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m6A-MeRIP-seq技术在揭示m6A修饰新功能的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
2021年4月29日日内瓦大学Ramesh S. Pillai、David Homolka研究组合在著名学术期刊《Cell》在线发表了一项新成果，该团队发现剪接位点m6A甲基化通过阻止剪接因子U2AF35与前体mRNA结合进而抑制RNA剪接，结合后续的功能机制研究，揭示了m6A甲基化修饰新的调控机制。接下来，就让我们一起来看下研究人员是如何利用高通量测序技术RNA-seq和m6A-MeRIP-seq揭示m6A甲基化修饰调控RNA剪接这一新功能的。 发表期刊：Cell 发表日期：2021年4月29日 影响因子：41.582 研究方法：：m6A meRIP-seq、RNA-seq、LC-MS/MS等 文章链接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33930289/ 文章概要 6-methyladenosine (m6A) RNA修饰被广泛用于改变mRNA的命运。本文中作者证明了秀丽隐杆线虫的甲基化修饰蛋白METT-10（小鼠METTL16的同源蛋白）沉积在S-腺苷甲硫氨酸(SAM)合成酶前体mRNA的3’剪接位点(AG)上的一个m6A修饰，可抑制其正确剪接和蛋白产生。这种机制是由丰富的饮食触发的，以m6A介导的开关来停止SAM的产生并调节其内稳态。虽然哺乳动物SAM合成酶pre-mRNA不受此机制调控，但3’剪接位点m6A修饰抑制剪切在哺乳动物中是保守的。该修饰通过物理方式阻止必要的剪接因子U2AF35识别3’剪接位点。作者认为使用剪切位点m6A修饰是一种古老的剪接调节机制。 研究思路 研究内容 一、秀丽隐杆线虫的m6A转录组 已知哺乳动物中主要有两类m6A“编写器”:METTL3/METTL14复合物以及METTL16，为了研究 METTL16 催化活性的保守作用，作者选择了秀丽隐杆线虫（以下称为蠕虫）。蠕虫直系同源物 METT-10包含高度保守的 RNA 甲基转移酶域，但缺乏哺乳动物 METTL16 中发现的 VCR域（图 1A）。通过LC-MS/MS技术检测来自成虫的总 RNA 和 poly(A)+ RNA 中的各种核糖和碱基修饰发现，在来自所有三种生物来源的 poly(A)+ RNA 中检测到 m6 A 修饰，包括秀丽隐杆线虫（图 1B）。为了鉴定携带 m6A 甲基化的蠕虫转录本，作者使用来自成年秀丽隐杆线虫的 poly(
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Nrf2蛋白转录因子在诱导机体的抗氧化应答中的重要作用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
外界刺激 (如药物、紫外线和电离辐射) 和内源性自由基和活性氧 (ROS) 会直接或者间接地损伤蛋白质、脂质和 DNA 等细胞成分，为了抵御这些不利影响，机体形成了一套复杂的氧化应激应答系统来缓解细胞所受的损害。而 Nrf2，作为调控抗氧化应激的一种关键转录因子，在诱导机体的抗氧化应答中起着重要作用，如调节氧化还原平衡、药物代谢和排泄、能量代谢、铁代谢、氨基酸代谢、生存、增殖、自噬、蛋白酶体降解、DNA 修复和线粒体生理机能。另外，Keap1-Nrf2 系统已成为癌症和神经退行性疾病以及许多自身免疫和炎性疾病的重要**靶点。 Nrf2 的自我介绍：大家好，我是 Nrf2~我是 Cap'n'collar (CNC) 转录因子家族成员，我的“身体”由七个 Neh 域 (Nrf2 ECH 同源结构域) 组成，每个域具有不同的功能，如 Neh1 CNC-bZIP 域负责与 small Maf (sMAF) 蛋白结合和二聚化；Neh2 结构域通过 DLG 和 ETGE 基序介导与 Keap1 的相互作用；Neh4、Neh5 和 Neh3 域对于 Nrf2 的反式激活非常重要；Neh6 结构域是一个富含丝氨酸的区域，可调节我的稳定性。大家猜猜，我是怎么被激活的呢？ 图 1. Nrf2 及 Keap1 蛋白结构域[2] Nrf2 的激活“大戏” 1、经典途径——Keap1-Nrf2 途径 说到 Nrf2 的经典激活机制，不得不提一提 Nrf2 老搭档——Keap1 (Kelch ECH 相关蛋白 1)。Keap1 是一种 Cullin3 (Cul3) 依赖性的 E3 泛素连接酶复合物的底物衔接蛋白，可与 Cul3 和 Rbx1 组装成功能性 E3 泛素连接酶复合物 (Keap1-Cul3-E3)，进而对 Nrf2 进行调控。Keap1 含有三个功能域，包括一个 BTB 结构域，一个 IVR 和一个 Kelch 或 DGR 结构域。BTB 结构域结合 Cul3，是 Keap1 二聚化所必需的。Kelch/DGR 结构域可与上面提到的 ETGE 和 DLG 基序相互作用，这对于维持 Nrf2 和 Keap1 之间的相互作用至关重要。IVR 连接了 BTB 和 Kelch/DGR 结构域，含有一些可调节 Keap1 的活性的半胱氨酸残基。 在正常的生理条件下，Keap1-Cul3-E3 泛素连
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常见的蛋白质组学技术流程汇编
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
非靶向蛋白质组学 1. iTRAQ/TMT 标记定量蛋白质组学 iTRAQ 和 TMT 技术采用多种同位素标记，可与氨基反应实现连接，实现多个样本蛋白组的定性与定量。 技术流程： 寄样要求： 动物及临床组织标本 100 mg/sample 血清、血浆 200 µL/sample 细胞、微生物 1ｘ107 cells/sample 植物嫩叶、嫩芽 500 mg/sample 植物种子、果实 100 mg/sample 液氮或者 -80℃ 保存 足量干冰运输，避免反复冻融 试剂盒种类： 技术优点： 适用范围广、高通量、结果可靠 灵敏度高 分离能力强 自动化程度高 2. Label Free 非标记定量蛋白质组学 Label Free 技术不依赖同位素标记，可通过液质联用对蛋白质酶解肽段进行分析，分析大规模鉴定蛋白质时所产生的质谱数据，对被检测到的离子峰强度进行积分，以积分面积进行相对定量。 技术流程： 技术优点： 无需标记，最da程度的保留样本的真实性 可以区分“有”、“无”蛋白 不受标签数量的限制，多个样本可以同时进行蛋白定量分析 不同物种和不同的样本类型可以同时开展蛋白定量分析 处理步骤简单，成本低 技术缺点： 低通量 定量准确度有限 对质谱的稳定性和重现性有很高的要求 3. DIA 定量蛋白质组学 数据非依赖性采集(DIA)是一种显著提升蛋白质组学研究通量和可重复性的技术。 经典的 DIA 流程通常依赖于 DDA 谱图库的构建，需要消耗大量的样品，且周期长，成本高。 越来越多的不依赖于 DDA 建库的分析方法相继诞生，例如 DIA-Umpire、PECAN 和 encyclope DIA 等。encyclope DIA 系列技术采用气态在线分离（GPF）。 GPF-DIA 技术流程： 常规 DIA 流程： 技术优点： 采集所有离子及碎片图谱，重现性好 基于碎片离子定量，选择性好，可媲美 SPM/MRM 循环时间固定，扫描点数均匀，定量准确度高 高通量，能同时监测所有目标蛋白 4. 定性鉴定蛋白质组学 利用液相色谱质谱联用技术（LC-MS/MS）结合数据库检索的方法，对样
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基于无人机图像和深度学习鉴定大豆对水涝胁迫的响应
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
Plant Phenomics | 基于无人机图像和深度学习鉴定大豆对水涝胁迫的响应 随着气候的变化，强降水事件愈发频繁。据推算，十年后强降水事件的数量将会较如今增加30%，会有越来越多的耕地面临强降水所带来的洪涝灾害的威胁。水涝胁迫是全球第二大非生物胁迫，指土壤表面被水层覆盖，可分为涝渍胁迫（只有根系处于厌氧条件下）和淹涝胁迫（所有的根系以及全部或部分枝干均被水淹没）。在湿地作物（如水稻等）中经常会出现淹涝现象，而在旱地作物（如大豆和玉米等）中则经常会出现涝渍现象。水涝胁迫会抑制根芽生长、光合作用和养分吸收，导致大豆、水稻、小麦等作物的产量大幅减少，进而带来严重的经济损失。 大豆是一种重要的豆类作物，因其较高的蛋白质和油脂含量而广泛用于食品及饲料、生物质燃料及许多其它产品的生产中。然而，由于人口增长、气候变化、土壤退化和污染等不利因素，可用的耕地面积正逐年减少，也使得大豆的生产力和种子质量在面临来自水涝灾害的威胁时越来越被动。 在水涝灾害的影响下，大豆的稳定生产可通过培育耐水涝品种来保障。在评估田间条件下大豆对水涝的耐受力时，传统做法是目视评估水涝胁迫对枝条造成的损伤等级，目视评估法不仅劳动密集，还容易受到主观误差的影响。 近日，Plant Phenomics 在线发表了题为Qualification of Soybean Responses to Flooding Stress Using UAV-Based Imagery and Deep Learning的研究论文。 随着田间高通量表型技术的发展，高通量表型在测量作物性状和检测作物对生物或非生物性胁迫的响应方面显示出了巨大的潜力。在该文中，研究者使用基于不同飞行高度采集到的无人机图像特征对水涝所引起的大豆损伤进行了评估：航拍图像是在同一天使用五波段多光谱和红外热成像仪分别在20、50和80米高度所拍摄，之后从这三个飞行高度的图像序列中提取了冠层温度、归一化差分植被指数、冠层面积、冠层宽度、冠层长度(Figure 3)等五个图像特征，并基于这些
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高脂高胆固醇高果糖饮食诱导的NASH小鼠模型构建及实验应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
疾病动物模型是研究人类疾病发生发展机制、药物筛选及疗效评价必不可少的工具，好的疾病动物模型可以加快新药的研发速度。你还在为不知道选择什么小鼠模型发愁吗？你还在为造模发愁吗？赛业生物新栏目《每周一鼠》，每周更新，为大家讲解一个疾病小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的疾病小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是高脂高胆固醇高果糖饮食诱导的NASH小鼠模型。 给予动物高脂、高糖饲料喂养建立的脂肪肝模型，其主要发病机制是营养过剩，食物中脂类、胆固醇和（或）糖类过量，无法完全吸收利用，脂类堆积于肝而引发脂肪肝，进一步出现肝炎性改变及纤维化。该模型与人类非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）相似，是最常见的NAFLD动物模型。 赛业生物通过高脂高胆固醇高果糖饲料（GAN）喂养构建的NASH小鼠模型，可作为阐明非酒精性脂肪肝的病理生理机制以及新药的开发的动物模型。 构建策略 使用Gubra-Amylin NASH (GAN) 饲料，即高脂高胆固醇高果糖饲料（40%脂肪供能、20 %果糖和2%胆固醇）喂养小鼠26周以上（一般16周开始出现脂肪变性，26周形成NASH，26~32周诱导出纤维化）。 模型验证 1 体重及血生化检测 图1. 使用GAN高脂高胆固醇高果糖饮食诱导的NASH模型的体重及血生化检测。将野生型C57BL/6雄鼠随机分为2组，每组10只，分别用标准饲料（control组）和高脂、高胆固醇、高果糖饲料（NASH组）喂养，在不同时间点检测各项指标：(A)体重；（B）6h空腹血糖值；（C）血清谷丙转氨酶（ALT）浓度；（D）血清天冬氨酸转氨酶（AST）浓度；（E）血清总胆固醇（TC）浓度。数据以Mean±SEM呈现。使用Two-way ANOVA进行统计学分析。ns: not significant, *: p
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论文解读：散发性孤立性胸主动脉瘤基因突变的全景观
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
胸主动脉瘤（TAA），是由于各种原因造成的胸主动脉一处或多处向外膨出，部分异常扩张、变形，呈瘤样突出。TAA是最危险的疾病之一，早期的TAA多无症状，体征也不明显，同时由于其位于胸腔内，体表查体也较难发现，而TAA一旦发生破裂，死亡率相当之高。TAA是一种高度遗传的疾病，可大致分为以下几类：综合征性TAA (sTAA)、家族型孤立性TAA (iTAA)和散发性iTAA。与综合征性TAA不同，孤立性TAA，尤其是散发性孤立性TAA 的发病率要高得多，但其遗传基础仍是个谜。 近期，首都医科大学附属北京安贞医院杜杰/李玉琳教授团队在Circulation Research上发表了题为Variants of Focal Adhesion Scaffold Genes Cause Thoracic Aortic Aneurysm的研究论文，首次揭示了散发性iTAA基因突变的全景观，提出了一类新的TAA 致病基因，促进了对TAA遗传原因的理解。 获得候选基因 研究人员招募了556名散发性iTAA患者和1092名对照并进行全外显子测序。该策略的有效性通过在选定的可疑功能突变中鉴定出（1）已知的TAA致病基因中的27个致病突变；(2) 10个已知的TAA致病基因；(3) 疑似功能突变的患者临床表型更严重，但疾病危险因素更少，类似于已知致病基因突变的患者。研究人员假设在血管组织中高表达的基因更可能与iTAA相关。通过将表达谱与遗传数据相结合，选择TES作为后续功能验证的候选致病基因。 体内实验验证 研究人员通过TesY249H基因敲入小鼠（赛业生物构建）和Tes敲除小鼠模型在体内证明TES 的功能及其在主动脉瘤发生中的作用。发现TesY249H基因敲入小鼠和Tes敲除小鼠的血管功能异常。纯合的TesY249H基因敲入小鼠发育正常，并且在8个月大时死亡率没有增加。敲入小鼠与敲除小鼠的主动脉直径比WT小鼠大。与WT小鼠相比，敲入小鼠与敲除小鼠的收缩压和舒张压较低。 体外实验验证 研究人员通过从WT和TesY249H基因敲入小鼠主动脉中分离的原代血管平滑肌细胞 (VSMC)进行胶原收缩测定，检测到该突变对VSMC收缩性有影响。如图1所示，突
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胚胎干细胞（ESC）的鉴定方法与常见问题
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
干细胞可分为胚胎干细胞（embryonic stem cell, ESC）和成体干细胞(adult stem cell, ASC)，其中ESC是来源于囊胚内细胞团的全能干细胞，初次发现于1981年，研究人员从小鼠囊胚中成功分离并实现了体外培养。因ASC是在成年动物体内的组织中分离提取，如骨髓、脂肪和脐带等，其在体外分化增殖能力有限，仅能分化为特定某几种类型组织的细胞。 而ESC具有无限的增殖传代能力及分化全能性，可分化为三个胚层来源的各种组织及细胞类型。这种无可比拟的特性让ESC成为很多领域的基础和应用研究的强有力工具，包括发育和调控研究、再生医学、潜在**方法。 那么ESC具有什么形态学特征？它有哪些表面标志物？又该如何鉴定其分化潜能呢？请看以下分解。 01 形态学 相对其他细胞，ESC单个细胞个体小，细胞核大，体外培养时呈集落样或克隆样生长，克隆内细胞排列紧密，细胞集落有明显的边界。此特有的形态学特征常用来做初步鉴定ESC的方法。 例如，Mouse ESC细胞核大，胞核内有多个核仁，核浆比高。在贴壁生长的情况下，Human ESC集落与Mouse ESC不同，呈相对松散、扁平状集落，集落内细胞界限隐约可见。 Mouse ESC 40x 02 特异性转录因子/抗原表达 ESC鉴定也有独有的表面标志物，目前常用的检测标志物是特异性转录因子OCT-4、Nanog及阶段特异性胚胎表面抗原SSEA。 OCT-4是一个和胚胎发育全能性相关的转录因子，几乎所有的ESC都表达OCT-4，当ESC被诱导向成体细胞分化时，OCT-4的表达逐渐下降。 Nanog是一种有同源结构域的转录因子，可以维持ESC的自我更新，以及调节ESC的细胞周期。与OCT-4相似，当ESC分裂旺盛时，Nanog高表达，随着ESC分化程度的提高而Nanog表达量逐渐下调。 SSEA是一种糖酯蛋白，用来鉴定ESC的SSEA通常有三种，分别是：SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4，它的表达具有种属间特异性。如通过免疫荧光检测，可发现Human ESC和Mouse ESC具有不同的SSEA表达。 Human ESC的鉴定 高表达OCT-4、Nanog、SSEA
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外泌体的介绍和检测提取机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
近几年，外泌体越来越多的被提起，CNS 里常常有它，自然基金课题总有它，Pubmed 里的文章数量呈现暴风增长，涉及癌症、免疫、病毒感染、心血管疾病及神经退行性疾病的全方位研究，甚至还有美容相关研究 。 想当初，外泌体刚被发现的时候，还被贴上了“代谢废物”的标签，如今却摇身一变成了科研宠儿！妥妥的拿着“废柴逆天”主角剧本。 外泌体 (Exosome) 是什么？ 所有原核和真核细胞在生理正常或异常时，均可通过出芽的方式释放各种各样的膜包裹的囊泡 (Extracellular vesicles, EVs) 到胞外环境中，如外泌体、微囊泡、凋亡小体。胞外囊泡可广泛的分为两类，核外颗粒体 (Ectosome) 和外泌体。核外颗粒体是从质膜脱离的外出芽小泡，包括直径在 ~50 nm-1 μm 的微泡、微粒和大囊泡。 外泌体是细胞核内体途径起源的、直径在 ~40-160 nm (平均 100 nm) 的囊泡。外泌体的产生涉及到一个独特的细胞内调节过程，这可能决定了它们的组成，从而决定了它们的功能。 图 1. 外泌体结构和内容物 外泌体的产生和分泌 外泌体的产生涉及质膜的双重内陷、和含有腔内小泡 (Intraluminal vesicles, ILVs)、细胞内多囊泡体 (Multivesicular bodies, MVBs) 的形成。ILVs 通过 MVBs 与质膜的融合和胞吐，最终以外泌体的形式分泌到胞外。 质膜的第一次内陷形成一个杯状结构，其中包含细胞表面的蛋白与胞外一些可溶性蛋白，这个过程形成了早期内涵体 (Early-sorting endosome, ESE)。ESEs 可发展为成熟的晚期内涵体 (Late-sorting endosomes, LSEs)，并最终生成 MVBs。MVBs 是通过质膜双凹形成的，这一过程导致 MVBs 含有多个 ILVs (未来的外泌体)。MVBs 可以与溶酶体或自噬体融合被降解，或与质膜融合以释放所含的 ILVs 为外泌体。 图 2. 外泌体的生成、分泌和分类 外泌体的起源和形成方式导致其内容物、形状、大小均有差异，从而会影响受体细胞的不同功能，这种特性被称为外泌体的异质性。外泌体可通过其
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阿尔茨海默病的发病机制和抑制剂介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
什么是阿尔茨海默病 (Alzheimer Disease, AD)？ 1907 年德国神经病理学家阿尔茨海默 (Alois Alzheimer) 仔细描述了一名具有进行性痴呆表现的 51 岁妇女 (Auguste Deter) 的症状： “她的记忆力严重受损。如果向她显示了对象，她会正确地命名它们，但随后几乎立即她忘记了一切。在阅读测试时，她会逐行跳过或通过单独拼写单词或通过发音使其变得毫无意义来进行阅读。在写作中，她多次重复单独的音节，省略了其他音节并迅速将其完全分解。在发言中，她使用填空和一些释义的表达方式 (“牛奶倒”而不是杯子)；有时候很明显她无法继续。显然，她不理解某些问题。她不记得某些物品的使用。” ——Alois Alzheimer 图 1. Alois Alzheimer (左) 和他的病人 Auguste Deter (右) 的照片 Deter 死后，Alzheimer 使用当时新的银染组织学技术从显微镜下检查了她的大脑，观察到了神经斑，神经原纤维缠结和淀粉样血管病的症状。1910 年这种病被命名为阿尔茨海默病 (AD)。 图 2. AD 的典型神经病理学特征包括老年 (Aβ) 斑块 (红棕色) 和神经原纤维 (Tau) 缠结 (黑色) AD 是一种神经退行性疾病 (可参见：忘不了餐厅，忘了一切却忘不了爱丨神经退行性疾病——比癌症更残忍)，与特定大脑区域的神经元萎缩和死亡相关，是痴呆症的主要形式 (50-75%)。发病初期表现出程度较小的记忆力丧失，后期发展为严重的认知功能障碍，包括行为障碍，运动困难，语言问题，严重的记忆力丧失，妄想症等。目前临床上药物**仅能改善认知症状和延缓病情进展，不能逆转病程。 阿尔茨海默病的发病形式 AD 一般以两种形式发生，一种是由遗传决定的早发形式，另一种是非遗传的晚发形式。 1、家族性 AD 家族性 AD 是一种常染色体显性遗传疾病，编码淀粉样肽前体蛋白 (APP)、早老素 1 (PSEN1) 和早老素 2 (PSEN2) 的基因突变会导致家族性 AD。其中，PSEN1 基因突变是大多数家族性疾病的原因。家族性 AD 患者的发病年龄小于
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Sirt3基因敲除小鼠与非酒精性脂肪肝的简介与技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是在非酒精性脂肪肝的发病过程中发挥重要作用的Sirt3基因。 Sirt3基因简介 SIRT3基因，中文名为去乙酰化酶3，属于Sirtuins家族，Sirtuins是进化上保守的NAD+依赖性脱乙酰酶家族，具有调控细胞增殖、DNA修复、线粒体能量稳态和抗氧化活性等多种生理功能。哺乳动物Sirtuins家族共有7个成员（包括SIRT1-7），近期研究发现SIRT3在心血管和代谢疾病中发挥着重要作用。在分子机制层面上，SIRT3作为一种脱乙酰酶，主要定位在线粒体上，因此能够调节大部分线粒体蛋白的赖氨酸乙酰化，它的激活是细胞调整能量代谢的一个重要传感器，可调节线粒体ATP生成和对压力的适应性反应。SIRT3基因位于人类11号染色体上，基因全长约21.9kb，共有10个外显子，氨基酸数量为187个，由核编码后形成一个包含N端线粒体靶向序列的无酶活蛋白，该序列导入线粒体后被切断，留下一个酶活性的28kda的蛋白。近期研究表明，该基因调控线粒体的功能，与非酒精性脂肪性肝病（NAFLD)密切相关。 表1. SIRT3的基本信息 备注：标有√的意为赛业红鼠资源库有该种保存状态的小鼠 非酒精性脂肪性肝病（NAFLD） 非酒精性脂肪性肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除外源酒精和其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，与胰岛素抵抗和遗传易感性密切相关的获得性代谢应激性肝损伤。NAFLD是一个总称，包括一系列肝脏疾病，包括肝脂肪变性（NAFL）、单纯性脂肪肝（SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）及其相关肝硬化，是肥胖和代谢综合征的一种肝脏表现。 图1. 来自NAFLD患者肝脏
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Red基因编辑重组技术简介
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
一、技术简介 Red基因重组技术，能使外源同源线性DNA片段快速与基因组DNA相应基因同源重组，主要包括pKD46、pKD3、pCP20三个协助质粒。pKD46质粒由exo、beta、gam三个基因组成，它们分别编码Exo、Beta、Gam三种蛋白质，在一定浓度阿拉伯糖诱导下或诱导表达此三种蛋白。通过外源构建同源线性片段，导入受体菌，在这三种蛋白的协助下与受体菌基因发生同源重组，最终实现基因的突变和缺失。同时pKD46质粒是温度敏感型质粒，42°C条件下其会自动丢失。pKD3为克隆氯霉素抗性基因提供模板,与此同时在此质粒中，Cm两侧有FRT位点，该位点能够被FLP重组酶识别，当重组酶存在时会将此位点之，间的片段进行剪接，从而实现了Cm'去除，因此不仅为实验进行引入抗性标记，方便了重组菌的筛选，更重要的是此抗性标记会在因FRT位点的引入在需要时被酶切剔除。pCP20能够表达FLP重组酶，进而识别重组到基因组上的FRT位点，由此酶切掉两位点之间引入的抗性基因片段片段，最终实现目的基因的缺失。pCP20同为温敏型质粒，培养条件高于42°C时自动丢失。 与Red同源重组基因敲除相关的3个酶： 1、Exo蛋白：Exo蛋白是一种核酸外切酶，单亚基的分子量为24 kD，Exo蛋白的活性形式是一种环状三聚物分子，中间有一中空的通道，通道的一端可容纳双链DNA分子，另一端只可容纳单链DNA。Exo蛋白可结合在双链DNA的末端，从DNA双链的5’端向3’端降解DNA，使DNA分子形成3’粘性末端。 2、Beta蛋白：Beta蛋白在Red同源重组中起着决定性作用，具有介导互补单链DNA退火的功能，是一种退火蛋白，单亚基的分子量为25.8 kD。在溶液中，Beta蛋白自发地形成环状结构，紧紧地结合在单链DNA的3’突出端，防止DNA被单链核酸酶降解，并介导互补单链DNA的退火。双链DNA退火完成后，Beta蛋白从DNA双链上解离下来。 3、Gam蛋白：Gam蛋白为16kD的多肽分子，可与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其对外源DNA的降解作用，防止外源DNA 进入细胞后被宿主降解。 二、实验步骤 1、制备pKD46
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氨基酸高通量靶标定量介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
氨基酸（Amino acids）及其衍生物是在分子中既含有氨基同时又含有羧基的一类化合物。在生物体内以游离或结合状态出现。游离氨基酸分布于一切动物细胞及体液内，而结合氨基酸主要是蛋白质及肽类的基本组成成分。 构成人体及其蛋白质的氨基酸的种类有20种，大致可以分为三类：必需氨基酸、半必需氨基酸和非必需氨基酸。不同类型疾病患者体内氨基酸的平衡状态与健康个体体内维持的状态通常不同。总体来说，人体的20%是由氨基酸和他们的代谢物构成，在许多代谢通路中作为底物和调控因子起着重要的作用。肝硬化、肺癌、乳腺癌、食管癌、头颈部肿瘤等病人血浆中氨基酸浓度与健康人血浆中氨基酸浓度相比表现出异常，因此对氨基酸代谢变化的分析可以用来诊断疾病，另外氨基酸是构成蛋白质大分子的基础物质，与生命活动息息相关，氨基酸也参与能量代谢；某些氨基酸在神经生物学及自闭症**中也有显著作用且与很多代谢性疾病密切相关。总之，氨基酸分析在生物化学、食品科学、临床医学、饲料科学、化工等领域具有重要作用。 氨基酸检测列表 注：内标法定量，共可检测25种氨基酸物质 1.技术优势 用同位素内标验证，提高物质定性定量准确性； 采用严格的质量控制体系来保证数据的可靠性。 2.技术路线 3.技术参数 样本要求： 植物组织：1 g/sample 动物及临床组织标本：200 mg/sample 血清、血浆：200 μL/sample 微生物、细胞：1×107 cells/sample 粪便、肠道内容物：200 mg/sample 检测平台： Agilent 1290-6460 MS 4.应用方向 代谢性疾病（糖尿病、肥胖症、心血管疾病）的早期诊断及预测疾病发展的研究； 在生物化学、食品科学、临床医学、饲料科学、化工等领域的研究。 5.案例分析 主动脉夹层分离（AD）是一种具有高死亡率的心血管疾病，且缺少特定的临床生物标志物。为了便于诊断AD，我们通过代谢组学的方法对血浆中氨基
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点突变简介及其对表型变化的影响
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
基因点突变指只有一个碱基对发生改变。基因点突变是基因突变的一种类型，是生物进化的动力来源之一，具有随机性、低频性和可逆性等特点。基因点突变所产生的基因组SNP变异是人类疾病发生、生理生化表型差异的内在原因之一。迄今，已有众多的研究表明，点突变能使人类对癌症、听力疾病、精神病等多种疾病的易感性增加。因而了解点突变作用机制对疾病**与预防具有重要意义。 基因点突变可以发生在基因组任意位置上，能对蛋白质的生物学功能、基因的网络调控机制等产生影响。今天我们就看一看在基因组上不同区域发生的点突变是如何影响基因的功能和产生突变表型的。 在功能蛋白的编码区发生的点突变 点突变发生在功能蛋白的基因编码区中，这是我们所熟知的一种点突变的情况，能对多肽链中氨基酸序列产生影响。一般包括同义突变、错义突变、无义突变和终止密码突变。 1. 同义突变： 当碱基置换后，变换成另一个密码子。由于mRNA翻译的过程中存在简并密码子，因而突变前、后密码子所编码的氨基酸不变，故实际上不会发生突变效应。例如DNA链中的“AGT”的第三位碱基“T”突变为“C”，则mRNA的密码子由“TCA”变为“TCG”。由于“TCA”和“TCG”都是编码丝氨酸的密码子，所以突变前后的蛋白质相同。 2. 错义突变： 碱基对的置换使mRNA的某一个密码子变成编码另一种氨基酸的密码子的突变称为错义突变。错义突变可导致机体内某种蛋白质或酶在结构发生改变，降低蛋白质的活性，甚至完全丧失功能。如较为熟悉的镰刀型红细胞贫血，其病因就是由于基因点突变所造成的。正常血红蛋白β链的第六位是谷氨酸，其密码子为GAA或GAG，如果第二个碱基A被U替代，就变成GUA或GUG，谷氨酸则被缬氨酸所替代，形成异常的血红蛋白S而发病。 3. 无义突变： 由于点突变使原先编码氨基酸的密码子变为终止密码子，使得多肽链合成提前终止，产生没有生物活性的多肽链。从而影响了原蛋白的生物学功能。 4. 终止密码突变： 基因中一个终止密码突变为编码某个氨基酸的
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LYTAC 与靶向蛋白降解技术介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
靶向蛋白降解 (TPD) 是一种有效性的，高度选择性的诱发蛋白降解方式。近年来，以 PROTAC 为代表的 TPD 技术的研究如火如荼。PROTAC 主要降解的是胞内蛋白，实际上，有 40% 的基因产物为胞外和膜相关蛋白，如生长因子、细胞因子和趋化因子，它们在多种疾病 (如癌症和炎症) 中引发异常信号传导。那么，有没有一种诱导胞外蛋白降解的技术来弥补 PROTAC 的这一局限呢？ M 君叨叨：PROTAC 是通过「清洁工」——泛素-蛋白酶体系统 (UPS) 来降解目标蛋白 (POI)，而此途径是胞内蛋白降解的主要途径，因此 PROTAC 主要降解胞内蛋白。泛素-蛋白酶体系统和自噬-溶酶体途径：是目前最主要的两条降解途径。这两条降解途径之间相互联系，具有协同和补偿作用。 溶酶体靶向嵌合体 (LYTAC) 近日，来自斯坦福大学 Bertozzi 教授的研究团队在 Nature 上报道了一项靶向胞外蛋白的降解技术——溶酶体靶向嵌合体 (LYTAC)。并且证明 LYTAC 成功降解了表皮生长因子受体 (EGFR)、程序性死亡配体 1 (PD-L1) 和载脂蛋白 E4。斯坦福大学的研究人员还表明，在细胞中，LYTAC 可以靶向并降解阿尔茨海默症和癌症中的重要蛋白。继 PROTAC 之后，LYTAC 可能会成为另一个“爆款”。 图 1. LYTAC 作用机制[3] LYTAC 含有两个结合域，一个寡糖肽基团 (Oligoglycopeptide group) 和一个能与目标蛋白质结合的抗体或小分子，两者用 Linker 连接。寡糖肽基团在细胞表面与跨膜受体 CI-M6PR 结合，所得复合物被细胞膜吞没，形成运输囊泡，并在 CI-M6PR 作用下将复合物转移至溶酶体降解，而受体 CI-M6PR 可循环利用并回到细胞膜 (如图 1)。例如通过使用抗 EGFR 单克隆抗体 Cetuximab 与 CI-M6PR 配体 M6Pn 糖多肽缀合构建 LYTAC Ab-2 来降解 EGFR。 另外，在去年六月份，PROTAC 先驱、耶鲁大学的 Crews 小组在 ACS Central Science 杂志上发表了另一项胞外蛋白降解技术——内源性嵌合体 (ENDTAC)。但该文章由于无法重现数据，已经于今年年初撤回。 不论是 LYTAC 还是
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牛奶中酪蛋白和乳清蛋白含量的测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
人类进化把牛奶带到我们的餐桌上信不信由你，自人类能在地球上行走的15万年里，成年人是不能喝牛奶。即使在一万年前，在地球上任何的地方如果成年人喝牛奶，他们都会产生疼痛和抽筋的身体极端反应，然后发生了一些事情。 基因突变的出现使身体持续产生乳糖酶直至到成年，这似乎是一个明显的进化优势，尽管科学家不清楚具体原因。它很可能与动物驯化有关，人类开始吃发酵乳制品，或者是应为生牛奶营养丰富、热量密集的原因，不管怎样，自那以后牛奶和奶制品一直是人类饮食的核心部分，牛奶能提供蛋白质和大量必需的氨基酸，这是必不可少的身体细胞结构（如肌肉，器官，皮肤，激素，酶）。 牛奶和奶制品 如今食品工业以多种方式加工牛奶和生产许多不同的产品，除了酸奶和牛奶，牛奶也用于生产奶酪和烘焙产品以及冰淇淋的生产。牛奶蛋白质仍然是所有这些产品中跟踪的最重要的成分之一，蛋白质含量在牛奶的交付和奶牛繁殖的价值确定方面也起着重要作用。 凯氏定氮测量方法 牛奶中的总蛋白质是使用凯氏方法确定的，通过使用凯氏消化和蒸馏法完成，该方法确定样品中的所有氮含量，然后用特定因子换算获取蛋白质含量。Kjeldahl方法是确定牛奶中总蛋白质的一种高效和快速的方法。 然而，由于它基于牛奶中所有的氮，它并不总是给出精确的价值，它不能识别其他氮化合物的掺假，因此有时使用特定仪器检测掺假，如三聚氰胺，有时需使用光谱/色谱仪和 Kjeldahl 仪器的组合。使用同一台 Kjeldahl定氮仪设备来确定非蛋白氮化合物 （NPN） 也是一个很好的解决方案，确定总蛋白质和NPN可以更好地分析样品，但在实验室需要花费更多的时间和工作。 酪蛋白 vs. 乳清蛋白 Kjeldahl仪器还可用于分析牛奶和区分酪蛋白和乳清蛋白，这两种蛋白质都存在于牛奶中。酪蛋白和乳清蛋白之间的显著区别之一是身体吸收它们的速度有快慢。酪蛋白为身体提供缓慢、稳定的氨基酸释放，使其在禁食（如睡眠）之前成为理想之选。另一方面，你的身体消化和
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