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可控的单细胞细胞核注射技术——最新的贴壁活细胞注射技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
2012年11月20日发表于 Small杂志。 可控的单细胞细胞核注射技术——最新的贴壁活细胞注射技术 微量细胞注射自从70年代问世一直以来，就成为蛋白、核酸、多肽、药物、微粒子等进入细胞的重要手段。但是该技术对于操作者的要求过高，用于注射的显微注射针难以制备又成为了它难以广泛应用的技术壁垒。现如今FluidFM技术的出现，攻克了这一技术壁垒。 FluidFM是AFM与微流控技术的完美结合的产物 最新型的纳米技术让微流控注射技术有了新的转机。通过纳米工艺技术所制造出的中空纳米探针，使得探针在进行表面力学探测的同时具有了向探测物体注射的能力。这种特点使得这种探头能够感知细胞表面应力，给了用户对探针当前状态最直接的感官，能够帮助使用者快速了解探针目前状态，判断注入时机。而完美的与微流控结合也让注射精度得到了完美的控制。另外使用的纳米探针十分微小，注射器头部仅有400 nm，几乎不会对细胞造成损伤。 FluidFM如何工作？ 当注射器在刺破细胞膜或者核膜的时候就会产生力学的变化。具备力学探测功能的FluidFM系统就能能够在力谱中探测到这种力学的变化。如图中A中（I）力学曲线开始上升，说明探针与细胞表面开始接触。（II）当注射器刺破细胞膜之后，探针表面的阻力立即降低。因此我们就可以在图中观测到第一个松弛峰。（III）随后当探针继续深入就会与核解除并且刺破核膜这时候我们就会观察到第二个松弛峰。（IV）当探针继续下移，开始靠近载玻片后，压力开始快速增大，直到核膜刺破。（V）之后随着探针的继续深入，细胞膜也被穿透。（VI）这时候探针与玻璃完全接触，作用力随着Z轴下移直线增加。 FluidFM的注射精度极高 使用FluidFM技术进行细胞注射是一种十分快捷可靠的手段。首先对单个细胞注射量进行考量结果如b所示。在注射800fL（相当于20%的细胞总体积）时，没有观测到任何细胞形态上的改变。而在注射体积达到900fL后，细胞表面开始出现小泡。进
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紫草素对白色念珠菌的抑制作用测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
将200 µL培养至对数期的白色念珠菌的菌悬液(106 CFU/mL)分别加入96孔板中，再加入20µL不同浓度的紫草素药液，使其终浓度分别为64、32、16、8、4μg/mL，37℃培养24h后于595 nm处测定吸光值。以不加药物组为空白对照。实验重复3次，取平均值。其中，紫草素对白色念珠菌的最低抑菌浓度(MIC)值为菌体的OD值下降80%以上的最低药物浓度。从大于MIC的各孔中分别取10µL菌悬液涂布于SDA固体培养基上，37℃培养48h后观察菌体生长情况，最低杀菌浓度(MFC)为平板上没有菌体生长的最低药物浓度。 紫草素对白色念珠菌细胞膜渗透性的影响 将培养至对数期的菌悬液按2%接种量接种于20mL RPM-1640液体培养基中，以150r/min、30℃恒温培养16h后，离心弃上清液，用PBS洗涤菌体2次，制成适当浓度的白色念珠菌菌悬液，分别向其中加入浓度为MIC和2MIC的紫草素继续培养12h，每隔2h分别取样液4mL，4000r/min离心10min弃沉淀，用紫外分光光度计于260nm下测定上清液中DNA和RNA等大分子物质的变化。以不加药为空白对照组，实验重复3次，取平均值。 紫草素对白色念珠菌形态的影响 将培养至对数期的白色念珠菌菌悬液(107 CFU/mL)接种于含紫草素终浓度为MIC的YEPD液体培养基中，150r/min、30℃振荡培养。于6h和16h分别取1mL菌悬液，3000r/min离心5min后弃上清。再加入0.5mL PBS缓冲液和0.5mL 2.5%的戊二醛，4℃冰箱固定过夜。次日用PBS缓冲液冲洗2次，50%、80%、100%乙醇依次脱水1次，每次15min，100%乙醇浸没的电镜样品置4℃冰箱中降温10min后，放入真空干燥器中干燥40min。待干燥后的样品温度升至室温后取出，喷金镀膜，使用扫描电镜观察照相，以不加药组为空白对照，实验重复3次。 紫草素对白色念珠菌细胞内钙离子浓度的影响 将2mL RPM-1640培养基及300μL培养至对数期的菌悬液(106CFU/mL)分别加入6孔板中，每孔内分别放一片无菌盖玻片，37℃培养4h后，以加入300μL浓度为MIC的紫草素的孔为实验组，加入300μL去离子水的孔为空白对照组
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不得了，大牛告诉你lncRNA甲基化如何研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
lncRNA分子通过海绵机制结合microRNA发挥生物学功能，这个ceRNA机制已经让大家心生厌倦了。可大牛就是大牛，引入甲基化就能轻松的变废为宝，竟然能让lncRNA的ceRNA思路变得瞬间高大上发表10分以上的文章，你一定和小编我一样很好奇他是怎么做到的。 RNA甲基化，作为最新的国自然热点受到了越来越多的关注，更多的研究开始着重RNA甲基化方向的讨论与研究，仅仅在刚刚过去的两个月当中，10+的RNA甲基化文章就多达16篇。2018年国自然立项情况来看RNA甲基化中标数目是2017年的4倍之多，其中不少项目开始从mRNA转为关注非编码RNA的甲基化对于疾病发生发展过程重要作用的研究，例如m6A甲基化lncRNAs在套细胞淋巴瘤中的作用与机制研究（北京大学），RNA去甲基化酶FTO介导的lncRNA-m6A修饰对肝癌细胞重编程的调控作用及机制研究（同济大学）等等。云序生物以同济大学康九红团队于2018年2月发表在Nucleic Acid Research（影响因子11.561）为例给大家讲讲，lncRNA分子发生甲基化该如何研究。 1. linc1281对于mESC（小鼠胚胎干细胞）分化必不可少 研究表明主要分布在细胞质当中的linc1281对于mESCs细胞的分化是不可或缺的，shRNA方法沉默内源表达的linc1281使细胞展现正常的自我更新特征，但mESCs特征性的基因Oct4、Sox2和Nanog表达没有改变，暗示linc1281可能和其他生物学功能相关。研究者将lincRNA沉默的细胞注射至免疫缺陷的小鼠当中，相比于对照组，linc1281沉默的小鼠畸胎瘤生长在体积和重量方面明显小于对照组肿瘤。HE染色以及免疫组织化学结果表明linc1281分子的沉默可以有效的阻滞mESCs的分化过程。此外在体外研究mESCs细胞分为中胚层源心肌细胞和外胚层源神经细胞系的能力时发现linc1281对多能性相关marker表达无显著影响，而使mESCs分化能力显著减弱。另一方面对linc1281的过表达可以增强mESCs的分化能力。 2. 深入研究的linc1281发生m6A甲基化修饰 最近的研究表明m6A RNA甲基化修饰能够影响mESCs的细胞命运，很多mE
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环状RNA研究方法——助你快速发表5分以上文章
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
至2015起云序生物已经完成10000+例环状RNA全转录组测序服务，涵盖了50+疾病，20+物种，帮助众多客户在环状RNA分子的研究中取得突破性进展。客户发表的环状RNA文章高达20篇以上。此外云序生物还提供环状RNA机制研究手段，rip&RNA pull down技术，帮助客户冲刺高分机制文章。本周小编来讲讲云序生物客户利用全转录组测序如何又快速发表了一篇5分以上的文章（前期讲述了好多篇环状RNA测序直接发表5分的文章的案例，感兴趣的伙伴可以点击往期的链接）。 研究背景： 作为非编码分子的重要成员，环状RNA分子在多种疾病生理学过程当中都扮演着重要的角色。这一次对于环状RNA分子的研究聚焦在了电离辐射对细胞的影响。说起电离辐射，其实在我们的生活中微量辐射几乎无处不在，土壤中有天然辐射源氡气，体检的时候使用的X射线机等等。要知道肠上皮细胞对（intestinal epithelium）电离放射是高度敏感的，腹部或者盆腔肿瘤病人在接受放放射**后都会引起放射毒性造成的肠道损伤。那么问题来了，放射引起的肠道损伤较正常的肠道细胞，环状RNA分子这一次是如何变化的？差异性的环状分子功能如何？且听小编慢慢的为您解读这篇文章。 实验设计： 整个实验设计为对照组和照射处理组（实验组），每组三个生物学重复。其中对照组为正常野生型小鼠，实验组小鼠使用Cs137gamma光放射仪以恒定计量进行照射，3.5天后取两组小鼠空肠组织提取RNA。 图1. 技术路线图 研究内容： 1. 环状RNA表达如何？差异表达的有哪些呢？ 高质量的测序服务，专业的生信分析，云序生物让环状研究变得容易，这是一条广告。高质量的测序技术对每一个环状的表达都做到精准检测，生信分析可视化从宏观角度（染色体分布、成环位置）给出了所有对于放射处理后在小鼠空肠组织当中环状RNA分子的表达情况。 图2. 放射处理后小鼠空肠组织环状RNA表达情况
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作物基因组学研究进展
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
作物基因组学研究进展 农作物基因组学研究的发展，对于有效利用现代分子生物学手段进行物种的遗传改良发挥了重要作用。随着测序技术的发展，已经实现对重要农作物，如水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、棉花、蔬菜等作物基因组的测序或重测序，在此基础上完成对控制重要农艺性状基因的克隆和鉴定。本文综述了２０１8年度主要农作物基因组研究方面取得的一系列重要进展。 ⒈基因组学领域论文分析 在ＳＣＩＥ数据库共获得９５４篇基因组学研究相关的文献。中国发文量最多，共３３９篇，约占该领域发文总量的一半；美国发文数量为１６３篇，排名第２；德国发文量为４９篇，排名第３；印度、韩国、日本、法国和澳大利亚紧随其后，发文量分别为４８篇、３５篇、３３篇、２９篇和２８篇。 中国机构表现较突出，共有６个机构进入该领域论文数量ＴＯＰ１０行列。中国农业科学院发文量为３１篇，排名第１；其次是华中农业大学和中国科学院，论文数量各为２２篇；南京农业大学发文１９篇，排名第３。 ⒉基因组学研究态势分析 农作物基因组学研究的空前发展正推动着农业的第二次“绿色革命”。全基因组的剖析，可以提供每个农业生物物种或品种全基因组的遗传信息。尤其是对控制重要农艺性状的基因组成情况分析，以及对调控复杂性状的分子网络的解析，皆得益于高效与廉价测序技术的发展。目前已经实现了对重要农作物，如水稻、小麦、玉米、大豆、油菜、棉花、蔬菜等基因组测序或重测序，实现了对控制重要农艺性状关联基因的大规模克隆和鉴定。２０１8年度经过全球科学家的努力，在主要农作物基因组研究方面取得了一系列重要进展。 ⑴水稻基因组研究 水稻（Ｏｒｙｚａ ｓａｔｉｖａ Ｌ．）既是重要的粮食作物，也是生物学研究的模式植物。近年来，我国水稻功能基因组学研究一直走在世界前列，高质量的水稻参考基因组序列可谓功不可没。中科院遗传发育所梁承志课题组与四川农业大学李仕贵合作，利用ＰａｃＢｉｏ单分子测序技术结合ｆｏｓｍｉｄ
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Nature | m6A RNA甲基化识别蛋白YTHDF1参与记忆的形成
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
目前来说，调控m6A修饰过程的阅读蛋白共有9种功能，今天不会大家一一来讲，而是主要讲参与蛋白编码过程的YTHDF1蛋白，它主要通过与mRNA的m6A位点结合，在脑神经发育[1]，多巴胺分泌[2]和突触形成[3]等过程中起重要作用。 文章导读： 2018年10月31日，美国芝加哥大学何川团队，上海科技大学周涛团队与宾夕法尼亚大学宋红军团队联合在Nature期刊发表论文，首次指出m6A 修饰对小鼠学习及记忆能力的影响，今天小编将详细对本文进行解析，同时总结一下近年来何川教授针对阅读蛋白研究的文章。 样本：野生型小鼠，YTDHF1敲除模型小鼠 技术手段：m6A RNA 甲基化测序，mRNA 测序，CLIP测序和小鼠认知相关功能实验等 时间点：初次刺激期，LTP期（刺激反应晚期）和二次刺激期 本文研究了YTHDF1敲除及野生型小鼠海马体神经受到初次刺激，LTP期和二次刺激后神经的表型反应，相关蛋白生成量及前后等电位点阈值的变化情况。 受到初次刺激时，两组小鼠对于刺激的表型反应差距不大；LTP期，YTHDF1敲除小鼠由于缺乏YTDHF1蛋白从而抑制了LTP相关蛋白的合成，导致在受到后续刺激时，等电位点变化达不到阈值影响记忆形成的能力。 1. YTDHF1敲除小鼠对空间记忆能力和外界刺激的敏感度差 前期实验已证实YTDHF1在小鼠海马体中高表达[4]，于是作者通过CRISPR-Cas9技术构建了YTDHF1敲除的模型小鼠（图1a），命名为YTDHF1-KO小鼠。与野生型小鼠相比，KO组小鼠在四周岁前，海马体的组织形态（图1b），透明水迷宫训练结果（图1c）与正常小鼠一致。而在不视水迷宫训练（图1d），探头实验（图1e）和对于外界刺激（图1f，g，h）的敏感度都要长于对照，说明敲除YTDHF1蛋白对空间记忆和外界刺激能力的反应起重要作用。 2. YTDHF1及相关蛋白参与学习和记忆关键的LTP期 作者接着从生理水平观测敲降组小鼠脑的变化。敲降组突触电流振幅和频率比对照组低（图2 a，b），且形态比对照组小（图2 c，d）。在受到外界刺激时，神经
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常见细胞流体剪切力实验类型及特征简要介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一. 流体剪切力细胞实验背景 液体是每个生物物种的重要组成部分。在生理状态下，许多细胞类型被流体环境包围。典型例子包括：血管内皮细胞，形成血管内层，淋巴管内皮细胞，形成淋巴管内层，肾和肺的上皮细胞。 这种液体流动引起剪切应力，这是一种机械力，以多种方式影响细胞形态和行为。在许多标准体外实验中，细胞在没有流动的情况下培养。在这些静态条件下，通常没有考虑剪切应力依赖性细胞变化。实际上，在流动下的体外细胞培养并模拟这种机械刺激并诱导更加接近生理状态的体内生物过程行为很有意义。特别对于研究在生物流体中存在的细胞时，模拟流动状态显得尤其重要，如内皮细胞或上皮细胞。 下图实验显示了静态和流动状态下人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的免疫荧光图像，显示在流体环境和静止环境下细胞的不同状态。 用鬼笔环肽（红色）染色细胞骨架F-肌动蛋白。 VE-钙粘蛋白（绿色）标记粘附连接点。 使用DAPI（蓝色）染色细胞核。 左：HUVEC，静态培养，0 dyn / cm， 2.5天， μ-slide 35mm培养皿。 右：HUVEC，流体剪切力10 dyn /cm²环境，2天，μ-Slide I 0.4 Luer. 二.流动剪切应力对细胞的影响 剪切应力是由液体对顶端细胞膜的摩擦引起的机械力。 在体内，几种贴壁细胞类型暴露于生物流体系统中的机械剪切应力，例如血液和淋巴管或肾单位。 这种机械刺激对细胞的生理行为和粘附特性有很大影响。 细胞通过离子通道激活，基因表达和整个细胞层的重组的变化对剪切应力起反应。 上图显示了HUVEC在流动条件下（20 dyn /cm²）培养 μ-SlideI 0.4 Luer 超过9天。 为了观察细胞骨架，用腺病毒载体转导细胞RAV巨细胞病毒-LifeAct-TagRFP 实验前24小时。 剪切应力以达因/平方厘米（dyn / cm 2）测量, 生理剪切应力值的范围为0.5至120达因/平方厘米，取决于血管类型（例如，动脉或静脉），组织（例如，脑，结缔组织或心脏），以及生物体的大小（例如，小鼠，大鼠或人）。 常见组织细胞的
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衣原体特异性抗原和抗体检测方法-中国微生物菌种查询网
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
衣原体特异性抗原和抗体检测方法-中国微生物菌种查询网 1、材料 ①7—8d日龄的鸡胚，McCoY细胞或HL细胞。 ②荧光显微镜，CO2孵箱。 ③沙眼衣原体免疫荧光诊断试剂盒，吉姆萨染色液。 2、方法 （1）标本采集 ①沙眼病人眼结膜标本的采集。在10%丁卡因局部麻醉下，用无菌狭长盖玻片（0.5*2cm）刮取眼结膜上的滤泡组织，置于盛有1—2ml蔗糖磷酸盐缓冲液的小玻璃瓶内，-4—20℃冰箱 内保存。 ②男性尿道炎标本的采集。用无菌特制的尿道拭子伸入尿道口内2—4cm，旋转数次，抽出置于保存液中。 ③女性宫颈炎标本的采集。用无菌窥阴器张开阴道口，以无菌特制的宫颈拭子深入宫颈2—3cm2，旋转数次抽出放人保存液中。分离培养时，从低温冰箱取出，加入链霉素200U、万古霉索，在4℃冰箱中处理过夜备用；也可在保存液中预先加入庆大霉素、两性霉素。 （2）鸡胚分离培养取7—8d日龄的鸡胚，用8号针头吸上述标本接种卵黄囊0.25ml，35℃温箱培养，逐日观察，将2d后死亡及9d后仍存活者予以解剖。收集卵黄囊膜并制成涂片，吉姆萨染色后油镜观察，如在涂片中找到紫红色颗粒者为阳性。如活体解剖者，可盲目传1—2代。如仍找不到细颗粒EB（原体）者为阴性。 （3）细胞分离培养：可选用McCoy、HEla-229、FL、HL等对衣原体敏感的长成单层的细胞，载体可用玻璃小瓶或塑料培养板，在底部可预置适当大小的盖玻片。接种标本后，1800—3000g离心1h，促进EB进入细胞。吸附1h，吸去上清液，加入含放线菌酮0.5ug的1640维持液， 35℃CO2孵箱或密封培养，48—72h后取出盖玻片，漂洗、甲醇固定后，可作吉姆萨、碘液或单克隆抗体荧光抗体染色，高倍显微镜或荧光显微镜下观察包含体。必要时，亦可作盲目传1—3代。 细胞培养法的敏感性为80%—90%，特异性为100%，是目前诊断沙眼衣原体感染最可靠的方法，因此是评价其他实验室诊断方法的金标准。 ① 涂片检测：包括结膜涂片和宫颈拭子涂片，前者可用吉姆萨染色或单克隆抗体荧光抗体染色，寻找包含体；后者可用单克隆
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【干货】流式细胞术原理与应用详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
研究实验中，我们常常用到一个高大上的仪器――流式细胞仪，而与之相对应的就是流式细胞术，可是大家对它们都了解多少呢？今天小编就带着大家好好地认识一下~ 流式细胞术 流式细胞术（flow cytometry，FCM）是利用流式细胞仪对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术。其特点是:第一，只要样本制备成单个细胞或生物颗粒悬液均可以分析。第二，测量速度快，每秒中可以测量数千个乃至数万个细胞。第三，同时测量每个细胞的多参数特征。第四，在进行细胞特征分析的同时可以把指定特征的细胞分离出来，以便对特定细胞做进一步培养、克隆化、观察或进行某些实验，这就是分选技术。 那么，具体是如何通过FCM实现分选的呢？ 1、首先，制备单细胞悬液 将待测细胞或微粒制成单细胞悬液，经特异性荧光染料标记抗体进行染色，在恒定气体的压力下进入流动室，不含细胞或微粒的缓冲液在高压下从鞘液管喷出，鞘液管入口方向与待测样品流形成一定角度，鞘液包绕着样品高速流动，组成一个圆柱形的液流束，待测细胞或微粒在鞘液的包被下单行排列，依次通过检测区域。 2、其次，收集单细胞上的荧光信号 流式细胞仪通常以激光作为发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，细胞或微粒上的荧光染料被激发，产生散射光和激发荧光。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。 3、再次，统计结果 荧光信号的强度代表了所测细胞膜表面抗原强度或细胞内物质的浓度，经光电转换变为可被计算机识别的数字信号。计算机把所测量到的各种信号进行计算机处理，将分析结果显示在计算机上。 4、最后，做细胞分选 细胞的分选是指根据所测定的各个参数将指定的细胞从细胞群体中分离出来的一种方式，通过分离含有单细胞的液滴实现。在流动室的喷口上方
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Nature Medicine黑色素瘤PD-L1免疫疗法的新途径
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
免疫检查点及抗体药物 阻断程序性死亡配体-1(PD-L1)与程序性死亡-1(PD-1)受体的相互作用等抑制性检查点，可有效地抑制肿瘤细胞的免疫逃逸。在转移性黑色素瘤患者中首次发现了免疫检查点抗CTLA 4抗体(Ipilimumab)阻断，可以使肿瘤病人临床受益，很快CTLA-4抗体被更有效、毒性更小的抗Pd-1抗体(pbrobrolizumab和nivolumab)所取代。这一概念从根本上改变了世界范围内的癌症**，仅在几年内，抗PD-1或抗PD-L1抗体就被批准用于其他几种癌症，包括肺癌、肾癌和霍奇金淋巴瘤，目前几乎所有类型的癌症都在进行评估。 尽管取得了这些重大进展，但大多数患者仍存在对免疫**的原发性或继发性耐药，仍然需要可靠和动态的预测生物标志物。肿瘤PD-L1的表达是一种潜在反应疗效的生物标志物，但其调控的复杂机制尚不完全清楚。 免疫检查点抗肿瘤新机制 法国国家健康与医学研究院U981, 巴黎-萨克雷大学, 巴黎文理研究大学等机构的科学家，联合在最新一期Nature Medicine发表文章，发现黑色素瘤免疫逃逸新机制，Translational control of tumor immune escape via the eIF4F–STAT1–PD-L1 axis in melanoma，作者发现真核翻译起始复合物eIF4F结合了mRNAs的5‘端，通过调节信号转导子和转录激活因子1(STAT 1)转录因子的翻译，调节干扰素-γ诱导的PD-L1在癌细胞表面的表达。eIF4F复合物的形成与人黑色素瘤免疫**的反应相关。eIF4F的RNA解旋酶组分eIF4A具有较强的抗肿瘤免疫调节作用。因此，作为抗癌药物的eIF4A抑制剂也可能作为癌症免疫疗法新的候选药物。 结果 eIF4F复合物形成与PD-L1表达高度相关 eIF4F 调节STAT1 mRNA转录 靶向eIF4F抑制剂silvestrol通过STAT1发挥作用 4ebp1−/−;4ebp2−/−双敲除小鼠研究eIF4F对STAT1的调节 4E binding proteins 1 and 2（4EBP1/4EBP2）抑制eIF4F复合物的形成，抑制其作用。 4ebp1−/−;4ebp2−/−双敲除小鼠，因为eIF4F不被抑制，故STAT1不被抑制。野生型的小鼠，STAT1被抑制。 靶向eIF4F抑制剂silvestr
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Digital PCR 技术的发展与应用详述
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Digital PCR，绽放正当时！ dPCR发展历史 1992年，Sykes等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞，检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则：有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理，为以后dPCR的发展奠定了基础。 1997年，有研究利用玻璃毛细管作为载体进行PCR反应，可以对模板分子进行定量，验证了Taq-Man探针可以检测模板单分子，尤其在微小的反应体系中，发展了单分子定量技术，为dPCR单模板扩增提供了技术支持。 1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念，他们在结肠癌患者粪便中检测KRAS基因突变时，首先把样本分配到384孔板中，然后分别用不同荧光检测突变基因和正常基因，通过计算突变基因和正常基因的比例来得出突变率。 2003 年 Dressman 等 发 明 了 一 种BEAMing 方法(珠子、乳剂、扩增与磁力) 。BEAMing 将模板、引物、PCR 试剂和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR 完成后，其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上，乳化物随之会被打散，珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。 2006年 Fluidigm公司推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR系统。随后，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪，2013年该公司又推出了升级型号QX200。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统。 商业化数字PCR平台的概述 类型 供应商 生产时间 仪器型号 分液数目 特点 芯片式 Fluidigm 2006 EP1 36,960 基于集成流体通路芯片，快速准确地将流体分成独立的单元。操作耗时，反应成本高。 2006 BioMark HD 9180 Life
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细菌耐药性检测方法-中国微生物菌种查询网
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细菌耐药性检测方法-中国微生物菌种查询网 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。也可通过以下方法进行检测： （1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。 （2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。 （3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶 （4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。 2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。 3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有： PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术 、自动DNA测序 4．特殊耐药菌检测 （1）耐甲氧西林葡萄球菌检测
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幽门螺杆菌空泡毒素VacA研究进展
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
ATCC菌种 幽门螺杆菌（Hp）是1983年由Marshall和Warren首次分离得到的一种革兰染色阴性的、螺旋状、微需氧、主要定居在人胃黏膜、引起人类消化道疾病发生发展的重要病原菌。幽门螺杆菌的感染呈全球性分布，其感染率与当地公共卫生状况有关，据报道，在西方国家大约30%～50%的成人感染Hp；在中国，其感染率更高，达50%～80%，并有报道指出人群中感染Hp的比例随年龄增长而提高，而且Hp一旦在人胃内定居，如不采取抗菌**，可以持续几十年,严重危害着人群健康。尽管大多数Hp感染者无症状，但有近似10％的感染者患上了胃十二指肠溃疡，胃癌或黏膜相关组织（MALT）淋巴瘤。1994年Hp被WHO定为第I类致癌因子，而其分泌的蛋白毒素VacA作为单一毒力因子可引起靶细胞空泡化、细胞凋亡、细胞骨架重排，最终导致细胞死亡，因此是Hp重要的毒力因子。仅仅发现于1983年的Hp现在是研究得最深入的病原体之一,现就近几年来研究较多的Hp毒力因子VacA综述如下。 1 VacA蛋白基因结构和基因型 1.1 VacA的基因结构 T.L.Cover于1993年克隆出了VacA的基因，发现其由3864个碱基对组成，编码1287个氨基酸，编码的蛋白质分子量为139kDa，此为VacA的前体分子，包括三个区域：（1）N-末端为33个氨基酸残基组成的前导信号序列；（2）中间区域为成熟的空泡毒素；（3）C-末端为50kDa的多肽，其氨基酸顺序与许多G＋细菌的外膜蛋白有同源性。在去掉N末端的信号肽，C末端的类似于IgA蛋白酶前体的肽链等修饰后，成为成熟的87kDa的VacA。该活性毒素可降解为37kDa及58kDa两个亚单位。 VacA可能是具有A-B结构的细菌毒素家族，B亚单位与靶细胞表面的膜受体结合并介导A亚单位进入胞浆，A亚单位与细胞内靶分子特异性共价结合后，导致细胞重要功能的破坏，从而发挥毒素活性［1］。 从液体培养上清中提纯的VacA是一个分子量大于900kDa的寡聚复合物，完整的VacA分子呈花瓣状或雪花状，由6～7个沿半径对称的95kDa的VacA单体组成［2］。VacA暴露于酸性pH
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细胞有丝分裂的实验操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细胞有丝割裂指数(mitotic index，MI)是指归于割裂期的细胞占总细胞数的百分率．用于表明细胞增殖旺盛的程度，也可用于检查药物对细胞增殖能力的影响。用盖玻片培育法培育细胞，做固定和染色后，镜下调查和计数1000个细胞中处于割裂期的细胞数并核算MI。 (一)材料 1．待检资料(药物)。 2．细胞培育成层的贴壁细胞。 3．试剂 甲醇、3％吉姆萨染液。 4．器材CO2培育箱、倒置显微镜、盖玻片(2．2 cm×2．2 cm，需预先清洁和灭菌处理)、塑料培育皿(3．5 cm)、载玻片、封片用盖玻片、中性树胶。 (二)试验办法 1．将细胞消化成单个细胞悬液，将细胞悬液分瓶培育，分红不加药的对照组和加人不一样剂量药物的试验组。 2．细胞传代培育的办法培育细胞，并制成浓度为105／ml的细胞悬液。 3．将清洁和灭菌处理的盖玻片放置在塑料培育皿中，将细胞悬液摇匀后接种于培育皿中，各皿中接种量一样。 4．别离于培育24 h、48ht和72h后从培育皿中取出盖玻片，在Hanks液中漂洗2～3次。 5．先用甲醇固定30 min，再用吉姆萨染液染色。晒干后用中性树胶封片。 6．油镜下或高倍镜下计数1000个细胞中处于割裂期的细胞数。 7．核算MI按下列公式核算MI。 (三)成果与分析 将对照组和药物组的试验成果绘制成直方图并加以比较，也可绘制成MI曲线进行比较： (四)注意事项 1．为了削减误差，试验者有必要了解各期割裂象细胞的形状特征，该试验从头到尾**由一人完结，当两人以上调查时，应把握一样的标准。 2．MI曲线与细胞生长曲线趋势根本相似，但不彻底一样。如果在细胞增长达饱和密壁并进入中止期后．细胞数量许多，而割裂象细胞可彻底消失。 3．细胞在盖玻片上的密度常不均匀，细胞密集区与稀疏区的割裂象细胞数目也许不一样。计数时要挑选密度近似区，以削减试验误差。
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必备技能！云序生物教你巧用IGV轻松实现基因组的可视化
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Itegrative Genomics Viewer (IGV)是由Broad研究院的研究人员开发的一款功能强大的综合性基因组学可视化工具，借助于此工具，从事生物信息的科研工作者就可以轻松的分析查看多种基因组数据。除了直观的查看序列信息及遗传密码中的序列变化或突变外，还可以查看拷贝数变化、染色质沉淀数据和表观遗传学修饰等。使用者可以选择多种显示模式，以heat map、柱状图、散点图或其他形式查看他们的数据。更为吸引人的是IGV的使用是免费的哟！ 测序数据reads通过与参考基因组比对可以直观的查看序列信息及遗传密码中的序列变化或突变，还可以查看拷贝数变化、染色质沉淀数据和表观遗传学修饰等。 前期准备工具： IGV软件 参考基因组：例人参考基因组Homo_sapiens_HG19.sorted.gtf 测序数据文件：例bam、bw等 一、IGV下载及安装 1.请打开您常用的浏览器，在http://www.broadinstiute.org/igv/ (需注册)下载IGV(Integrative Genomics Viewer)。如果您不想注册，请使用直接地址下载适用于所有平台的二进制发行版,这可能需要几分钟。 2. 下载IGV_2.3.59.zip(或任何其他版本)后，首先解压文件，双击“igv.bat”。在你自己的电脑(windows系统)上运行IGV。需要一段时间初始化IGV(链接到web，下载一些基因组注释文件)。 二、操作步骤 1. 参考基因组文件导入 在IGV软件的储存中已经包含了部分的参考基因组信息，可以在方框1中下拉选择，如果有目标基因组可以直接点击，系统将自动下载并导入；如果没有的话，可以选择Genomes→Load Genomes From Files导入本地的基因组fa文件。 图1. IGV界面 2. 测序数据的导入 以bam或bw文件类型为例，导入路径：File→Load form File, 选择bam或bw文件；注意的是bam一定要sort，而且在bam文件所在的目录下一定要有bam文件对应.bai索引文件。 bam文件排序：samtools、sort、A.bam、A.sort bam文件构建索引：samtools index A.sort.bam 导入后可以在方框2的位置选择感兴趣的染色体，也可以在
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