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一、RFLP实验简介： 限制性片段长度多态性（RFLP）分析技术是分子生物学中重要的分析方法之一，用于检测DNA序列的多态性。 PCR-RFLP是PCR技术，RFLP分析和电泳方法的结合。首先，通过复制扩增待测目标DNA片段，然后使用限制酶消化扩增产物，最后通过电泳分析目标。 DNA片段是否被切割和分类。 在实验中，使用RFLP分析技术检测NMDA受体GRIN2A亚基基因内含子3中的两个SNP位点rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。 二、RFLP实验方法原理： DNA限制性核酸内切酶具有识别特定DNA序列并在特定位置切割DNA双链的功能。 DNA分子由于突变（核苷酸取代，插入或缺失）酶识别序列而改变（或形成了）限制性内含子，因此DNA限制性内切酶不能（或可以）切割目标DNA片段。进行电泳检测时，具有相应DNA限制酶识别序列的原始DNA片段会变成一个短片段，没有相应的DNA限制。性核酸内切酶识别的序列原始DNA片段的长度不会改变。 三、RFLP实验材料： PCR扩增仪，电泳仪，电泳槽，微波炉，恒温箱或恒温水浴等 限制性酶BstNI，模板DNA，Taq聚合酶，PCR引物（上游引物：5-CTAAGCCTTCCCTTTATCACC-3';丙烯酰胺，酶消化缓冲液，下游引物：5-TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT-3'），电极缓冲液，上样缓冲液等。 序列 产品名 货号 CAS 备注 1 IEF电极缓冲液                                                        HC1773     2 丙烯酰胺                                       LSH54449     3 PAGE连续蛋白上样缓冲液                                                  HC1292       四、RFLP操作步骤： 1. PCR扩增：PCR反应体系为20μl，含模板2μl（约50ng），每个引物1.6μl，dNTP1.6μl（0.4mM），10×缓冲液2μl，Taq酶0.5U，加双蒸水至20.0μl ; PCR反应条件为95℃2min，94℃30sec / 64℃30sec / 72℃30sec（5个循环），94℃30sec / 63℃30sec / 72℃30sec（5个循环），94℃30sec / 60℃30sec / 72℃ 25秒（23个周期），94℃30秒/ 60℃30秒/ 72℃1分钟。 2. PCR扩增产物的检测：取2μlPCR扩增产物，通过1％琼脂糖凝胶潜水电泳检测目标DNA片段的扩增产物。 3.酶消化反应：取约2.0μlPCR产物，加入限制酶BstN I1U，1.0×l 10×酶消化反应缓冲液，用蒸馏水补足至10.0μl，并置于试管中。在37°C的培养箱中孵育4h。 4，消化产物的电泳分型：6％聚丙烯酰胺凝胶电泳（T = 6％，C = 3.3％，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将添加有1/5体积上样缓冲液的消化产物在220 v电压下电泳2至3小时。 5.用银染剂将凝胶剥离到染色板上，用10％冰醋酸固定30分钟，除去固定液，然后用蒸馏水冲洗凝胶3次（2分钟内）。将200ml的0.1％硝酸银溶液倒入染色板，染色30分钟，倒出染色液，并用蒸馏水快速漂洗一次凝胶（在20秒内）。将200ml的着色溶液（3％Na2CO3，含有0.05％甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色板，并保持振荡直至条带清晰。用固定剂停止颜色显影。用蒸馏水洗涤一次，将其粘贴在滤纸上并干燥保存。