序号 产品名 货号 CAS 备注 1 PBS缓冲液 HC2031 2 乙醇 JT26000 64-17-5 3 二甲苯 JT24017 1330-20-7 4 苏木精 SX0217 517-28-2 5 枸橼酸盐缓冲液 HC1486
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凝胶迁移（实验简介,实验原理,实验操作步骤，所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
凝胶迁移实验简介 凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMS electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 一、凝胶迁移实验原理 EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。 二、凝胶迁移实验操作步骤 1、实验前准备 （1）合理的实验方案：根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等 （2）样本制备 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。 （3）探针制备 根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。 三、实验所需的试剂列表 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 TEMED HC1303 2 Binding Buffer JT2113 7786-30-3 3 Agarose SF0014 9012-36-6 4 TBE FMK19848 936475-62-6 5 1000ul蓝吸头 FT-1000 6 200ul黄吸头 FT-200 7 2ml圆底连盖离心 F-EP020 8 96孔无裙边PCR板，透明（灭菌） F-PCR-96W-H
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Western(实验简介,实验所需材料及试剂,实验步骤,注意事项)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、Western实验简介： Western是用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下，通过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固体支持物上，然后使用抗原-抗体特异性反应从蛋白质混合物中检测出来，靶蛋白，用于在正常或实验条件下定量或定性确定靶蛋白在细胞或组织中的表达，Western印迹法还可用于蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用的后续分析，作为廉价，方便，可靠的研究工具，它将与蛋白质组学和质谱技术等技术一起在蛋白质组学时代起重要作用。 影响免疫印迹成功的主要因素是抗体识别的抗原分子中表位的性质，由于抗原样品的变性，只有那些识别耐受性表位的抗体才能与抗原结合，大多数多克隆抗体或多或少都包含此类抗体，因此多克隆抗体通常用于免疫印迹，第二个影响因素是蛋白质储液中抗原的浓度，在免疫印迹之前，需要通过免疫沉淀和亚细胞分离来富集一些低表达水平的蛋白质。 二、Western实验所需材料及试剂： 丙烯酰胺、SDS凝胶上样缓冲液、培养皿、双丙烯酰胺、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 三、Western实验步骤 （一）、样品制备 对于Western Blotting实验，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白质样品必须是均质的，可溶的并解离为单个多肽亚基，并且必须使彼此之间的聚集最小化，从而使其最终取决于自身的分子量，当靶蛋白的含量非常低时，有必要选择靶蛋白含量高的组织或细胞器（例如核提取物），或通过免疫沉淀富集，通常样品包括重组蛋白，细胞和组织。 1.样品采集 1）培养细胞 收集粘附细胞和悬浮细胞的方法不同，细胞裂解物的类型也不同。建议裂解含SDS的凝胶上样缓冲液并煮沸。 2）动物组织 与细胞不同，组织块由于体积大而必须预先压碎并匀浆。 2.样品定量 电泳前需要确定蛋白浓度，以确保样品体积一致，这有利于后续的定量或半定量分析。有许多常用的测量蛋白质浓度的方法。它们的灵敏度和所需时间不同，并且不同的干扰物质会影响不同的方法。实验者可以根据样品的制备方法（裂解液组成，去污
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