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血清的使用方法及问题解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
血清是细胞培养中唯一外源添加的成分不确定的物质，血清的质量对实验成败起着关键性作用，但血清使用不当也可能会导致血清质量下降，造成细胞培养效果不理想。今天小编来给大家聊聊血清使用中的一些疑惑，帮助大家理清头绪，实验开展顺顺利利。 怎样确定血清使用浓度？ 这个只能通过测试了。原则上血清添加量不要太多，通常分为5%、10%、20%几档。部分细胞原代提取时会使用20%血清，大部分细胞正常培养时会使用5%～10%的血清浓度。至于某一株细胞适应什么样的血清浓度，还需要根据细胞特性、实验目的做测试和调校。 血清使用前需要离心吗？ 这个问题我理解为两种可能。 其一，因为血清融解后有“絮状物”析出。如果没有出现其他异常情况，或者血清只是用于细胞培养，那么完全没有必要离心去除。我们知道血清析出的“絮状物”主要是血纤蛋白，其在血清中含量很高，而且高度不溶，在血清冻融过程中极易析出，但它也是完全无害的，甚至能促进细胞生长。另外，它还增强了血清黏性，为细胞提供了额外的机械缓冲。在其析出过程中，会粘附培养体系中其他成分，离心去除，反而会损失营养成分。 其二，实验要求纯净的培养体系。培养的细胞需要进一步鉴定，如免疫荧光、流式、共聚焦拍照等，细胞表面如果有黏性较强的血纤蛋白，势必会影响效果。那么，建议400g离心5min即可。如果需要进行精密实验，如分离外泌体等，那么就需要至少100000g离心1.5h以上 血清灭活和不灭活有什么不一样？ 在回答这个问题之前，我们先要弄清楚灭活究竟灭的是什么成分的活性。其实56℃、30min的处理只能去除补体和部分其他蛋白的活性。补体是免疫系统的一部分，在体内可通过多条途径被激活，从而发挥调理吞噬、裂解细胞、介导炎症、免疫调节和清除免疫复合物等多种作用。血清灭活的说法最早是在细胞培养技术发展初期，大部分实验室还在使用小牛血清甚至成体动物血清，或者以前培养某些人源细胞时会添加人血清。因为血清供体已与环境长期接触，体内免疫系
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常见细胞污染类型与解决处理方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
最近，赛业OriCell细胞交流群有很多同学在咨询细胞污染问题。提及细胞污染，还真是让每个培养细胞的新手老手唯恐避之不及呀。 害，细胞污染轻则实验结果出不来，重则祸及他人（实验室），前期投入的人力、物力、精力、财力和长期的坚守付诸东流。 常见的细胞污染类型 被细胞污染眷顾的科研emoer，看着一堆看不出来被什么污染的细胞，momo地流下了e滴眼泪...... 细胞污染类型多样，我们盘点了常见的细胞污染类型，如下图： 细胞污染最直观的方式是观察形态，当培养体系出现细菌污染时，会出现培养基变浑浊，有异味，镜下观察有明显自由行动的颗粒或念珠状菌落。真菌通常倾向于聚集生长，在培养体系内形成“毛茸茸”的菌落，或丝状菌体，但一般不出现培养基变酸等现象。至于支原体污染，大部分没有任何异常情况，培养体系、细胞生长都正常，往往容易被实验员忽视，但若不及时处理，容易造成交叉污染，因此建议各实验室定期对细胞做支原体检查。 至于黑胶虫，目前关于它的本质还说法不一，根据《生物化学与生物物理进展》杂志（PIBB）2020年1期发表的《细胞培养中“黑胶虫”污染的检测及防治》文章，文中指出黑胶虫污染具有5个特征：①细胞状态差、②低倍下呈黑色点状、③高倍下做布朗运动、④培养基不浑浊、⑤与细胞数量成反比。为什么会出现黑胶虫？该怎么处理？这里留个悬念，后期再做深入介绍。 了解细胞污染的来源，可以帮助减少细胞污染发生的频率和后果的严重性。 OriCell专家的小建议 细胞培养的常规操作包括换液、传代、冻存和复苏，只要多多注意细节，提高自己的无菌意识和操作技术，掌握正确处理污染的方法，其实细胞污染是完全可以避免的，也没那么可怕。对此，OriCell专家整理了细胞污染的处理方法和预防攻略，希望大家能学以致用。 污染的处理 1. 做好与正常细胞的隔离。 2. 用大量含高浓度双抗的培养基、缓冲液冲洗。 3. 联用多种支原体清除剂。 4. 定时复检。 细胞污染后**的处理方式是丢弃，除
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细胞冻存原理与常见方法的简单介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
人类遐想通过冷冻保存，实现在未来复活。在科幻小说《三体》中，描述了人类可以在冬眠中度过几个世纪，醒来之时依然保持着冬眠时的生命体征和生理年龄。漫威电影里的美国队长冰封70年后再次苏醒，拯救世界。 看似神秘的冷冻保存技术，对于做细胞培养的小伙伴而言是一点也不陌生，细胞冻存可是人人不能免考的必修课呀。 01 细胞冻存的原理 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一，也是保持细胞活性和增殖能力的重要手段。细胞可以通过被暂时休眠（冻存），仿佛童话里的睡美人，留住年轻芳华，等到需要时再被轻轻唤醒（复苏）。 低温下，活细胞中的生物和化学反应都会大大降低，为细胞长期冻存提供了可能。冷冻对大多数活生物体都是致命的，细胞冻存是利用冷冻保护剂来降低冰点，缓慢冻结细胞的过程中，细胞内水分透出细胞，使细胞冻结中冰晶形成减少，从而避免了由于冰晶形成对细胞中生命活性物质的一系列损伤。【1】细胞冻存时利用低温降低细胞代谢，使细胞处于停止生长的“休眠”状态，等需要使用的时候再进行复苏操作。 细胞储存在-70℃冰箱中，可以保存一年；若储存在-196℃的液氮环境中，理论上可以实现长期永存。 02 细胞冻存的常见方法 细胞冻存和复苏的关键要点是慢冻快融。细胞冻存的效果主要与降温步骤、冻存保护液的使用、冻存温度、复温速率及用于冻存的细胞生长状态有关。【2】降温速率过快容易引起细胞内冰晶损伤，所以为防止细胞内结冰必须采用一个“慢”的降温过程，并使用冻存保护剂，即冻存液。目前细胞冻存多采用甘油或二甲基亚砜（DMSO）作保护剂。 根据降温速度区分，细胞冻存可以分为程序降温冻存与非程序降温冻存。传统的冻存方法是将冷冻管置于4℃ 30分钟、-20℃ 30分钟、-80℃过夜再转液氮。这种冻存方法步骤多，而且需要遵守几个时间点，容易被遗忘，对于繁忙的实验人员而言不那么友好。而程序降温方法，采用降温速率-1℃～-2℃/min；当温度达-25℃以下时，可增至-5℃～-10℃/min，再放至-196℃液氮保存。
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血清中产生沉淀的物质和作用及避免的有效操作
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
怎么样才能避免血清中产生沉淀呢？首先我们需要了解下什么是血清以及血清的主要作用指血液凝固后，在血浆中除去纤维蛋白原分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋原白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞的起到某些保护作用。 主要作用： 1、提供基本营养物质：氨基酸、维生素、无机物、脂类物质、核酸衍生物等，是细胞生长必须的物质。 2、提供激素和各种生长因子：胰岛素、肾上腺皮质激素（地塞米松）、类固醇激素（雌二醇、睾酮、孕酮）等。生长因子如成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、血小板生长因子等。 3、提供结合蛋白：结合蛋白作用是携带重要的低分子量物质，如白蛋白携带维生素、脂肪、以及激素等，转铁蛋白携带铁。结合蛋白在细胞代谢过程中起重要作用。 4、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。 5、对培养中的细胞起到某些保护作用：有一些细胞，如内皮细胞、骨髓样细胞可以释放蛋白酶，血清中含有抗蛋白酶成分，起到中和作用。这种作用是偶然发现的，则有目的的使用血清来终止胰蛋白酶的消化作用。因为胰蛋白酶已经被广泛用于贴壁细胞的消化传代。血清蛋白形成了血清的粘度，可以保护细胞免受机械损伤，特别是在悬浮培养搅拌时，粘度起到重要作用。血清还含有一些微量元素和离子，他们在代谢解毒中起重要作用，如SeO3,硒等 以下操作可以有效避免沉淀的产生： 1)、 血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，如果不是必要可以跳过此步骤。 2)、 如果必须做血清的热灭活，一定要记住56℃30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。如果温度过高，时间过久或摇晃不均匀都会导致沉淀物的增多。 3)、在解冻血清时随时准备摇晃均匀，使温度及成分均一，这样可以有效减少沉淀的发生。 4)、 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一。 5)、 勿直接由-20℃直接至37℃解冻，因
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NOD2基因敲除小鼠与炎性肠道疾病的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是炎性肠道疾病及其易感基因NOD2。 NOD2基因简介 NOD2 （Nucleotide-binding oligomerization domain 2）也被称为NLRC2，属于NLR家族，是革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌的肽聚糖（PGN）衍生的细胞内模式识别受体（PRRs）。NOD2由多种细胞类型表达，包括造血细胞（如T细胞、B细胞、巨噬细胞、树突状细胞和肥大细胞）和非造血细胞（如潘氏细胞、干细胞、杯状细胞和肠细胞），在胞浆中处于一种抑制的单体状态，配体识别时激活其构象发生变化，进而招募丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶2（RIPK2）激活IKK复合物和MAPK途径，调控NF-kB信号通路，刺激肠道炎症的发生。该基因位于人类的16号染色体上，共有18个外显子，氨基酸数量为818个。 表1. NOD2的基本信息 备注：标有√的意为赛业红鼠资源库有该种保存状态的小鼠 炎性肠道疾病 炎性肠道疾病（inflammatory bowel disease, IBD）是一组病因不明的慢性肠道炎症性疾病，通常包括两个相对独立的疾病：溃疡性结肠炎（ulcerative colitis, UC）和克罗恩病（Crohn's disease, CD）。IBD易感基因定位于几个染色体区域，位于第l6条染色体长臂的IBD1区域被认为与CD相关。CD可能由遗传易感性、环境因素和肠道微生物群改变等之间复杂相互作用引起，会导致先天性和适应性免疫反应失调，其发病率在世界范围内呈上升趋势。自2001年发现NOD2与CD相关后，其在先天性和适应性免疫应答中的作用越来越受到关注。NOD2的3个单核苷酸多态性（SNPs） （表2）被证实与白种人患CD显著相关，在人类社会中存在重要种族差异，其后的蛋白功能研究进一步证实了它是CD的易感基因[1]。
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细胞培养生物反应器放大效果不理想的原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
随着转基因制药技术的不断发展，细胞培养放大的规模化需求也在逐渐增大，通常在实验室进行的小批量细胞传代实验由于投入成本小，操作过程熟练，基本不会存在太大问题，当进入生物反应器规模化培养阶段时，投入的成本往往较大，需要考虑的因素也变多，稍不注意就会影响到细胞的产量或质量。 其实细胞的培养放大不论是处在哪个阶段的放大都需要保持在同一恒定的环境下进行，这样才能培养出生长密度、细胞存活率、以及培养产物等维持相对稳定的状态。所以在进入生物反应器扩培阶段时，需要注意到以下几点： 一、搅拌桨类型、搅拌转速及剪切力 通常使用的搅拌式生物反应器，可以使细胞与营养物质充分混合、悬浮具有较高的通气溶氧环境，但是搅拌桨类型以及过快的搅拌转速带来了较高的剪切力，由于细胞不同于微生物，构成细胞的细胞质较为脆弱，对剪切力比较敏感，通常情况下，细胞培养适宜的叶端速为 1-2m/s。所以选择合适的搅拌桨类型及合适的转速控制也是很有必要的。某些微载体培养生物反应器在设计时采用提升式搅拌桨在保证混合效果的同时也有效降低了细胞剪切力，对于DISKS载体来说，这种搅拌桨的设计几乎不会因剪切力和通气气泡对细胞造成任何不良影响。 搅拌速率计算公式如下： 叶端速计算公式如下 二、通气量、溶氧度、PH/DO、氧传递速率的参数控制 细胞放大培养过程中，溶氧度参数、CO2浓度、以及通气量的大小等重要参数都会直接影响到细胞的生长状态，比如随着CO2浓度的增加，PH值也会相应增大从而影响到培养环境的改变不利于细胞生长；所以溶氧度及二氧化碳浓度的控制需要及时准确。比如我们常见的搏旅系列微载体培养生物反应器就是采用了热质流控制仪全面实现了气体流量的全自动控制；并且采用PID控制系统准确控制溶氧度、CO2浓度等，从而及时平衡PH参数，在通气设计上深层通气采用软、硬件相结合的控制方式有效消除了培养基的逆流，并采用了独立的灭菌系统，保证灭菌的彻底性。 三、灭菌
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三种间充质干细胞鉴定方法的介绍与比较
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
间充质干细胞（MSC）是属于中胚层的一类多能干细胞，最初在骨髓中被发现，自此进入科研学者的视线。MSC来源丰富，可从骨髓、脂肪、牙髓、胎盘、脐带、肝等许多组织中提取获得，经过连续多代的培养，仍然能保持高度的增殖和分化潜能，而且免疫原性比较低，基本不存在免疫排斥反应，临床使用中不需要配型。因具有许多得天独厚的优势，MSC现已成为干细胞研究领域中的人气明星。 但是，你知道什么样的细胞才是MSC吗？又该如何为MSC鉴定身份呢？其实，我们可以通过形态学鉴定，表面标志物鉴定和多向分化潜能鉴定这三种方法来为MSC验明正身。 01 形态学鉴定 MSC多数呈纤维细胞样生长，在支持物表面呈梭形或不规则三角形，细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出长短不同的突起。传代后细胞呈均质、旋涡状排列。几乎所有的MSC都是贴壁生长，具有较强的贴壁能力。 02 表面标志物鉴定 MSC的细胞表面标志物鉴定常采用流式细胞仪来进行。MSC属混杂细胞群，其表面抗原也具有非专一性, 它可同时表达间质细胞、内皮细胞和表皮细胞的表面标志，如粘附因子、生长因子和细胞因子受体以及整合素家族等。 MSC的细胞表面标志物鉴定标准为： ① CD105、CD73和CD90阳性率≥90%； ② CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79α或CD19、HLA-DR呈阴性，阳性率≤5%。 不同组织来源的MSC可共享相同的细胞表面标记，如CD29和CD44。 03 多向分化潜能鉴定 MSC具有在体外分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞等定向分化的能力，所以鉴定MSC的多向分化潜能也是重要的鉴定方法之一。MSC成骨诱导分化最常用的染色方法是茜素红染色法，成脂诱导分化最常用的染色方法是油红O染色法，而成软骨诱导分化最常用的方法是阿利辛蓝染色、悬浮培养。 以上就是MSC三种常用鉴定方法，你都学会了吗？
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hBMSC-CM间充质干细胞的条件培养基在促进腱-骨愈合上的积极作用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
复旦大学附属华山医院运动医学科陈世益教授领导的研究团队近日在生物材料领域顶尖期刊《Biomaterials》（IF = 10.317）上发表文章，证明了一种间充质干细胞的条件培养基在促进腱-骨愈合上具有积极作用。 肩袖撕裂是一种常见的运动损伤，威胁着专业运动员及广大运动爱好者的健康。医生大多采用肩袖修复术将撕裂的肌腱重新固定在骨表面。大多数患者能够获得良好的效果，但有些患者会发生再次撕裂。出现这种现象的原因是止点（enthesis）无法快速再生腱-骨界面的结构。止点是肌腱或韧带附着于骨头的部位。 基于再生医学的干细胞**有望为肩袖损伤提供新的**手段。人们已采用不同来源的间充质干细胞（MSC）来促进腱-骨愈合，并在实验中获得了成功。然而，引入外源性材料也存在风险。植入的干细胞可能具有致瘤性，这限制了临床应用。近期的研究发现，真正有效的是干细胞的分泌组（secretome），而间充质干细胞的条件培养基包含了干细胞分泌的所有营养因子。 基于此，研究人员收集了人类骨髓来源干细胞的条件培养基（hBMSC-CM），并检测了这种无细胞方法是否能够在大鼠肩袖修复模型中促进腱-骨愈合。为了确保培养基在腱-骨界面处局部释放，他们将小块的海绵浸泡在培养基中，然后植入肩袖修复处。之后，他们利用相关细胞系在体外验证了观察到的结果，并在体内进一步研究了hBMSC-CM介导的腱-骨愈合作用（图1）。 图1. 研究技术路线图 hBMSC-CM促进了大鼠肩袖处的腱-骨愈合 研究人员首先利用赛业的间充质干细胞分化培养基，对间充质细胞进行了鉴定。他们接着收集了间充质干细胞的条件培养基，测定了几种生长因子的浓度。他们发现，培养基中含有TGF-β、VEGF和IGF-1等能够促进腱-骨愈合的生长因子。 之后，他们将海绵切成1mg的小块，在灭菌后放入hBMSC-CM中浸泡30分钟，并植入大鼠的肩袖修复处。术后4周和8周，他们通过组织学和放射学方法观察到了再生的止点（图2）。Micro-CT显示，CM组修复区域的骨密度显著高于DMEM
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论文解读：利用外泌体**骨质疏松的新进展
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
骨质疏松是老年人中常见的慢性疾病。据统计，目前全球超过2亿人罹患骨质疏松症，每3秒就有一例骨质疏松性骨折发生。我国50岁以上人群的骨质疏松症发病率为19.2%。为此，科学家们在寻找方案来逆转骨质流失。 近日，海军军医大学的苏佳灿/陈晓研究团队在《Bioactive Materials》杂志上发表研究成果。他们提出了一种通过在外泌体膜表面展示CXCR4来获得使其骨靶向骨外泌体的新方法，有望逆转与年龄相关的骨质流失。 研究背景 骨髓间充质干细胞（BMSC）是骨髓脂肪细胞和成骨细胞的祖细胞。BMSC从成骨分化转变为成脂分化，骨形成受损，是许多病理性骨质流失的特征。抑制成脂分化并促进成骨分化，有望**骨质疏松症。 之前的研究发现，随着年龄的增长，miR-188显著增加。这种miRNA可调节BMSC的分化命运，促进脂肪生成并抑制骨生成。因此，以miR-188为靶点进行**可以促进骨形成。然而，大剂量siRNA的全身给药可能对非骨骼组织产生不利影响。这就突出了骨靶向递送系统的必要性。 外泌体（exosomes）在药物递送方面展示出惊人的潜力。同时，考虑到SDF-1/CXCR4轴在造血干细胞归巢中发挥重要作用，研究人员假设CXCR4阳性的外泌体可以被招募到骨髓。于是，他们尝试用CXCR4+外泌体来实现miRNA拮抗剂的骨靶向递送，以此来逆转与年龄相关的骨质流失。 CXCR4+外泌体的体内分布 为了验证这一假设，研究人员通过慢病毒包装系统将CXCR4基因引入NIH-3T3细胞系，并通过RT-qPCR和免疫荧光证明了CXCR4在NIH-3T3细胞上成功表达。之后，他们从培养上清液中分离出外泌体，并证实CXCR4在外泌体的表面表达。 接下来，为了验证CXCR4+外泌体具有骨靶向特性，他们开展了体内追踪实验。他们用Cy5荧光染料对NIH-3T3细胞和CXCR4+ NIH-3T3细胞的外泌体进行标记，并通过尾静脉注射到小鼠体内。他们发现，CXCR4+ EXO组小鼠的股骨处存在特异性的染料富集，表明CXCR4+外泌体特异性靶向骨髓（图1）。据悉，这是第一项通过外泌体膜表面展示CXCR4来
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慢病毒（LV）包装的常见问题及解答（2）
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
慢病毒（Lentivirus，LV）是由人类免疫缺陷病毒（HIV）改造而来的一种病毒载体，属于逆转录病毒。慢病毒可将特定基因片段随机、稳定地整合到宿主细胞的基因组中，实现目的基因的持续稳定的表达目的产物，因此，目前慢病毒载体已经广泛地应用于基因的表达调控如过表达，干扰和基因敲除。 然而，在做病毒包装实验中，科研工作者常遇到一些问题，赛业生物具有多年分子生物学和细胞生物学相关实验技术的研究经验的细胞生物学产品经理针对常见的问题整理了一份慢病毒包装FAQ，希望能解答您关于慢病毒包装的困惑，上篇回顾请点这里：慢病毒（LV）包装的常见问题及解答。今天我们接着进行慢病毒包装常见的问题解答： 慢病毒载体最大可插入多大的片段？ 慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右，但一般建议插入的片段大小不超过5kb，这样包装出来的病毒滴度较高，若超过6kb则会显著降低病毒滴度。实际病毒包装中，我们常需要插入报告基因（如GFP）和抗性基因（如Puro），这使得目的片段的容量进一步缩小至3kb左右。 我们目前通过载体优化，例如删去不必要的基因，减小启动子长度，可使目的基因的片段容量扩大到4kb左右。 怎么确认我的细胞需要多少病毒量才够？那么多规格我该怎么选？ 由于慢病毒的感染谱很广，可以感染分裂期和非分裂期的细胞，对于大部分的细胞类型，采用1×108 TU/ml的规格即可满足要求，另外由于目前慢病毒多用于体外细胞的感染而少用于体内注射，因此非纯化亦可。 对于难感染的细胞，如原代细胞，需要较高的MOI，需要的病毒量也较多，建议选高规格，如1×108 TU/ml。 对于较为少见的细胞类型所需要的病毒量，可通过参考文献或预实验确定。 你们是用什么方法来检测病毒滴度的？可靠吗？ 在上篇有讲到，慢病毒滴度的测定方法主要有4种，即Elisa法检测病毒颗粒中p24蛋白，PCR法检测病毒颗粒RNA和检测整合到基因组的病毒DNA，以及通过FACS检测荧光蛋白的表达水平。 我们采用的是定量PCR检测整合到细胞（293T）基因
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细胞冻存的必要性及冻存过程中的注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
细胞培养的传代及日常维持过程中，在培养器具、培养液及各种准备工作方面都需大量的耗费，而且细胞一旦离开活体开始原代培养，它的各种生物特性都将逐渐发生变化并随着传代次数的增加和体外环境条件的变化而不断有新的变化。因此及时进行细胞冻存十分必要。细胞冷冻储存在-70℃冰箱中可以保存一年之久；细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。 以下是关于细胞冻存的注意事项： 1. 为保持细胞最大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。 2. 冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。 3. 初次冻存者在下降冻存时，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。 4. 各种细胞对冻存速度的要求也不一样；上皮细胞和成纤维细胞耐受性可能大些，骨髓干细胞－2~－3℃/分钟合适；胚胎细胞耐受性较小，不宜太快。总之在一开始时，下降速度不能超过－10℃/分钟。 5. 用什么防护剂合适和用量多大，要依细胞而定，初代培养细胞用DMSO 较好，一般细胞可用甘油；用量以较小为好。有人认为人皮肤上皮细胞贮存在20%-30%甘油中很好。 6. 原则上细胞在液氮中可贮存多年，但为妥善起见，冻存一年后，应再复苏培养一次，然后再继续冻存。 7. 将冻存管放入液氮容器或从中取出时，要做好防护工作，以免冻伤 8. 注意自身的安全，对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心。操作过程中，应避免引起气溶胶的产生，小心有毒性试剂例如DMSO，并避免尖锐物品伤人等。
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论文解读：由干细胞构建胚胎模型的新突破
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
在体外由多能干细胞生成正确分化的胚胎结构一直是一项挑战。弗吉尼亚大学的研究人员近日通过经实验设计的形态发生素（morphogen）信号中心发出的小鼠胚胎干细胞聚集指令，诱导生成了一个小鼠胚胎样实体（胚状体），这有望成为体外研究和疾病建模的强大工具。 这篇题为“Construction of a mammalian embryo model from stem cells organized by a morphogen signalling centre”的文章于6月2日发表在《Nature Communications》杂志上。 近年来，科学家在体外复制哺乳动物胚胎发育方面做了大量的工作。他们利用干细胞生成了类器官，能够模拟真实器官的显微结构。为实现更高程度的组织化，器官需要具有血管并受神经支配，并且包含来自三个胚层的各种细胞和组织类型。以往的研究取得了很大突破，但在体外只能实现部分发育。 为此，弗吉尼亚大学细胞生物学教授Christine Thisse领导的研究团队试图通过在小鼠胚胎干细胞聚集体中设计一个局部的形态发生素信号中心来实现广泛的胚胎发育。在小鼠胚胎中，原肠胚的初始结构是由三种信号分子相互作用产生的：形态发生素BMP4、NODAL和WNT。 于是，研究人员在小鼠ESC聚集体中设计了分泌WNT3和NODAL的信号中心（图1）。他们生成了两个不同大小的聚集体（50和100个细胞）。在培养3天后，将小的聚集体与小鼠BMP4蛋白放在一起孵育8小时，诱导WNT3和NODAL的表达。然后，将这些经过处理的小聚集体放在培养板中，与未经过处理的大聚集体接触。1小时后，它们自发融合形成更大的结构，称为胚状体（embryoid）。 图1. 产生胚状体的实验策略 通过原位杂交等分析，他们发现胚状体显示出原肠胚形成的明确证据，其中涉及到的中胚层细胞运动与从小鼠胚胎中观察到的相似。免疫标记、细胞追踪和转录组学分析表明，这些胚状体通过原肠胚形成过程形成三个胚层，且它们表现出广泛的发育结构，与神经胚期小鼠胚胎高度相似。 之后，研究人员又观察到三个胚层衍生物的形成。在腹侧，胚状体
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果蝇高通量呼吸代谢测量技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
易科泰生态技术公司提供高通量果蝇呼吸代谢测量全面解决方案： 1.高分辨率、高通量果蝇能量代谢测量，8通道、16通道直至64通道供选配 2.高通量、高灵敏度果蝇采食行为在线监测技术方案 3.可分辨“品尝”行为和“采食”行为及食性选择行为 4.应用于生物医学、健康医学、神经科学、遗传性、进化生态学、发育生物学等实验研究 部分参考文献： Alex C Keene, PhD, Sleep-Dependent Modulation of Metabolic Rate in Drosophila, Sleep, Volume 40, Issue 8, August 2017, zsx084, https://doi.org/10.1093/sleep/zsx084 Arce C C, Th Eepan V, Schimmel B C, et al. Plant-associated CO2 mediates long-distance host location and foraging behaviour of a root herbivore[J]. eLife Sciences, 2021, 10:e65575. Bawa S, Brooks D S, Neville K E, et al. Drosophila TRIM32 cooperates with glycolytic enzymes to promote cell growth[J]. eLife Sciences, 2020, 9. Bethany A Stahl, PhD, Melissa E Slocumb, BS, Hersh Chaitin, MS, Justin R DiAngelo, PhD,Careau V, PP Beauchamp, Bouchard S, et al. Energy metabolism and personality in wild-caught fall field crickets[J]. Physiology & Behavior, 2019, 199:173-181. Dweck H, Carlson J R. Molecular Logic and Evolution of Bitter Taste in Drosophila[J]. Current biology: CB, 2019, 30(1). Hoekstra L A, Julick C R, Mika K M, et al. Energy demand and the context-dependent effects of genetic interactions[J]. Evolution Letters, 2(2):102-113. Horn CJ, Mierzejewski MK, Elahi ME, Luong LT. Extending the ecology of fear: Parasite-mediated sexual selection drives host response to parasites. Physiol Behav. 2020 Oct 1;224:113041. doi: 10.1016/j.physbeh.2020.113041. Epub 2020 Jun 30. PMID: 32619526. Joseph R M, Sun J S
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临界点干燥与SEM分析工作流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
应用手册 临界点干燥程序是在SEM应用中对精密样本实施干燥的有效方法。临界点干燥保全了样本的表面结构，否则，当样本从液态变为气态时可能会因为表面张力而导致表面结构受破坏。在过去，临界点干燥是一个耗时的过程，由于手动操作太多造成了样本的重现性较低。许多生物样本通常在干燥前通过固定和脱水制备，干燥后进行金、铂或钯等金属镀膜使其表面导电，这样才能方便开展SEM分析。 临界点干燥 – 介绍 扫描电子显微镜（SEM）的用途之一是研究生物应用中的表面形态，这需要保全样本的表面细节。用于电子显微镜（EM）成像的样本需要干燥处理以便与显微镜的真空兼容。水分子的存在会干扰真空，进而影响成像。水分子还将导致所研究的结构体出现大规模变形或坍塌（见“空气和临界点干燥的比较”）。水会对空气形成很高的表面张力。在蒸发（空气干燥）过程中，穿过从液相到气相的交界面，由表面张力引起的切向力会对样本的纳米和微观结构产生影响。 要保全样本形态，临界点干燥是最先进的方法（见“CO2的压力/温度相图”）。在临界点上，液体和气体的物理特性无法区分。处于临界点的化合物可以在不穿过液气界面的情况下转化为液相或气相，避免了破坏作用。使用水的临界点脱水是不可行的，因为位于374℃和229 bar的温度下时，任何生物样本都会被破坏。为了克服这一问题，可以用液态二氧化碳（CO2）代替水，其临界点为31℃和74 bar，所以更适合所有生物应用，技术上也相对容易维护。 但CO2作为过渡液体也存在一项严重的缺点；CO2不能与水混溶。因此，必须用乙醇或丙酮之类的交换液来代替水，这些液体可以在水和液态CO2中混溶。这两种交换液都不能用于临界点干燥，因为它们的临界点温度很高（乙醇：Pc 60 bar/Tc 241℃；丙酮：Pc 46 bar/Tc 235℃）。 在预临界点干燥步骤中，用交换液代替水，然后用液态CO2代替交换液，液态CO2被带到临界点并通过在恒定临界点温度下降低压力转化为气相。 CO2压力/温度相图
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间充质干细胞在新型冠状病毒肺炎**中的应用与研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
浙江大学医学院李兰娟院士和项春生教授领导的研究团队近日开展了一项探索性临床试验，评估用间充质基质细胞（又称间充质干细胞，MSC）来**新冠肺炎的安全性和有效性。他们发现，间充质基质细胞不仅能够**新冠肺炎，未来还有望用于急性或慢性肺炎的**。 这篇题为“对人类经血来源的间充质基质细胞**重症和危重症COVID-19患者的安全性和疗效的评估：一项探索性临床试验”的文章发表在《Clinical and Translational Medicine》杂志上。通讯作者包括浙江大学医学院的李兰娟院士和项春生教授、树兰国际医学院的汤灵玲教授以及武汉大学人民医院的江应安教授。 2019新型冠状病毒肺炎（COVID-19）自2019年12月爆发以来，迅速引起了全球关注。在疫情爆发的最初几周，由于缺乏对新型冠状病毒（SARS-CoV-2）的了解，感染人数迅速增加，并在全球范围内传播。截至2021年4月14日，全球感染人数超过1.37亿，死亡人数超过295万。 SARS-CoV-2感染性强，危重症患者的死亡率高，而且目前尚无有效的**方法。此外，SARS-CoV-2引发的继发感染可在重症或危重症患者中诱发多器官功能障碍综合征，这在全世界范围内都是一个严重问题。间充质基质细胞在临床前试验中对多种疾病有良好的**效果，因而受到了广泛关注。 在这项探索性临床试验中，研究人员评估了经血来源的MSC**重症和危重症患者的能力。他们对感染SARS-CoV-2的患者进行随访，评估了移植MSC的安全性、疗效和耐受性。同时，他们还评估了肺功能的改善。 试验设计 这项多中心、非随机的平行对照I期临床试验于2020年1月至4月招募了44例患者。26例患者作为实验组，选择接受经血来源的MSC**和综合**。其中，重症患者有16例，危重症患者有10例。18例患者作为对照组，选择只接受综合**。其中，重症患者有10例，危重症患者有8例。实验组和对照组的平均年龄分别为58岁和61岁。 本次试验所使用的MSC来自三名健康的女性捐献者。研究人员收集并纯化了经血中的单核细胞，并通过流式细胞术
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