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Nature Cell Biology：外泌体LncRNA帮助免疫细胞“叛变”----乳腺癌恶化新机制！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
文章导读： 外泌体是细胞间传递信号的媒介，直径在30-200nm，表面具有磷脂双分子层，内部具有丰富内含物的小囊泡，其内含物包括miRNA，环状RNA，LncRNA和mRNA等。以不久前发表于Nature Cell Biology（影响因子：19）的文章为例，看一看外泌体中LncRNA的功能机制是如何研究的。 本篇文章由中山大学孙逸仙纪念医院宋尔卫、苏士成团队联合发表，首次揭示了肿瘤相关巨噬细胞（TAM）通过分泌外泌体包裹的LncRNA调控肿瘤细胞糖代谢过程。为了找到外泌体中特有且高表达的LncRNA，本文作者借助外泌体LncRNA测序，对TAM及对照组细胞分泌的外泌体和相关细胞分别进行测序，找到了在外泌体中特异性高表达的LncRNA HISLA。通过外泌体与肿瘤细胞共培养、RNA Pull Down、RIP、ChIP等手段，揭示了LncRNA HISLA通过抑制转录因子HIF-1a与PHD2蛋白结合来保证HIF-1a稳定性，即而维持肿瘤细胞有氧状态在HIF-1a信号的持续激活。反过来，处于显著无氧糖酵解状态的肿瘤细胞可分泌大量的乳酸分子，乳酸作用于巨噬细胞可显著上调巨噬细胞中HISLA表达，从而维持巨噬细胞来源的外泌体中HISLA的高丰度装载。 路线图： 框中涉及实验技术，云序提供一站式服务 理解重点： 1.TAM是一种癌症相关巨噬细胞。在遇到癌症细胞后，职能发生180度大转变，成为癌细胞的“帮凶”，参与癌细胞促生长，迁移等过程。目前已发现，TAM中LncRNA能够以外泌体为媒介参与邻近癌细胞糖酵解的过程。本文想深入探究其中的机制。本文对照组：外周血中分离的一种单核巨噬细胞（MDM）。 2. HIF-1α是一种氧传感转录因子，能够决定葡萄糖的代谢途径是氧化还是糖酵解（无氧）。HIF-1α首先被PHD2羟基化，然后被降解。在本文中发现，LncRNA HISLA竞争性与PHD2结合，从而防止HIF-1α降解，达到增强肿瘤细胞有氧糖酵解。 3. 葡萄糖作为能量代谢的原料，主要通过有氧或无氧（又叫糖酵解）方式代谢产能。而肿瘤细胞在有氧条件下发生的糖酵解，产生大量中间产物：乳酸。 正文部分： 1.T
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细胞冻存方法、步骤及注意事项！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细胞越来越受广大科研者的喜爱，但细胞不像人们想象中那么强大，在培养复苏等过程中稍有不慎就不可能导致它的死亡。而且它必须是是在无污染的条件下培养，复苏才能保证实验效果。在此百欧博伟生物技术为您详细总结细胞的正确冷冻保存方法、保存详细步骤，相关注意事项如下： 一、保存方法（主要有两个）： （1）传统方法：冷存管置于4℃10分钟→ -20℃30分钟→ -80℃16～18小时（或隔夜）→液氮槽vaporphase长期储存。-20℃不可超过1小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 （2）程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3℃/分钟之速度由室温降至（-80℃以下）-120℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。 二、步骤： （1）冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。 （2）配制冷冻保存溶液（使用前配制）：将DMSO加入新鲜培养基中，*后浓度为5～10％，混合均匀，置于室温下待用。 （3）依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液（约0.1ml）计数细胞浓度及冻前存活率。 （4）离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1～5×106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。 三、注意事项： （1）欲冷冻保存之细胞应在生长良好（logphase）且存活率高之状态，约为80–90％致密度。细胞冻存前应保证细胞的活力好，无污染 （2）冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。 （3）一定要保证DMSO的浓度是10%，冻细胞要舍得用进口的DMSO （4）注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色（以0.22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650），以5～10ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保
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一项免疫检验技术酶免疫试验的局限性分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
酶免疫试验之所以能成为临床免疫检验中的主导技术，是与它的方法上的特异性和灵敏性、操作上的简便性以及试剂的稳定性分不开的，还有很重要的一点是，其对环境没有污染威胁。 尽管如此，作为一项免疫检验技术，酶免疫试验还是有其局限性的，不但所检测的生物学体液样本如血清中有可能存在各种干扰实验的因素，而且在实验过程中，影响结果的因素也很多，尤其是进行手工的ELISA测定时。 此外，在定性ELISA测定中，阳性判定值（CUT-OFF）的建立，是在一定的统计学基础上的，相对于某个具体的受检者来说，其有可能并不具备正确性。例如，使用ELISA方法检测抗HCV及抗HIV或HBsAg，有时候，检测所得的阳性结也许并不是真正的阳性，而需要使用其他方法如重组免疫印迹（recombinantimmunoblotas—say，RIBA）、蛋白印迹（Westernbl。t，WB）或中和试验来确认，才能报告阳性。这里抗HCV和抗HIV的检测均使用病毒部分的基因工程抗原，其他一些病毒如流感病毒、腮腺炎病毒和水痘病毒等感染人体后，亦或一些自身抗体，也有可能会导致假阳性反应。 HBsAg的测定主要是弱阳性的问题，这与ELISA测定的“灰区”有关系，处于cut-off值周围亦即“灰区”的结果的可靠性通常较差，阳性当然需要确认，阴性却也未必是真，这一点在血站筛检献血员血液时是非常重要的，必须引起注意，并采取适当的措施，防止此类严重影响人们健康的传 染性疾病经输血传播，本书后面的有关章还会对此问题做详细论述。此外，免疫测定的基础是抗原抗体的特异反应，因此，如检测抗原，除了要求抗体（单抗或多抗）是特异的外，还要求待测抗原上必须存在有能与所用抗体结合的抗原决定簇，如果因为基因突变导致某些位点的不表达，或者结合位点因为某些原因被封闭或阻断，都会影响抗体与抗原的结合，造成假阴性结果。 如检测抗体，则要求所用包被抗原应尽可能包含所有的特异抗原决定簇，同时又尽可能不含有非特异的成分，这一点往往由于技术水平的限制而难以
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一体化细胞免疫荧光技术介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。 一．传统的免疫荧光实验步骤 （一）、实验材料 1. 细胞样品 2. 试剂、试剂盒： 多聚甲Quan；70% 甲醇；丙Tong；PBS；Triton ；BSA；DAPI 染液；DABCO；Tris；甘油 3. 仪器、耗材：玻片 （二）、实验步骤 细胞爬片免疫荧光实验步骤 第一天： 1. 在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3 min； 2. 用 4% 的多聚甲Quan固定爬片 15 min， PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min； 3. 0.5%Triton X-100( PBS 配制 ) 室温通透 20 min（细胞膜上表达的抗原省略此步骤）； 4. PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干 PBS，在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30 min； 5. 吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，4℃ 孵育过夜； 第二天： 6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3 min，吸水纸吸干爬片上多余液体后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20-37℃ 孵育 1 h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3 min；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。 7. 复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5 min，对标本进行染核，PBST 5 min×4 次洗去多余的 DAPI； 8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，然后在荧光显微镜下观察采集图像 二 传统免疫荧光实验主要问题 1. 爬片效果欠佳 2. 细胞和试剂用量大，成本高 3. 染液分布不均 4. 操作繁琐,费时费力 三. 一体化免疫荧光技术简介 一体化的培养室-固定-染色-成像 免疫荧光的解决方案 技术特点： 1.快速简便的样品制备,一体化培养室简化了免疫荧光染色方案 2.均匀细胞分布,通道载玻片几何结构可以产生均
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古建筑软木松旧木材内部腐朽状况阻力仪检测结果的定量分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
我国古建筑是以木结构为主的建筑体系，其主要承重构件柱、梁、檩、枋、椽等使用的都是木材。木材是生物材料，在长期的使用过程中，容易受到菌、虫等生物性危害，引起木材腐朽和虫蛀，使木结构的安全性受到威胁。很多情况下木材腐朽从木材内部开始，但由于古建筑木结构不能轻易被拆解，因而必须采用无损检测技术对木材内部的材质状况进行勘测。目前世界各国开发的无损检测或微损检测方法很多，如超声波、应力波、X-射线、γ射线、皮罗钉（Pilodyn）、阻力仪(Resistograph)检测等，其中超声波、应力波和阻力仪检测是比较常用的方法。 阻力仪是德国Rinntech公司开发的一种木材内部材质检测仪器，检测时需要将一根直径1.5mm的探针刺入木材内部，属类无损检测，是目前欧洲、美国、日本和我国台湾木结构材质状况勘查的常用设备之一[5-9]。该仪器是在检测时记录木材刺入过程中所受到的阻力，其大小随各树种密度的不同而变化。根据检测得到的阻力曲线，只能定性地判断木材内部的腐朽状况，而不能定量地评价由腐朽引起的木材物理力学性质衰减程度。 本研究利用故宫维修时替换下来的局部腐朽的旧木构件，按照腐朽等级的划分标准，将试件目视分等后，对其进行气干密度、抗弯强度和顺纹抗压强度测定，并对抗弯试件进行阻力仪检测，目的是找出检测值与物理力学性质之间的关系，实现对阻力仪检测结果的定量分析，为木结构材质状况的定量评价提供科学依据。 1 材料与方法 1.1 试验材料 试验试材取自故宫武英殿前殿维修时拆卸下来的单双步梁瓜柱局部腐朽的旧木构件，木材树种鉴定结果为软木松（Pinus sp.）。试材概况见表1。武英殿始建于明朝永乐年间，距今已有600多年的历史。清同治八年（公元1869年），武英殿被火焚，烧毁正殿、后殿、殿门、东配殿和浴德堂等建筑共37间，同年重建[10]。光绪二十六年（公元1900年），武英殿前殿、后殿再次被焚。由此推测本研究使用的材料是1869年或1900年修建时所用的木材，距今约100~13
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《Nature》重磅：蛋白质组发现明星分子KRAS为胰腺癌“充电”新机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：蛋白质组，SILAC，KRAS，癌症 来自德州大学的Giulio Draetta教授及其同事发现胰腺癌细胞表面的一种名为syndecan-1(SDC1)的蛋白质可以响应胞内KRAS的信号，并促进巨噬细胞的破坏作用。这项研究发表于最新的《Nature》杂志。 Letter | Published: 27 March 2019 Syndecan 1 is a critical mediator of macropinocytosis in pancreatic cancer 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1062-1 肿瘤细胞有恶性无限增殖能力，而这种能力需要大量的能量来支持。很显然，常规的能量代谢频率并不能满足贪婪的肿瘤细胞，它需要借助巨噬破坏其他正常细胞才能满足其自身的能量供应。这种调控巨噬获得能量的机制尚不明确，是目前研究热点之一。 胰腺导管腺癌（PDAC）是一种恶性程度很高，诊断和**都很困难的消化道恶性肿瘤。90%胰腺导管癌中存在Kras突变。这种突变会通过尚不明确的机制激活肿瘤微环境的巨噬细胞，并促进巨噬细胞的胞吞作用。 为了准确地找到胰腺导管腺癌的代谢，Giulio Draetta团队发起了挑战。他们构建了Kras开放和关闭状态下的模型，并通过蛋白组学技术，广泛筛选与研究KRAS相关的细胞表面蛋白，以期寻找**胰腺癌的新靶点。 探索攻略 实验材料：PDAC小鼠模型细胞-- Kras OFF vs Kras ON 1、定量蛋白组分析Kras信号传导带来的变化 为了探讨Kras信号传导带来的细胞表面蛋白表达变化，研究团队利用SILAC定量蛋白质组技术比较了Kras OFF与Kras ON差异。此次分析共获得221个差异表达的蛋白，其中196个蛋白上调，25个下调。 2、生信分析讨论功能与通路 IPA（Ingenuity pathway analysis）分析显示，许多上调表达蛋白参与PDAC被激活的生物过程，包括轴突导向信号通路，这个结果支持了KRAS*是PDAC分子重编程的主要驱动因素的观点。 3、锁定关注蛋白 研究人员选择了在人源PDAC细胞系中同样存在的110个蛋白，以及37个在细胞表面高表达的基因，构建了一个shRNA文库，并以此构建小鼠
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客户文献 | 首篇梅毒患者血清的非靶代谢组学研究发表！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：非靶代谢，诊断标志物，梅毒血清，中科新生命 梅毒是世界范围内一种常见的性传播疾病，致病病原体是梅毒螺旋体，2017年，中国疾控中心报告梅毒新发病例47.5860万例，死亡45人，在所有乙类传染病中排名第三位。 今天小编要为各位老师解读一篇APT客户厦门大学附属中山医院杨天赐课题组最近发表的文献，是首篇对梅毒患者进行代谢组学研究的文章，并筛选到了可以用于梅毒诊断的标志物，其中中科新生命提供非靶向代谢组学检测。 梅毒的诊断和发病机制仍是临床研究的难点。目前梅毒的诊断主要依赖血清学检测(包括非密螺旋体和密螺旋体抗体检测)，血清学检查的假阴性结果以及该方法的局限性可能阻碍梅毒的及时诊断和**，科学家们仍在寻找更敏感、更特异的梅毒诊断标志物。 在本研究首次利用非靶代谢组学方法寻找梅毒患者血清中代谢诊断标志物。 Analysis of Serum Metabolite Profiles in Syphilis Patients by Untargeted Metabolomics 2019 IF=4.287 原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jdv.15530 研究材料：血清样本，20例梅毒患者，20例健康人 研究结果： 01、质控评价 代谢的个体化差异大，生物学重复数多，且不做混样，因此对仪器稳定性的要求高。通过QC样本的质控评价可以对仪器的稳定性进行评价，从而判断数据质量的好坏。 通过PCA分析，可以看到图中所有的QC样本（蓝色的点）都紧密地聚集在一起，表明实验过程中仪器稳定性良好，数据可靠。 02、血清代谢组学结果 基于UPLC-Q-TOF/MS技术，总鉴定到2890个特征峰，通过PLS-DA、层次聚类热图分析表明，梅毒患者和健康组在代谢水平上有着明显得分离趋势。 03、筛选潜在生物标志物 满足VIP>1，P
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接二连三，看大牛如何做有望实现临床转化的大队列研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
代谢组学技术的兴起加快了生物标志物的筛选工作，每年都有大量的文献发表。很遗憾的是绝大数文章的研究队列小规模较小，只是属于前瞻性的研究，离真正走入临床应用还有很长一段距离。 小编注意到国内在肝癌、冠心病、结直肠癌等领域已经有了多篇大规模的报道，其中中国药科大学临床代谢组学中心主任齐炼文教授一直走的是大队列研究路线。投入大量时间、金钱的背后动机，无外乎是希望实现科研到临床应用的转化。小编今天想跟给位老师介绍齐炼文教授团队接二连三发表的几篇大队列研究。 2016年，中国药科大学临床代谢组学中心主任齐炼文教授等人在国际心血管领域顶级期刊Journal of the American College of Cardiology发表文章《Comprehensive Metabolomic Characterization of Coronary ArteryDiseases》。原文链接：http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZJJJ201604042.htm 研究团队利用UPLC-Q/TOF-MS对2324份血浆临床样本进行了非靶向代谢组学分析，鉴定到89个与冠心病发生发展表型特征密切相关的差异代谢物，其中包括磷脂相关代谢通路抑制、氨基酸代谢增强、酰基肉碱类代谢通路激活、胆汁酸代谢减弱等多种代谢紊乱特征。 进一步从差异代谢物库中筛选出12组灵敏度高（>85%）、专属性强（>85%）的代谢标志物群，绘制了冠心病及其在不同临床阶段（冠脉硬化症、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗死）的血浆代谢组学特征谱。ROC分析显示，12组代谢标志物群诊断能力良好。 在16年文章的基础上，2017年齐炼文教授等人在心血管领域顶级期刊Circulation上发表文章《Functional Metabolomics Characterizes a Key Role for N-Acetyl-neuraminic Acid in Coronary Artery Diseases》。原文链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29212895 在16年研究的基础上，研究人员发现36种代谢物与冠心病的发生发展密切相关，随后通过靶向代谢进一步证实N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac) 在血浆中的水平与冠心病事件呈显著
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蛋白质组学最新成果——胰腺癌**靶点和诊断标志物的突破性发现
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：肿瘤微环境，磷酸化蛋白质组，分泌蛋白质组，IP-MS，PRM，ELISA 胰腺癌是全球范围内死亡率最高的一种癌症，其发生率高、生存期短的特点而被称为“癌王”。胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿，早期诊断困难、进展快，发现时已经进入中晚期且大多已经转移，再加上对化疗药物很强的耐药性和对放射疗法不敏感导致**效果非常差，总体5年生存率徘徊在5％左右。因此，开发有效的靶向药物和能用于早期检测的高灵敏度的生物标志物成为业内科学家不懈努力的研究方向。 长期以来，多数研究都关注着肿瘤细胞本身的特性。经典理论认为肿瘤是肿瘤细胞异常增殖形成的新生物。这一理论强调了肿瘤细胞本身的作用，而忽略了基质微环境与肿瘤细胞之间的相互作用及其对肿瘤的影响，早在100多年以前，Stephen Paget提出了著名的“种子与土壤”的概念，肿瘤微环境就像是一个小的生态环境，由于其特殊的理化性质及内含各种生长因子、细胞趋化因子以及蛋白水解酶等成分，与肿瘤细胞生长增殖、侵袭、粘附、血管生成以及抗放射化疗，促使恶性肿瘤产生有紧密联系。因此，2011年著名肿瘤学者Hanahan和Weinberg教授发在《CELL》发表综述，指出肿瘤微环境与肿瘤之间存在密切的联系，且把肿瘤微环境作为癌症的十大重要特征之一，暗示微环境具有潜在的肿瘤**和诊断的开发潜力。 无独有偶，4月17日南方科技大学田瑞军教授与美国Salk研究所Tony Hunter院士合作在国际顶级学术期刊《Nature》上发表了题为Targeting LIF-mediated paracrine interaction for pancreatic cancer therapy and monitoring的研究成果，报道了针对胰腺癌功能蛋白质组学研究最新工作，研究者发现胰腺星状细胞（PSCs）和胰腺癌细胞间的关键通讯因子---白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF），分析其调控胰腺癌发生发展机制，验证其作为胰腺癌**靶点和临床诊断生物标志物的可行性。 研究者利用开发的肿瘤微环境细胞间信号转导的整合蛋白
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Nature重磅：首次新发现肿瘤脂代谢的可塑性
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：脂代谢，脂质组，肿瘤，生物标志物 大多数肿瘤具有异常活化的脂质代谢能力，使其能够合成，延长和去饱和脂肪酸，以支持细胞增殖。不饱和脂肪酸的合成需要硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD），并且在之前的研究中发现SCD基因在前列腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌等中有过量表达。然而近期发表在《Nature》上的一篇研究却表明肝癌、肺癌细胞不受SCD抑制影响，还存在可替代途径。 Evidence for an alternative fatty acid desaturation pathway increasing cancer plasticity 原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-019-0904-1 研究结果： 01、不同癌细胞对SCD的依赖程度不一样 研究人员采用SCD抑制剂对肝细胞癌(HUH7)、肺癌(A549和H460)、前列腺癌(DU145) 和乳腺癌(MDA-MB-468和T47D) 细胞系进行处理后，却观察到这些不同的细胞系对SCD抑制剂具有不同程度的敏感性，推测部分SCD非依赖型的癌细胞（肝癌、肺癌）可能存在替代性脂肪酸去饱和途径。 02、SCD抑制引起脂肪酸sapienate大量合成 研究人员推断这种替代途径会合成不常见的单不饱和脂肪酸，因此对C12~C18的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸进行过了检测，观察到SCD抑制剂处理后，SCD非依赖型的癌细胞中脂肪酸sapienate(cis-6-C16:1)含量上升。 03、SCD抑制引起脂肪酸sapienate大量合成 Sapienate是人体皮脂的主要成分，是皮脂细胞代谢的特异性标志物。皮脂腺细胞通过棕榈酸产生sapienate，SCD抑制剂处理后，SCD非依赖性或部分依赖的肝癌、肺癌细胞中sapienate与棕榈酸的比率更高，表明合成sapienate的去饱和酶活性升高。在肝癌异种移植模型、二乙基亚硝胺、基因诱导的肝癌小鼠模型中，同样也发现了SCD抑制剂处理后合成sapienate的去饱和酶活性升高。 04、癌细胞利用FADS2来合成sapienate FADS2为皮脂细胞合成sapienate的去饱和酶。癌细胞是否也是利用FADS2来合成sapienate呢？研究人员发现SCD非依赖性或部分依赖的肝癌、肺癌细胞中FADS2基因表
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细菌鞭毛染色的方法及注意事项！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细菌鞭毛染色的方法及注意事项！ 目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tar and feather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。 1. 碱性复红法和副品红法 1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。 2. 结晶紫法，又称Ryu法 1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想. 3. 维多利亚蓝B法 1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7m
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微生物接种、分离纯化和培养技术！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关于微生物接种、分离纯化和培养技术！ （一）接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３ 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中
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利用Handy PEA和氧电极阐明干燥发菜补水后光合活性恢复的机理
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
欢迎点击「汉莎科技集团」↑关注我们！ 发菜（拉丁学名：Nostoc flagelliformeBorn. et Flah.），中文学名：发状念珠藻，是蓝藻门念珠藻目的一种藻类，广泛分布于世界各地（如中国、俄罗斯、索马里、美国等）的沙漠和贫瘠土壤中，因其色黑而细长，如人的头发而得名，可以食用。 发菜是一种能固氮的光合原核生物。它的丝状体中主要有两种细胞：一种是营养细胞，呈绿色，进行光合作用——吸收、释放、合成有机物质；另一种是异形细胞，体积较大，细胞壁较厚，颜色较淡，主要进行固氮作用——把空气中的氮气还原成氨，合成氨基酸。 由于发菜能用无机碳和无机氮合成有机碳和有机氮，对改良荒漠土壤，繁衍其他生物有重要意义。发菜被誉为“开发荒漠的先锋”。 发菜能在干燥状态下存活好几年，而且补水照光后其光合活性即可恢复。然而光质对恢复其光合活性的影响及潜在机制仍未解决。 近期华中师范大学邱宝胜课题组利用英国Hansatech公司制造的Handy PEA植物效率分析仪和Chlorolab-2氧电极测定了不同光质和光强对发菜补水后光合活性恢复过程中OJIP曲线、光合放氧速率和电子传递活性的变化，并结合膜分离和免疫印迹分析等技术深入探讨了不同光质和光强对发菜补水后光合活性恢复的影响机理。 图1 发菜补水过程中不同光质和光强对Fv / Fm的影响 该研究发现将野外收集的发菜暴露于≥2的不同光质的光强下，PSⅡ的恢复速度如下：红＞绿＞蓝≈紫。进一步降低光强，发现弱红光在发菜再水化的过程中促进PSⅡ的恢复。 OJIP曲线和放氧速率表明放氧复合体是弱红光促进PSⅡ恢复的关键位点。受损的D1蛋白在脱水过程中存储在类囊体膜上，再水化过程中其降解并重新合成。弱红光诱导PsbO与类囊体膜相互作用。 图2 发菜补水过程中红光和蓝光对电子传递活性的影响 因此，弱红光在发菜再水化过程放氧复合体的激活和PSⅡ的功能恢复中起着重要的作用。在发菜的干旱栖息地，微弱的红光可以刺激休眠的发菜在
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《Cell Stem Cell》巧用单细胞测序解析生发过程的深层次调控机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
单细胞转录组测序是这两年来非常流行的高通量组学研究工具，然而，是不是所有的研究都适合用该方法？是不是所有的问题都可以通过该方法来解释？这是一个值得探讨的问题。从现有的研究报道来说，单细胞转录组学研究很好地解决了细胞图谱，发育过程等重要的生物学问题。但是在相对比较传统的研究方向，是否也能利用单细胞转录组测序方法来使研究更加深入和出色？ 本期小编通过对近期发表在《Cell Stem Cell》上的文献的重点内容解析，来领略下生发机制研究中，单细胞转录组学的巧妙运用，如何为解释内在的生发关键时期的调控通路提供了直接证据。 研究背景 哺乳动物毛发生命周期是由毛囊（HF）经历了由生长期（anagen）,退化期（catagen）和休止期（telogen）为代表的三个重要精细调控阶段。来自毛囊干细胞（HFSCs）的角质细胞接受到如Wnt或者Shh等通路的激活信号后，会在生长期促进细胞增殖；在休止期接受到如BMPs等抑制信号时，会促进细胞静止过程。 JAK-STAT通路调控休止期静止的潜在上游调控信号被认为是一些细胞因子家族的因子。制瘤素（OSM）显示出抑制plucking诱导的生长期，而IL-6可以诱导毛囊从生长期进去退化期。OSM和IL-6属于gp130-dependent家族的一类细胞因子，可诱导LIF，CT-1，CNTF的产生。在本研究中，研究人员发现OSM抑制JAK-STAT通路诱导的毛发生长过程，可能是作为一种内源的抑素维持休止期。通过进一步的单细胞测序和验证，发现OSM是由一类TREM2+的巨噬细胞在休止期早期产生来影响毛发生长周期的过程。 图1 研究主要结果展示 研究主体 为研究OSM在毛发生长过程中的调控作用，本研究先进行了一系列的传统分子生物学实验，得到以下几个结论： 1. OSM通过OMSR-JAK-STAT信号通路维持毛囊处于休止期； 2. OSMRβ和其共受体gp130在早期和中期休止期时，在HFSCs细胞凸起与胚芽中，共定位激 活pSTAT5； 3. OSMRb信号通路的干扰缩短了第二个休止期周期； 4. 在休止期中期干扰OMSRβ和STAT5表达促进HFSC
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常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！ 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离
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