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限制性片段长度多态性（RFLP）分析
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、RFLP实验简介： 限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术是分子生物学中重要的分析方法之一，用于检测DNA序列的多态性。 PCR-RFLP是PCR技术，RFLP分析和电泳方法的结合。首先，通过复制扩增待测目标DNA片段，然后使用限制酶消化扩增产物，最后通过电泳分析目标。 DNA片段是否被切割和分类。 在实验中，使用RFLP分析技术检测NMDA受体GRIN2A亚基基因内含子3中的两个SNP位点rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。 二、RFLP实验方法原理： DNA限制性核酸内切酶具有识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA双链的功能。 DNA分子由于突变（核苷酸取代，插入或缺失）酶识别序列而改变（或形成了）限制性内含子，因此DNA限制性内切酶不能（或可以）切割目标DNA片段。进行电泳检测时，具有相应DNA限制酶识别序列的原始DNA片段会变成一个短片段，没有相应的DNA限制。性核酸内切酶识别的序列原始DNA片段的长度不会改变。 三、RFLP实验材料： PCR扩增仪，电泳仪，电泳槽，微波炉，恒温箱或恒温水浴等 限制性酶BstNI，模板DNA，Taq聚合酶，PCR引物（上游引物：5-CTAAGCCTTCCCTTTATCACC-3';丙烯酰胺，酶消化缓冲液，下游引物：5-TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT-3'），电极缓冲液，上样缓冲液等。 序列 产品名 货号 CAS 备注 1 IEF电极缓冲液 HC1773 2 丙烯酰胺 LSH54449 3 PAGE连续蛋白上样缓冲液 HC1292 四、RFLP操作步骤： 1. PCR扩增：PCR反应体系为20μl，含模板2μl（约50ng），每个引物1.6μl，dNTP1.6μl（0.4mM），10×缓冲液2μl，Taq酶0.5U，加双蒸水至20.0μl ; PCR反应条件为95℃2min，94℃30sec / 64℃30sec / 72℃30sec（5个循环），94℃30sec / 63℃30sec / 72℃30sec（5个循环
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Hoechst 33258染色实验(原理,介绍,步骤,所需试剂)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、Hoechst 33258染色实验原理 Hoechst 33258和Hoechst 33342均为非嵌人性荧光染料。它们在活细胞中 DNA聚AT序列富集区域的小沟处与DNA结合。 活细胞或固定细胞均可从低浓度溶液中 摄取该染料。从而使细胞核着色。故又把此类染料称为DNA探针。Hoechst 33342和Hoechst 33258均可溶于水并在水溶液中保持稳定。Hoechsr-DNA的激发和发射波长分别550nm和460nm。在荧光显微镜紫外光激发时，Hoechst-DNA发出亮蓝色荧光。 二、Hoechst 33258染色实验所需溶液的配制： (1)Hoechst 33258储存液 Hoechst 33258 lmg 0．01mol／LPBS(pH 7．4) 5ml (2)Hoechst 33258工作液(终浓度为0．5ug／ml) Hoechst 33258浓缩液 125ul 0．01mol／LPBS(pH 7．4) 50ml 三、Hoechst 33258染色实验操作步骤 (1)细胞悬液或培养单层细胞等标本，用醋酸―乙醇或Carnoy固定液固定； (2)0．01mol／LPBS漂洗5分钟； (3)Hoechst 33258工作液染色，室温15分钟； (4)0．01mol／LPBS漂洗3次，每次5分钟； (5)用甘油与PBS比例为1：9的混合液或水溶性封片剂封片，荧光显微镜观察。 结果：该染料为DNA的特异性荧光探针，细胞核呈亮蓝色荧光 四、Hoechst 33258染色实验所需试剂 序号 产品名 货号 CAS 备注 1 PBS缓冲液 HC2031 2 乙醇 JT26000 64-17-5 3 醋酸 JT11990 64-19-7 4 甘油 JT26018 56-81-5
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细菌转化实验（原理,方法,材料,步骤）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、细菌转化实验实验方法原理： 细菌转化实验中质粒DNA粘附在细菌细胞的表面，并在42°C进行短时热休克处理，以促进DNA的吸收。然后将其在非选择性培养基中培养一代。质粒上携带的抗生素基因表达表达后，不含抗生素的培养基在培养基中生长。 二、细菌转换实验材料： 涡旋混合器，微量移液器采样器，移液器吸头，1.5ml微量离心管架，双面微量离心管架，干燥的恒温气浴（或恒温水浴），制冰机，恒温摇床，培养皿（固体LB-Amp铺砌），超净工作台，酒精灯，玻璃涂层棒，恒温培养箱。 培养基（不含抗生素），LB培养基（含抗生素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。 （注）准备：无菌ddH2O，将1.5ml离心管放入铝制饭盒中（灭菌），将移液器吸头插入相应的吸头盒中（灭菌），20％IPTG（M / V），2％X-gal（M / V，含N，N-二甲基甲酰胺）。 序列 产品名 货号 CAS 备注 1 10ul白吸头(灭菌) FT-10-H 2 200ul黄吸头（灭菌 FT-200-H 3 1000ul蓝吸头（灭菌） FT-1000-H 4 90mm*15mm 塑料培养皿(灭菌） FM-90-X 5 90mm*20mm 塑料培养皿(灭菌） FM-90-G 6 10*10cm方形塑料培养皿(灭菌） FM-100-F 7 N,N-二甲基甲酰胺 JSH68495 8 IPTG HC1600 三、细菌转化实验操作步骤： （1）预先将
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酶联免疫吸附实验（所需材料,实验步骤）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、酶联免疫吸附实验所需材料： 1．酶标板，100μltip头，1ml Ep管，湿盒； 2．包被稀释液（0.05mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液,pH 9.6）； 3. 封闭液(5%小牛血清/PBS溶液)； 4. 洗涤液(PBST, pH 7.4)； 5. 样本稀释液(PBS, pH 7.4)； 6. 酶标第2抗体(羊抗兔)稀释范围1:5,000-1:100,000； 7. 底物液(TMB-过氧化氢尿素溶液)； ① 底物液A:TMB20mg,无水乙醇10ml,加双蒸水至100ml. ②底物液B(0.1mol/L柠檬酸-0.2mol/L磷酸二氢钠缓冲液, pH 5.0-5.4) ③底物A和B按1:1混合即成TMB-过氧化氢尿素溶液. 8. 终止液(2mol/LH2SO4溶液)； 9. 0.9%生理盐水 序号 产品名 货号 CAS 备注 1 PBS缓冲液 HC2031 2 无水柠檬酸 SY0004 77-92-9 3 磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液 HC0095 4 乙醇 JT26000 64-17-5 5 PBST缓冲液 HC0757 6 碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液 HC0064 二、酶联免疫吸附实验操作步骤 1. 包被过程(注意设置空白对照,阴性对照): 将所用抗原用包被稀释液稀释到适当浓度(一般所需抗原包被量为每孔20-200μg),每孔抗原加入100μl, 置37℃,4h,或4℃,24h;弃去孔中液体.(为避免蒸发,板上应加盖或将板平放在底部有湿纱布的金属湿盒中) 2. 封闭酶标反应孔: 5%小牛血清置37℃封闭40min.封闭时将封闭液加满各反应孔,并去除各孔中的气泡,封闭结束后用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min. 洗涤方法:吸干孔内反应液,将洗涤液注满板孔,放置2min略作摇动,吸干孔内液,倾去液体后在吸水纸上拍干。洗涤次数3次 3. 加入待检测样品(建立合适的浓度梯度): 检测时一般采用1:50-1:400的稀释度, 应采用较大稀释体积进行,一般保证样品吸取量>20μl.将稀释好的样品加入酶标反应孔中,每样品至少加双孔, 每孔100μl,置于37℃,40-60min.用洗涤液满孔洗涤3遍,每遍3min. 4. 加入酶标抗体: 酶标抗体:
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非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(实验简介,工作液准备,实验方法,实验操作,实验问答)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳简单介绍： 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（Native-PAGE）用于在不添加变性剂（例如SDS乙醇）的情况下对保持活性的蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，这通常用于鉴定和纯化同工酶。无需SDS的天然聚丙烯酰胺凝胶电泳可以使生物大分子保持电泳过程中的自然形状和电荷。它们的分离是基于它们不同的电泳迁移率和凝胶的分子筛作用，因此可以得到高分离度，尤其是在电泳分离后，仍可以保持生物大分子（例如蛋白质和酶）的生物活性，这具有很大的意义。该方法是对凝胶上的两个相同样品进行电泳。电泳后，将凝胶切成两半，一半用于主动染色以识别特定的生物大分子，另一半是用于对所有样品进行染色以分析样品中各种生物大分子的类型和含量。 二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验方法： 非变性聚丙烯酰胺凝胶和变性sds-page电泳的操作基本相同，但是非变性聚丙烯酰胺凝胶和电泳缓冲液的制备不能包含SDS等变性剂。 通常，应通过非变性凝胶电泳将蛋白质与碱性或酸性蛋白质区分开。分离碱性蛋白质时，请使用低pH凝胶系统；分离酸性蛋白质时，请使用高pH凝胶系统。 酸性蛋白质通常用于非变性凝胶电泳中。缓冲液系统的pH值为8.8。蛋白质将带负电荷，并且蛋白质将与阳极一起移动；而碱性蛋白通常在弱酸性环境中进行电泳，并且该蛋白带正电。此时，有必要将阴极和阳极反转以电泳分离酸性蛋白质。 序号 名称 货号 CAS 备注 1 Tris-HCl，pH 8.8 SS6165 2 Acr：Bis = 29：1 SS6101 3 甘氨酸 SS3763 4 2×溴酚蓝 SX0029 115-39-9 5 甲醇 JT25999 67-56-1 6 甘油 JT26018 56-81-5 三、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳工作液准备： 1.40％凝胶储备溶液（Acr：Bis = 29：1）; 2.4×分离缓冲液（1.5M Tris-HCl，pH 8.8）：将18.2g Trisbase溶于ml
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还原糖和总糖的测定（3,5-二硝基水杨酸比色实验）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一，还原糖和总糖的测定简单介绍： 还原糖和总糖的测定原理主要是利用糖的不同溶解度，可以分别提取植物样品中的单糖，二糖和多糖，并通过酸水解将未还原的二糖和多糖降解为还原的一糖，掌握确定还原糖和总糖的基本原理，并学习如何通过比色法和分光光度计测量还原糖。 二，还原糖和总糖的测定比色原理： 还原糖的测量是定量测定糖的基本方法：还原糖是指含有游离醛或酮基的糖，单糖是还原糖，二糖和多糖不一定是还原糖，其中乳糖和麦芽糖是还原糖，蔗糖和淀粉是非还原糖。利用糖的不同溶解度，可以分别提取植物样品中的单糖，二糖和多糖，并通过酸水解将未还原的二糖和多糖降解为还原的一糖。然后确定样品中还原糖和总糖的含量（就葡萄糖含量而言，为还原糖）。 在碱性条件下降低糖含量加热它被氧化成糖酸和其他产物，而3,5-二硝基水杨酸被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内，还原糖的量与棕色和红色物质的颜色深度成比例。使用分光光度计测量540 nm波长的光密度。检查标准曲线并计算。总糖含量。由于多糖被水解成单糖，因此分子水会加入每个断裂的糖苷键中，因此在计算多糖含量时，应乘以0.9。 三、还原糖和总糖的测定实验材料，主要仪器和试剂： 序号 名称 货号 CAS 备注 1 蔗糖 SS1498 57-50-1 2 水杨酸 SY0007 69-72-7 1.实验材料 面粉;精密pH试卷. 2.主要仪器 （1）带塞玻璃秤试管：20毫升×11 （2）大型离心管：50mL×2 (3)烧杯：100毫升×1 （4）三角瓶：100ml×1 （5）容量瓶：100mL×3 （6）刻度移液器：1mL×1; 2mL×2; 10毫升×1 （7）恒温水浴 （8）开水浴 （9）离心机 （10）扭矩平衡 （11）分光光度计。
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基因克隆实验（实验操作流程,实验方法）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、基因克隆实验操作流程： 基因克隆实验操作流程如下：首先收集基因信息——引物设计——PCR——回收目的片段——载体连接，并取得连接产物 —— 采用感受态细胞做转化 ——接菌——阳性克隆鉴定(酶切法或采用PCR)——质粒抽提——质粒测序——测序的结果分析——>克隆信息输入数据库中——质粒实物保存。 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 CaCl2 JT0418 10043-52-4 2 MgCl2 JT2113 7786-30-3 3 Agarose SF0014 9012-36-6 4 EB buffer HC1644 5 LB培养基 HC1007 6 1000ul蓝吸头 FT-1000 7 200ul黄吸头 FT-200 8 2ml圆底连盖离心 F-EP020 9 1.5ml尖底连盖离心管 F-EP015 二、基因克隆实验方法： 2.1 j基因克隆实验设计引物 引物设计要求：引物长度为25bp-35bp.forward primer 和reverse primer 的Tm，为70℃(±4℃)，且两条引物的Tm 相差不超过4℃。引物之间及引物本身避免形，成稳定的二聚体或发夹结构，引物与模板不能有任何错配。 forward primer 5’加: GGCCAATCCGGCC reverse primer 5’加: GGCCTCTAAGGCC 2.2 PCR 2.2.1 PCR 反应体系 模扳(100ng/ul 质粒) 2.00μl 4dNTP(10mM) 1.00μl 10×PCR Buffer 5.00μl MgCl2(25mM) 5.00μl 5’Primer (10-12uM) 4.00μl 3’Primer (10-12uM) 4.00μl 5M 甜菜碱 10.00μl Pfu (5U/ul) 0.50μl ddH20 18.50μl 总计 50.00μl 2.2.2 PCR 反应过程 1)从cDNA 文库克隆基因 Stage1 Stage 2 Stage3 1 Cycle 30Cycle 1 Cycle 95℃ 94℃ 60℃ 68℃ 68℃ 4℃ 2min 30sec 30 sec Xmin(2min/Kb) 10min 1min 备注：
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核酸类药物研究的知识分享(核酸类药物类型,核酸类药物介绍,核酸类药物特征)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
核酸类药物介绍 ※ 核酸是所有已知生命形式必不可少的生物聚合物或大生物分子。 核酸术语是DNA和RNA的总称，它们由核苷酸组成，核苷酸是由三部分组成的单体：5-碳糖，磷酸基、含氮碱基。 如果糖是复合核糖，则聚合物是RNA（核糖核酸）； 如果糖是从核糖中脱氧核糖衍生而来，则聚合物为DNA（脱氧核糖核酸）。 ※“核酸药物”利用“核酸”（指控制遗传信息的DNA和RNA等物质）作为药物。这些可以靶向分子，例如传统的低分子量药物和抗体药物无法靶向的mRNA和miRNA，因此人们对这些药物作为下一代药物抱有很高的期望。由于预计将导致以前难以**的药物的产生，因此正在全球范围内进行积极的研究。 ※ 另一方面，已经指出，核酸药物的开发有待解决的问题，包括“（i）体内核酸分子的不稳定性”，“（ii）对药物不良反应的关注”和“ （iii）药物输送系统（DDS）的困难。”此类药物主要由于欧美公司垄断了核酸的主要专利，国外日本公司在核酸药物的开发方面落后了一步，从而干扰了日本的发展。 核酸药物的特征： “核酸药物”是下一代药物发现技术，其作用机理与传统药物完全不同。 它还具有能够以中等大小的分子轻松制造的能力，并具有超越抗体药物的功效和安全性的潜力。 由于这些特征，期望将核酸药物用于以前难以**的癌症和遗传性疾病以及诸如流感和病毒感染的疾病中。 核酸药物的主要类型： ※ 利用DNA和RNA的核酸药物包括在从基因组DNA合成蛋白质的阶段靶向核酸的药物（例如mRNA和miRNA）和靶向蛋白质的核酸药物。 核酸类药物的类型和特征（预防和**药物）： 根据靶标和作用机理，存在具有不同类型和特征的核酸药物： Type Target Site of action Mechanism of action Summary siRNA mRNA Inside the cell (cytoplasm) mRNA cleavage Double-stranded RNA with cleavage of mRNA homologous to the sequence (siRNA), single-stranded hairpin RNA (shRNA), etc. with effect according to
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核苷酸知识分享
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
什么是核苷酸？要回答这个问题，我们需要在生物化学方面进行简短的学习。 核苷酸是由核苷和磷酸盐组成的有机分子。 它们是核酸聚合物脱氧核糖核酸和核糖核酸的单体单元，两者都是地球上所有生命形式中必不可少的生物分子。 核苷酸由三个亚基分子组成：含氮碱基，五碳糖和由一到三个磷酸酯组成的磷酸酯基团。DNA中的四个含氮碱基是鸟嘌呤，腺嘌呤，胞嘧啶和胸腺嘧啶； 在RNA中，使用尿嘧啶代替胸腺嘧啶。 核苷酸是制造新的DNA和RNA所必需的构件。接下来，当我们了解DNA的双螺旋结构时，我们需要回想起高中。还记得带有不同颜色梯级的螺旋形梯子吗？那是构成我们所有人中发现的基因和染色体的DNA模型。 DNA是一个非常大的分子，DNA阶梯的梯级由两个不同核苷酸的组合组成。核苷酸是称为鸟苷和胞嘧啶的分子，它们配对在一起，或者是腺苷和胸苷，也配对。腺苷和鸟苷被称为嘌呤。胞嘧啶，胸苷和尿嘧啶被称为嘧啶。 RNA与DNA相似，不同之处在于，该分子对中的分子尿嘧啶替代了胸腺嘧啶，而RNA是DNA与蛋白质之间的中间产物。基因是DNA核苷酸的离散序列，而基因则构成我们的染色体，因此，基因是由DNA构成是有道理的。 尽管所有这些听起来都是非常技术性的概念，但您需要了解的是核苷酸是创建新的DNA和RNA分子所必需的分子，然后新的DNA和RNA分子将被各种新型细胞使用。这很重要，因为核苷酸本身或与其他分子结合都参与细胞（以及身体）的几乎所有活动。 那么，到底什么使核苷酸如此重要呢？为了人类或其他动物继续生存，生长和发育，它必须一直创造新的细胞，以替代垂死的细胞。每分钟必须制造数百万个细胞，以保持身体的健康。这些细胞都必须使用核苷酸来制造新细胞，依靠DNA和RNA来正确繁殖细胞。核苷酸用于产生细胞，替换细胞，包括发育中的免疫细胞，发育中的精子细胞和支持女性生殖道。 哪些组织和细胞需要最大数量的核苷酸？尽管所有细胞都需要大量核苷酸，但是这些细胞，包括红细胞，白细胞，肠细胞，骨髓细胞和某些脑细胞
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核苷酸生物化学知识
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
核苷酸的分子结构中包含有连接至糖和磷酸基团的含氮碱基，有磷酸集团和核苷构成。核苷酸对人和动物非常重要，核苷酸是控制人和动物遗传特征的有效物质的核酸的重要组成部分。 在两个核酸家族类化合物中，分为：核糖核酸（RNA）和脱氧核糖核酸（DNA），DNA或RNA中的核苷酸序列编码细胞中合成蛋白质的结构。 核苷酸三磷酸腺苷（ATP）提供了许多代谢过程的驱动力。 几个核苷酸是辅酶，它们与酶一起作用来加速（催化）生化反应。 几乎所有核苷酸的含氮碱基是三种杂环化合物的衍生物：嘧啶，嘌呤和吡啶。 最常见的氮碱基是嘧啶（胞嘧啶，胸腺嘧啶和尿嘧啶），嘌呤（腺嘌呤和鸟嘌呤）和吡啶烟酰胺。 核苷与核苷酸相似，不同之处在于核苷缺少磷酸基团，核苷本身很少参与细胞代谢。 单磷酸腺苷（AMP）是RNA的成分之一，也是载能分子ATP的有机成分。 在某些重要的代谢过程中，AMP与无机磷酸盐结合形成ADP（二磷酸腺苷），然后形成ATP。 ATP中磷酸酯键的断裂释放出大量能量，这些能量在驱动化学反应或收缩肌肉纤维中被消耗。 环状AMP，另一个核苷酸，参与调节细胞代谢的许多方面，例如糖原的分解。 二核苷酸烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）与相关化合物烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）一起作为电子载体参与许多氧化反应。 这些物质充当某些酶的辅助因子。 按照化学结构式核酸类药物及衍生物分类： ※ 碱基及衍生物； ※ 核苷及衍生物； ※ 核苷酸及衍生物； ※ 多核苷酸。 本文主要介绍的核苷酸及衍生物： ※ 单核苷酸类：腺苷酸（AMP）、尿苷酸（UMP）、肌苷酸（IMP）、环腺苷酸（cAMP）、双丁酰环腺苷酸（DBC）、辅酶A（CoA）等； ※ 二核苷酸类：脲二磷酸葡萄糖(UDPG)；胞二磷胆碱(CDP-Choline)； ※ 核苷三磷酸类：腺三磷(ATP)；胞三磷(CTP)；脲三磷(UPT)；鸟三磷(GTP)； ※ 核苷酸混合物：5-核苷酸；2,3-核苷酸；脱氧核苷酸等等。 核苷酸类三磷酸衍生物-BIOFOUNT已经为各大科研机构、药企研发合成超过几百种核苷酸类化合物：
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核酸知识分享
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
核酸属于天然存在的化合物，可以分解产生磷酸，糖和有机碱（嘌呤和嘧啶）的混合物。 核酸是细胞的主要信息携带分子，通过指导蛋白质合成过程，核酸决定了每种生物的遗传特征。 核酸的两个主要类别是脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。 DNA是生命的主要蓝图，是所有自由生物和大多数病毒的遗传物质。 RNA是某些病毒的遗传物质，但也存在于所有活细胞中，RNA在某些过程中（例如蛋白质的制备）起着重要作用。 本文介绍了核酸的化学性质，描述了允许其充当遗传信息传递者的结构和特性： 一、核苷酸：核酸的组成部分： 1.核苷酸的基本结构 ※ 核酸是多核苷酸，即由一系列几乎相同的称为核苷酸的结构单元组成的长链分子。每个核苷酸由连接到戊糖（五碳）糖上的含氮芳香族碱基组成，该糖又连接到磷酸基团上。每个核酸包含五个可能的含氮碱基中的四个：腺嘌呤（A），鸟嘌呤（G），胞嘧啶（C），胸腺嘧啶（T）和尿嘧啶（U）。 A和G归类为嘌呤，C，T和U统称为嘧啶。所有核酸均包含碱基A，C和G；但是，T仅存在于DNA中，而U存在于RNA中。 DNA中的戊糖（2'-脱氧核糖）与RNA中的戊糖（核糖）的不同之处在于，糖环2'碳原子上没有羟基（-OH）。没有附着的磷酸基团，附着在碱基之一上的糖被称为核苷。磷酸基团通过将一个糖上的5'-羟基桥接到链中下一个糖的3'-羟基来连接连续的糖残基。这些核苷键称为磷酸二酯键，在RNA和DNA中相同。 2.生物合成与降解 ※ 从细胞中容易获得的前体合成核苷酸。嘌呤和嘧啶核苷酸的核糖磷酸部分均通过磷酸戊糖途径由葡萄糖合成。首先合成六原子的嘧啶环，然后将其连接到核糖磷酸上。在腺嘌呤或鸟嘌呤核苷的组装过程中，嘌呤中的两个环是在与核糖磷酸相连的同时合成的。在这两种情况下，最终产物都是带有磷酸酯的核苷酸，该磷酸酯附着在糖的5'碳上。最后，一种称为激酶的特殊酶使用三磷酸腺苷（ATP）作为磷酸供体将两个磷酸基团加在一起，形成核糖核苷三磷酸（RNA的直接前体）。对于DNA，从核糖核苷二磷酸中
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大肠杆菌检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、大肠菌检测实验介绍: 大肠菌属细菌是一组革兰氏阴性非细菌细菌，可以发酵乳糖，产生酸和气体，需氧和兼性厌氧菌。该细菌主要来源于人和动物的粪便，因此可将其用作粪便污染的指标，以评估食品卫生质量，推断出食物中肠道致病菌受到污染的可能性。食物中大肠菌的数量表示为100毫升（g）样品中最可能的大肠菌（MPN）数量。 二、实验所需仪器及试剂： 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 90*15mm培养皿 FM-90-X 2 三聚氰胺琼脂 108-78-1 JQ2301 3 标准革兰氏染色液 HC0448 4 结晶紫染色液 548-62-9 SX0037 5 95％乙醇 64-17-5 JT26000 6 1％草酸铵水溶液 6009-70-7 JT12066 7 碘 7553-56-2 JH0093 8 碘化钾 7681-11-0 JT0900 9 皂苷 7518-22-1 YZM013539 2.1恒温培养箱：36±1℃。 2.2 1000ml锥形瓶，1ml，10ml移液器。 2.3接种针。 2.4显微镜。 2.5超干净的工作台。 2.6幻灯片，酒精灯，洗耳灯泡，试管架。 2.7余额：0.01克。 2.8消毒锅。 2.9将培养皿（直径90mm）和试管在121°C灭菌30分钟。 2.10试管夹，酒精灯，秒表，载玻片3。培养基和试剂： 3.1乳糖胆盐发酵管：按照制造商的说明进行准备和消毒。 3.2曙红三聚氰胺琼脂平板：根据制造商的说明进行准备和灭菌。 3.3乳糖发酵管：按照制造商的说明进行准备和消毒。 3.4革兰氏染色液。 3.4.1结晶紫染色液： 水晶紫1g 95％乙醇20ml 1％草酸铵水溶液80ml 三、实验步骤 将结晶紫溶解在乙醇中，然后与草酸铵溶液混合。 3.4.2克氏碘溶液：碘1g、碘化钾2g、蒸馏水300ml 首先将碘和碘化钾混合，加入少许蒸馏水，摇匀，完全溶解后，加入蒸馏水至300毫升。 3.4.3沙皇复染溶液：沙黄色0.25g、95％乙醇10ml、蒸馏水90ml、将皂苷溶
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淀粉酶活性的测定
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、淀粉酶活性的测定实验原则： ※ 淀粉酶（淀粉酶）包括几个具有不同催化特性的成员。其中，α-淀粉酶随机作用在淀粉的非还原端上，产生麦芽糖，麦芽三糖，糊精等还原糖，同时降低淀粉浆的粘度。因此，它也被称为液化酶。每次β-淀粉酶都会从淀粉的非还原端切割出一个麦芽糖分子，也称为糖化酶。葡萄糖淀粉酶每次都从淀粉的非还原末端切出一个葡萄糖。由淀粉酶产生的这些还原糖可以还原3，5-二硝基水杨酸以产生棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。淀粉酶活性的大小与产生的还原糖的量成正比。可以用麦芽糖绘制标准曲线，并且可以通过比色法确定由淀粉产生的还原糖的量。在一定时间内每单位重量样品产生的还原糖量表示酶活性。 ※ 淀粉酶几乎存在于所有植物中，尤其是发芽后谷物种子的淀粉酶活性最强，主要是α-和β-淀粉酶。 α-淀粉酶不耐酸，在pH 3.6以下会迅速失活； β-淀粉酶不耐热，在70°C灭活15分钟。根据它们的特性，当其中一个在测量过程中被停用时，可以测量另一个的生命力。在该实验中，通过加热使β-淀粉酶失活来测量α-淀粉酶的活性，然后通过与在非钝化条件下测得的总活性（α+β）进行比较来确定β-淀粉酶的活性。 二、淀粉酶活性的测定材料，仪器和试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 麦芽糖 6363-53-7 SS1502 2 3,5-二硝基水杨酸 609-99-4 JT16120 3 氢氧化钠 1310-73-2 JT8650 4 酒石酸钾钠 6381-59-5 JT12079 5 柠檬酸 77-92-9 SY0004 6 柠檬酸钠 68-04-2 JSH68496 7 石英砂 14808-60-7 JT0063 8 淀粉酶 9000-92-4 SS2216 （1）材料：发芽的小麦种子（芽长约1cm）。 （2）仪器：1.分光光度计； 2.离心机； 3.恒温水浴（37°C，70°C，100°C）； 4.试管带有塞子刻度； 5.刻度移液器； 6.容
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PEG沉淀实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验简介： PEG沉淀主要是探索一种可大量，廉价且纯度较高地纯化PCR产物的方法，**去除200 bp以下的小DNA片段以进行DNA筛选。 二、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验所需试剂： 96孔PCR板、NaCl、PEG8000、离心管、离心机、EtOH、ddH2O 三、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验步骤 96孔PCR板操作。 1.加入20μLPCR产物5μL5M NaCl（终浓度0.5M）； 2.加入25μL的24％PEG8000溶液（最终浓度为12％）；拌匀 3. 4度放置30分钟； 4. 4500xg，在4度离心30min后，立即将板扣在厚吸收纸上，离心至150xg，除去上清液； 5.加入70μL的75％EtOH，4500xg，在4度下离心15分钟，立即将其快速吸附在厚吸水纸上，离心至150xg，除去上清液；重复一次； 6.在50度或室温下干燥，添加10μLddH2O溶解，这是纯化的PCR产物。站立时以1μL为模板。 四、PCR产物纯化方法--PEG沉淀实验注意事项： 1.该方法可直接用96孔PCR板操作，可大量纯化PCR产物，纯化率更高，可去除300bp以下的PCR产物。但纯化产物会包括不想要的扩增产物、未消耗的引物等，从而引起干扰。 2.用这种方法纯化的成本非常低，PEG8000，NaCl，醇几乎是常规的实验室试剂，比96孔板纯化试剂盒便宜得多，另一个突出的优点是可以除去200bp以下的片段。 3.该方法有点不利于产量的增加，适用于纯化后不需要很多的DNA实验。 五、PEG沉淀实所需试剂清单： 1 1.5ml尖底连盖离心管 F-EP015 2 2ml圆底连盖离心管(灭菌） F-EP020-H 3 96孔无裙边PCR板，透明 F-PCR-96W 4 NaCl JT0001 5 PEG8000溶液(无菌) HC1091
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染色质免疫共沉淀技术（ChIP）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）简介： ※ 染色质免疫沉淀技术（染色质免疫沉淀测试，CHIP）是目前研究体内DNA与蛋白质之间相互作用的唯一方法，其基本原理是将蛋白质-DNA复合物固定在活细胞状态，使其随机截面为一定长度内的染色质小片段，然后通过免疫学方法沉淀该复合物，以富集靶蛋白的结合，通过纯化和检测目标探针，确定的方式通过DNA片段获得有关蛋白质与DNA相互作用的信息。 二、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）所需材料及试剂： 离心管、离心机、甲醛、甘氨酸、PBS、SDS裂解缓冲液 三、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）步骤 （A）将细胞的甲醛交联并超声处理。 1.取出一个平板电池（10厘米平板），添加243 ul 37％甲醛，以使甲醛的终浓度为1％（培养基为9ml）。 2. 37秒10分钟。 3.终止交联：加入甘氨酸至终浓度0.125M。在培养皿中加入450ul 2.5M甘氨酸。混合后，可以在室温下放置5分钟。 4.吸出培养基，并用冰冷的PBS洗涤细胞两次。 5.细胞刮板将细胞收集在15ml离心管中（PBS为5ml，3ml和3ml）。预冷却后，以2000 rpm收集细胞5分钟。 6.倒出上清液。根据细胞数量，添加SDS裂解缓冲液，由于最终细胞浓度为每200ul 2 x 106个细胞，每100ul溶液包含1 x 106个细胞，然后添加蛋白酶抑制剂复合物，假定MCF7杂草丛生的板为5×106个细胞，这次细胞生长到大约80％，即4×106个单元，因此，向每个试管中加入400ul SDS裂解缓冲液。将2管混合在一起，总共800ul。 7.超声波破碎：VCX750，25％功率，冲击4.5S，间隙9S， 14次。 四、染色质免疫共沉淀技术（ChIP）注意事项： 最重要的一点是抗体的性质，不同的抗体和抗原结合能力也不同，在IP反应中可能不使用无染料结合，一定要仔细检查抗体的使用说明书，尤其是多克隆抗体可能是问题所在；其次，注意溶解抗原的缓冲液的性质，大多数抗原是由细胞组成的蛋白质，尤其是骨架蛋白质，必须溶解缓冲液，否则，必须使用含有强表面活性剂的缓冲液，尽管它可能会影响某些抗原和抗体的结
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