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一、TUNEL法检测细胞凋亡实验简介 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。 二、TUNEL法检测细胞凋亡实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、蛋白酶K、苏木素、甲基绿、甘油 三、TUNEL法检测细胞凋亡实验步骤 1.用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min； 3.PBS漂洗2次； 4.用蛋白酶K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min； 5.PBS漂洗2次； 6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。 7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。 8.PBS漂洗3次； 9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm） 10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。 11.PBS漂洗3次； 12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min； 13.PBS漂洗3次； 14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数并拍照。 四、TUNEL法检测细胞凋亡实验所需试剂清单 序号 产品名 货号 CAS 备注 1 PBS缓冲液 HC2031     2 乙醇 JT26000 64-17-5   3 二甲苯 JT24017 1330-20-7   4 苏木精 SX0217 517-28-2   5 甘油 JT26018 56-81-5   6 蛋白酶K HC1354     7 甲基绿 HXH504513 82-94-0