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RNA探针的合成方法和合成效率检测
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
RNA探针的合成方法和合成效率检测 在RNA的杂交检测实验中，应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果，与DNA 探针相比，检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说，RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度mRNA，以及原位杂交的核酸定位检测等应用，RNA探针是一种理想选择。RNA探针同样也适用于Southern blots，文库筛选，斑点杂交等应用。但是，在RNA探针制备过程和整个杂交实验过程中，必须注意RNAse的防污染操作。 制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。 另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。 对于原位杂交的应用，为了更好地进行杂交反应的质控，建议在制备反义链探针的同时，也制备正义链的探针，用作杂交实验的阴性对照。在原位杂交实验前，首先通过Northern blots实验验证探针的有效性和目标转录子在不同样本中的表达模式，有助于简化后续原位杂交实验的优化流程和结果解释。 模板制备和探针标记 以地高辛（DIG）的探针标记方法为例，罗氏DIG Northern Starter Kit的操作指南中建议，如果直接通过PCR方法制备DNA探针模板，反义链端的反向扩增引物应包括T7 RNA聚合酶的启动子序列5'-AATACGACTCACTATAGG-3'（后续通过T7 RNA转录），或T3启动子序列5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3'（通过T3 RNA转录）。 通过此方法获得的特定PCR产物，无需经过纯化，即可用于下游探针合成。对于地高辛标记系统，在体外转录合成的探针片段中，大约每隔3个UTP位点会插入一个DIG标记的UTP分子（DIG-11-UTP
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显微镜测微尺使用方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
相信大多数使用者对显微测微尺的使用并不是十分了解和熟悉，所以我将显微测微尺的使用说明整理一下，现在放出来供广大显微镜使用者学习，希望对他们有所帮助。 显微测微尺是用来测量显微镜视场内被测物体大小、长短的工具, 包括目镜测微尺(分划目镜)和测微台尺。用时需两者配合使用。目镜测微尺系在目镜的焦面上装有一刻度的镜片而成, 其每一刻度值为0.1mm, 测微台尺为一特制的载玻片, 其中央有刻尺度, 每一小格的值为0.01mm, 使用时, 先将目镜测微尺插入目镜管, 旋转前透镜将目镜内的刻度调清楚, 在把测微台尺放在载物台上, 调焦点到看清楚台尺的刻度。观察时先将两者的刻度从“0”点完全重叠, 在向右找出两尺又在何处重叠, 然后记下两尺重叠的格数, 以便计算出测微尺每小格在该放大率下的实际大小。测量时不再用测微台尺, 如改变显微镜的放大赔率, 则需对目镜测微尺重新进行标定. 通过以上的显微测微尺的简单介绍，不知显微镜使用者学会了没有？如果还有不懂的地方，也可以继续关注我以后的文章。
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Elis实验结果管理
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
1．固相载体的选择 载体的种类很多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。 聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。 由于聚苯乙烯的工艺过程不够稳定,造成各批次差异较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。检查方法： ⑴ 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，最后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的±10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另一侧孔OD值相差较大均属不合格。 ⑵ 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。 板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应弃去不用。 2．载体的吸附条件 载体的吸附均为物理吸附。吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间等。 较好的吸附条件是：离子强度为0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为1µg/ml~100µg/ml，4℃过夜或37℃3h。 3．酶标抗体使用浓度的确定 于聚苯乙烯板孔中加足够量的抗体包被,温育一定时间，冲洗、把酶标结合物倍比稀释，每个稀释度加2孔,温育、冲洗、再加底物显色、比色。以OD值为纵坐标,酶标结合物的稀释度为横坐标，制作曲线。找出OD值为1时，相对应的酶标抗体稀释度为最适酶标抗体稀释度。 这个稀释度是指在这种条件下的最适稀释度，换个条件就不是最适的了。如1﹕400的酶标抗体稀释度温育6h可与1︰6 400稀释度温育24h结果相同。所以一旦条件确定之后，就不要变更，以保证结果的重复性和相对的准确性。 此最适酶标抗体稀释度可做为工作浓度，也可提高半个
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志贺氏菌检测新国标厌氧条件增菌的解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
2012年5月17日，中华人民共和国卫生部颁布GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验 志贺氏菌检验方法》，新国标将于2012年7月17日起实施。 该标准实施之日起，原GB/T4789.5-2003标准作废。 解读新国标GB4789.5-2012 为了提高食品中志贺氏菌检出率，降低操作者的操作要求，增菌过程的调整是本次新标准最大的变动之处。 两份国标方法之间增菌部分的主要区别如下表所示： GB4789.5-2003 GB4789.5-2012 增菌培养基 GN增菌肉汤 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素 取样操作 无菌均质器或研钵 无菌均质器或拍击式均质器 增菌培养条件 37℃，有氧培养6~8小时 41.5℃，厌氧培养16~20小时 …… …… …… 更改增菌培养方式的最终目的是最大程度消除食物样品中的杂菌背景对于检测培养的影响。 1、厌氧环境41.5℃培养，可排除需氧菌和大部分不耐热的厌氧菌与兼性厌氧菌干扰； 2、使用志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素进行增菌，可排除革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性肠杆菌（如变形杆菌等）的干扰； 减少杂菌背景的同时，也降低了杂菌在增菌过程中对于数量很少的志贺氏菌的竞争抑制作用，可有效地提高志贺氏菌的扩增量，有助于进一步的分离与鉴定。 厌氧增菌的解决方案 不同于常规厌氧培养，新国标中的增菌培养是在无菌三角烧瓶或无菌匀质袋中进行，故厌氧袋因容积限制而无法使用，故我们推荐如下解决方案： 解决方案一： 每日样品检测量80-120份的实验室，建议配备AW500SG/TG全能型厌氧工作站。 型号 AW500SG/TG 最大培养容量： 120只（250ml标准三角烧瓶） 80 只（500ml标准三角烧瓶） 传输舱容量： 6只（250/500ml标准三角烧瓶） 解决方案二： 每日样品检测量70~90份的实验室，建议配备AW400SG/TG全能型厌氧工作站。 型号 AW400SG/TG 最大培养容量： 90只（250ml标准三角烧瓶） 70只（500ml标准三角烧瓶） 传输舱容量： 6只（250/5
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2012北京生物医学新技术与应用系列讲座PDF资料下载
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
2012年6月29-30日，由中国生物器材网、北京亦庄生物医药园主办，北京旷博生物技术有限公司承办的“2012北京生物医学新技术与应用系列讲座暨细胞分析与免疫检测新技术专场”于北京亦庄生物医药园成功召开。 本次讲座历时2天，由15家业内知名企业及11位特邀专家做了精彩的报告。报告内容主要围绕流式新技术、细胞成像技术新进展、microRNA在免疫检测的中的研究和应用、特异性T细胞免疫检测技术和多因子高通量免疫检测等主题展开。精彩的演讲引起在场专家学者的热烈反响，应广大师生的强烈要求，现将讲座PDF内容公布供下载学习使用，请勿转载用于其他用途。 友情提示： 1、请在注册“个人用户”后再下载讲座PDF资料。点击此处立即注册 2、由于部分文件较大，请耐心等待下载完成。 3、部分讲座资料由于不便公开将暂不提供下载。 相关链接：
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血小板功能检测在临床中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
血小板在参与血栓形成和动脉粥样硬化中起重要作用。TXA2、5HT引起血管收缩：PDGF、β-TG、PF4刺激平滑肌细胞引起动脉硬化，GPIIb/IIla纤维蛋白原受体活化引起血小板聚集，与凝血系统活化形成的纤维蛋白构成血小板栓子。 血小板粘附、聚集、释放产物、花生烯酸代谢、促凝作用及受体表达参与上述过程。 在体内，狭窄血管产生的高切应力，各种细胞释放的产物以及内皮损伤等因素均可构成激活血小板的刺激因素。除上述环境因素外，血小板自身的某些特性改变，譬如：基因多态性，在发生血栓形成中的意义也是近年来渐为人们重视的新课题。 一、血小板功能检测项目 出血时间、粘附性、聚集性、释放产物、花生四烯酸代谢产物、胞浆游离钙水平测定、凝血活性、膜糖蛋白检测、基因多态性和突变。 常用的检测功能的方法为：血小板聚集性测定(比浊法、阻抗法、循环血小板聚集体、自发性血小板聚集)，近年来，流式细胞仪、PFA-100分析及激光衍射法检测微小聚集体也逐渐地进入临床或临床前阶段。 比浊法测定血小板聚集是应用较广泛的指标，可以用于遗传性血小板疾病诊断指标，也可以作为血栓性疾病中评估其病理反应，指导抗栓药物的应用以及作为抗血小板药物监测之用。在比浊法的应用中，有几项关键问题应予以注意：(1)血液采集与分离。(2)诱导剂应用:种类、浓度。(3)正常值的选定。 流式细胞仪可以检测血小板功能、代谢、尘化及受体表达，而微小聚集体的形成作为血栓形成的早期敏感指标采用激光衍射法的测定也正在评估中，反映体内全血状态下的血小板阻抗法以及血小板内钙离子水平的检测在临床研究中显示其意义。 二、血小板功能检测的临床应用 1、出血性疾病 分遗传性和获得性二类，采用常规的血小板聚集试验对遗传性血小板疾病即可作出初步诊断。 2、血栓性疾病 大多数血栓性疾病均可以检测到血小板反应性增高，(这对疾病的病理过程，指导疾病**均有一定；意义，许多指标在疾病中的意义也作比较研究，一些分子标志
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B Cell Receptor 信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
B cells produce immunoglobulins (Ig, antibodies) that specifically bind antigen molecules. B cells first produce a membrane-bound form of immunoglobulin, the B cell receptor, as part of B cell differentiation. Each B cell expresses one immunoglobulin but the population of B cells in each individual display a wide variety of antigen specificity, with each cell expressing Ig on its surface as part of the B cell receptor complex. When the B cell receptor binds to antigen, it initiates a signal through other proteins non-covalently associated with it in the B cell receptor complex, the Ig-alpha (CD79a) and Ig-beta (CD79b) chains. The signal initiated by binding of antigen to the B cell receptor complex causes growth and proliferation of the B cell and the creation of an amplified clone of effector cells that secrete the antigen-specific immunoglobulin. Activation of the B cell receptor by antigen also results in the production of memory cells that persist in circulation to produce a more rapid immune response after future challenges by the same antigen. 本信号转导涉及的信号分子主要包括：BCR，mlg，CD19，Ag，CRALChannel，Orai1，Lyn，Ezrin，Syk，SHP-1，SHP-2，SHIP，PTEN，Gab，BACP，Shc，Dok-3，PI3K，PIR-B，Csk，clathrin，Cbp/PAG，Cbl，p38，p70，p85，p110，CD19，CD22，CD40，CD45，Btk，Bam32，PLCγ2，LAB，BLNK，GRB2，SOS，RhoA，Akt，cdc42，Vav，HS1，Pyk2，Rsc，RapL，Riam，Rap，SOS，Rss，c-Raf，MEK1，MEK2，Erk1，Erk2，GRP，Dok-1，IP3R，STIM1，PKC，TAK1，CARMA1，Bcl10，MALT1，IKK，p38，IκB，NF-κB，CaM，GSK-3，mTOR，S6K，Calclneurln，NFAT，MEKK8，MKK3，MKK4，MKK6，MKK7，JNK1，JNK2，Ca
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eIF2的调控信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
mTOR可对细胞外包括生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答。它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。 正常情况下，结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚体复合物，是小GTP酶Rheb(Ras-homolog enriched in brain)的抑制剂，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情况下抑制mTOR的功能。当Akt活化后，它可磷酸化TSC-2的Ser939和Thr1462，抑制了TSC-1/TSC-2复合物的形成，从而解除了对Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活。活化的mTOR通过磷酸化蛋白翻译过程中的某些因子来参与多项细胞功能，其中最主要的是4EBP1和P70S6K。 在整个PI3K/Akt/mTOR信号通路中，有一条十分重要的负反馈调节剂就是10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)。PTEN是一个肿瘤抑制基因，位于人染色体10q23。它有一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域，在这条通路中可以将PI-3，4-P2与PI-3，4，5-P3去磷酸化，从而负调节PI3K下游AKt/mTOR信号通路的活性。 本信号转导涉及的信号分子主要包括PKR，PERK，GCN2，HR1，PP1，GADD34，eIF2-GDP，eIF2-GTP，eIF2B，GSK-3β，NCK，eIF1，eIF5，43S等。 点击图中信号分子，查看详细通路图及产品（抑制剂，抗体，磷酸化抗体，检测试剂盒，重组蛋白等）:
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eIF4和p70 S6K的调控信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
mTOR可对细胞外包括生长因子、胰岛素、营养素、氨基酸、葡萄糖等多种刺激产生应答。它主要通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现对细胞生长、细胞周期等多种生理功能的调控作用。 正常情况下，结节性脑硬化复合物-1(TSC-1)和TSC-2形成二聚体复合物，是小GTP酶Rheb(Ras-homolog enriched in brain)的抑制剂，而Rheb是mTOR活化所必需的刺激蛋白，因此TSC-1/TSC-2在正常情况下抑制mTOR的功能。当Akt活化后，它可磷酸化TSC-2的Ser939和Thr1462，抑制了TSC-1/TSC-2复合物的形成，从而解除了对Rheb的抑制作用，使得mTOR被激活。活化的mTOR通过磷酸化蛋白翻译过程中的某些因子来参与多项细胞功能，其中最主要的是4EBP1和P70S6K。 在整个PI3K/Akt/mTOR信号通路中，有一条十分重要的负反馈调节剂就是10号染色体上缺失与张力蛋白同源的磷酸酶基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10, PTEN)。PTEN是一个肿瘤抑制基因，位于人染色体10q23。它有一个蛋白酪氨酸磷酸酶结构域，在这条通路中可以将PI-3，4-P2与PI-3，4，5-P3去磷酸化，从而负调节PI3K下游AKt/mTOR信号通路的活性。 本信号转导涉及的信号分子主要包括IRS-1，PI3K，PIP3，PDK1，PTEN，Akt，TSC1，TSC2，Rheb，mTOR1，p70 S6K，4E-BP1，S6，PDCD4，eIF4B，eIF4E，eIF4A，eIF4G，eIF4F，MNK，PABP，PAIP1，PAIP2，43S，48S，LKB1，AMPK，RagA/B，RagC/D，GSK-3，Wnt，LRP，Frizzled，Gαq/o，Dvl，Erk，p38 MAPK，p90 RSK，GβL，Raptor，DEPTOR，Sin1，PRR5，Rictor等。 点击图中信号分子，查看详细通路图及产品（抑制剂，抗体，磷酸化抗体，检测试剂盒，重组蛋白等）：
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G蛋白偶联受体信号通路激活的MAPK/Erk信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
研究证实，受体酪氨酸激酶、G蛋白偶联的受体和部分细胞因子受体均可激活ERK信号转导途径。如：生长因子与细胞膜上的特异受体结合，可使受体形成二聚体，二聚化的受体使其自身酪氨酸激酶被激活；受体上磷酸化的酪氨酸又与位于胞膜上的生长因子受体结合蛋白2（Grb2）的SH2结构域相结合，而Grb2的SH3结构域则同时与鸟苷酸交换因子SOS（Son of Sevenless）结合，后者使小分子鸟苷酸结合蛋白Ras的GDP解离而结合GTP，从而激活Ras；激活的Ras进一步与丝／苏氨酸蛋白激酶Raf-1的氨基端结合，通过未知机制激活Raf-1；Raf-1可磷酸化MEK1／MEK2（MAP kinase／ERK kinase）上的二个调节性丝氨酸，从而激活MEKs；MEKs为双特异性激酶，可以使丝／苏氨酸和酪氨酸发生磷酸化，最终高度选择性地激活ERK1和ERK2（即p44MAPK和p42MAPK）。ERKs为脯氨酸导向的丝／苏氨酸激酶，可以磷酸化与脯氨酸相邻的丝／苏氨酸。在丝裂原刺激后，ERKs接受上游的级联反应信号，可以转位进入细胞核。因此，ERKs不仅可以磷酸化胞浆蛋白，而且可以磷酸化一些核内的转录因子如c-fos、c-Jun、Elk-1、c-myc和ATF2等，从而参与细胞增殖与分化的调控。另外，ERK还可以磷酸化ERKs通路的上游蛋白如NGF受体、SOS、Raf-1、MEK等，进而对该通路进行自身的负反馈调节。还有研究发现，ERKs可磷酸化胞浆内的细胞骨架成份，如微管相关蛋白MAP-1、MAP-2和MAP-4，参与细胞形态的调节及细胞骨架的重分布。 本信号转导涉及的信号分子主要包括Dynamin，β-Arrestin，Src，GRK2，PLCβ，Giβγ，PI3Kγ，MP，Src-like，PKC，RTKs，GRB2，PYK2，FAK，Integrins，RACK1，Gαq，GTP，RGS，AC，Gαs，CaMKII，CaMKIV，Ras-GEF，SOS，Ras，GAP，GRP，GRF，Syn，EPAC，PKA，β-Arrestin1，MEK，Erk，c-Raf，JNK3，Rap1，B-Raf，IMP，MEK1，MEK2，C-TAK1，KSR，Erk1，Erk2，TH，p90RSK，PEA-15，MKP-3，cPLA2，Synapsins，cdc25，FoxO3，MSK1，MSK2，MAPKAPK2等。 点击图中信号分子，查看详
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Jak/Stat信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
JAK-STAT信号通路是近年来发现的一条由细胞因子刺激的信号转导通路，参与细胞的增殖、分化、凋亡以及免疫调节等许多重要的生物学过程。与其它信号通路相比，这条信号通路的传递过程相对简单，它主要由三个成分组成，即酪氨酸激酶相关受体、酪氨酸激酶JAK和转录因子STAT。 信号传递过程如下：细胞因子与相应的受体结合后引起受体分子的二聚化，这使得与受体偶联的JAK激酶相互接近并通过交互的酪氨酸磷酸化作用而活化。JAK激活后催化受体上的酪氨酸残基发生磷酸化修饰，继而这些磷酸化的酪氨酸位点与周围的氨基酸序列形成“停泊位点”（docking site），同时含有SH2结构域的STAT蛋白被招募到这个“停泊位点”。最后，激酶JAK催化结合在受体上的STAT蛋白发生磷酸化修饰，活化的STAT蛋白以二聚体的形式进入细胞核内与靶基因结合，调控基因的转录（如图5）。值得一提的是，一种JAK激酶可以参与多种细胞因子的信号转导过程，一种细胞因子的信号通路也可以激活多个JAK激酶，但细胞因子对激活的STAT分子却具有一定的选择性。例如IL-4激活STAT6，而IL-12却特异性激活STAT4。 本信号转导涉及的信号分子主要包括：IL-6，gp130，SHP1，SHP2，SOCS，SOCS3，GRB2，Shc，Ras，CIS，Jak，Stat，Stat3，Raf，MEK，Erk，PI3K，Akt，mTOR，Mcl-1，p120，ras-GAP，EGF，EGFR，Src，PIAS，SUMO，TF，N-PTP，CIS，SOCS，Mcl-1，APPs，TIMP-1，Pim-1，c-Myc，cytokines，TFs等。 点击图中信号分子，查看详细通路图及产品（抑制剂，抗体，磷酸化抗体，检测试剂盒，重组蛋白等）：
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PKC信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
PKC系统，又称为磷脂肌醇信号途径。系统由三个成员组成：受体、G蛋白和效应物。Gq蛋白也是异源三体，其α亚基上具有GTP/GDP结合位点，作用方式与cAMP系统中的G蛋白完全相同。该系统的效应物是磷酸肌醇特异的磷脂酶C-β（phosphatidylinositol-specific phospholipase C-β， PI-PLCβ），此处的β表示一种异构体。 在这一信号转导途径中,膜受体与其相应的第一信使分子结合后，激活膜上的Gp蛋白(一种G蛋白),然后由Gq蛋白激活磷酸脂酶Cβ (phospholipase Cβ, PLC), 将膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(phosphatidylinositol biphosphate, PIP2)分解为两个细胞内的第二信使：二酰甘油( diacylglycerol, DAG)和1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)。IP3动员细胞内钙库释放Ca2+到细胞质中与钙调蛋白结合，随后参与一系列的反应；而DAG在Ca2+的协同下激活蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)，然后通过蛋白激酶C引起级联反应，进行细胞的应答, 故此将该系统称为PKC系统,或称为IP3、DAG、Ca2+信号通路。 静息状态时，G蛋白的α亚基上结合的是GDP，所以没有活性，磷脂酶C也是处于非活性状态。第二信使IP3/DAG还是以前体PIP2存在。内质网上的Ca2+离子配体闸门通道是关闭的，蛋白激酶C也是以可溶的非活性状态存在于细胞质中。 信号分子 与该系统受体结合的信号分子有各种激素、神经递质和一些局部介质 该途径有有三个第二信使：IP3、DAG、Ca2+.产生过程包括磷脂酶C的激活、IP3/DAG的生成、Ca2+的释放。 蛋白激酶C的激活涉及一系列复杂的反应过程，是三种第二信使共同作用的结果。 本信号转导涉及的信号分子主要包括：PI3K，PDK1，Akt，PKB，PKC，p70S6K，MARCKs等。 点击图中信号分子，查看详细通路图及产品（抑制剂，抗体，磷酸化抗体，检测试剂盒，重组蛋白等）
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ex vivo expanded endothelial progenitor cells
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
ex vivo expanded endothelial progenitor cells Cell Culture. 1. Total hPBMCs were isolated from blood of human volunteers by density gradient centrifugation. 2. Cells were plated on culture dishes coated with human fibronectin and maintained in EC basal medium-2 (EBM-2). 3. The media was supplemented with EGM-2 containing 5% FBS, human VEGF-1, human fibroblast growth factor-2 (FGF-2), human epidermal growth factor (EGF), insulin-like growth factor-1 (IGF-1), and ascorbic acid. 4. After 4 days in culture, non-adherent cells were removed by washing with PBS, new media was applied, and the culture was maintained through days 7–10. 5. Human umbilical vein ECs were prepared, and human microvascular ECs (HMVECs) from adult dermis were used. Cellular Staining. 1. Fluorescent chemical detection of EPCs was performed on attached hPBMCs after 7 days in culture. 2. Direct fluorescent staining was used to detect dual binding of FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin-1 and 1,1′-dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine (DiI)-labeled acetylated low density lipoprotein. 3. Cells were first incubated with acLDL at 37°C and later fixed with 1% paraformaldehyde for 10 min. 4. After washes, the cells were reacted with UEA-1 (10 μg/ml) for 1 h. After the staining, samples were viewed with an inverted fluorescent microscope. 5. Cells demonstrating double-positive fluorescence were identified as differentiating EPCs. 6. Cultured human umbilical vein ECs and NIH 3T3 cells served as positive and negative controls, respectively. Fluorescence-Activated Cell Sorting. 1. Fluorescence-activ
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Peripheral blood “endothelial progenitor cells”
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
Peripheral blood “endothelial progenitor cells” EPC Isolation and Characterization 1. EPCs were obtained by isolating mononuclear cells using Ficoll density-gradient centrifugation of human blood buffy coats. 2. After resuspension in endothelial basal medium (EBM-2) supplemented with EGM-2 containing vascular endothelial growth factor, basic fibroblast growth factor, insulin-like growth factor-1, epidermal growth factor, and 5% FBS, 106 mononuclear cells/cm2 were plated on fibronectin-coated tissue culture flasks. 3. After 4 days of culture, nonadherent cells were discarded by washing with PBS. 4. To confirm the EPC phenotype, adherent cells were incubated with DiI-labeled acLDL for 1 hour and after fixation were incubated with FITC-labeled Ulex europaeus agglutinin I (ulex-lectin) for 1 hour. 5. Cells were visualized with an inverted fluorescent microscope, and adherent cells staining positive for both FITC–ulex-lectin and DiI-acLDL were judged to be EPCs. 6. Staining of nuclei with DAPI verified that nearly all adherent cells (>95%) were acLDL(+)ulex-lectin(+). 7. Cells were subsequently detached and analyzed by flow cytometry to determine the light-scattering properties of the acLDL(+)ulex-lectin(+) cell fraction. EPC Surface Molecule Analysis 1. Cells were detached with EDTA and labeled for 20 minutes at 4°C at manufacturer-recommended concentrations with fluorescent antibodies: anti–VE-cadherin-PE and anti–E-selectin–FITC as endothelial markers; anti–CD11b-PE (Mac-1), anti–CD11c-PE, and anti–CD14-APC as monocyte/macrophage markers; anti–CD45–FITC as a panleukocyte m
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常规动物实验模型制作（复制）方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
常规动物实验模型制作（复制）方法 一、肿瘤动物模型的建立 将对数生长的肿瘤细胞收集 ， 用无血清基质 10.0ml， 于 1500 转/ 分， 离心3min， 连续洗 3 次， 最后用无血清基质混匀， 用血球计数器计算肿瘤细胞数量( 平均 5 个中方格的细胞计数×104即是肿瘤数/ 毫升) 。 计算完肿瘤细胞总数， 再将 肿瘤细胞密度调至 4×106 个/ml， 每只小鼠腋下接种 50ul(即 2×105个肿瘤细胞)， 2周左右可扪及肿瘤小节结。一般选取 6-8 周的小鼠，不同的肿瘤细胞接种的数量和动物不一样， 比如 LL/2，B 16， Hep 可接种 C57 和 BAL B/C 小鼠， NS-1，EL-4， C26，Meth A 可接种 BAL B/C 小鼠， H22接种昆明鼠。从肿瘤接种后可扪及小结节开始， 每 3 天用游标卡尺量肿瘤纵横大小( 单位：mm)， 至少连续一个月时间。 注意要设计不同的实验组和对照组， 每组动物数一般为 5-10 只， 一般接种肿瘤6-8 周后，小鼠的肿瘤可生长至直径为 15-20mm ( 即小鼠会濒临死亡) 时， 可眼球取血，分离血清并保存血清， 处死小鼠， 取肿瘤组织照相， 取部分肿瘤组织作 冰冻组织切片( 或- 80℃ 保存)， 作相应的免疫组织化学染色 ， 取部分肿瘤组织用3%中性的甲醛固定， 石腊包埋， 作常规HE 染色。 二、神经系统疾病动物模型复制方法 1、脑瘤模型可用甲基胆蒽等化学致癌埋于皮层，或用肿瘤移植的方法复制脑肿瘤。 2、脑卒中模型常用显微手术结扎大鼠、猫、狗的大脑中动脉和将自凝血块注入颈内动脉，引起梗塞。 3、癫痫模型家兔肌肉注射马桑内酯或噪音刺激大鼠等方法常用作复制癫痫模型。 4、脑水肿模型于颈内动脉内注入伤寒内毒素制作急性模型或外力作用引起外伤性脑水肿。 三、消化系统疾病动物模型复制方法 1、病毒性肝炎模型 常用方法是注射乙型肝炎病人血清复制乙型肝炎模型。胆大部分实验动物对甲型肝炎病毒不易感。我国已有报导红面猕猴、恒河猴、人及野生树鼩种毒后出现人甲型肝炎现象。近年来发现某些鸭肝炎病毒的特征与人肝炎病毒十分相
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