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实验室如何安全使用离心机
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
实验室如何安全使用离心机 1 正确安装 (1)电源电压:电压波动要符合+10%以内的国家标准,否则一些厂家的离心机是不能正常运转。如果电压波动在此以上,建议用稳压器,以供符合此电网。 (2)地线要牢:房间的电源的布线要符合要求。我国是三相四线制。三相是工业电中的三相,使用三相电时零线与地线分开,更重要的是不管是三相工业电也好,一般的单相电也好,地线应可靠,以免漏电,地线不能接在暖气管、自来水管上。 (3)地面要平整、牢固:对大型离心机而言,在安装地点搬动地板要牢固,保证离心机的转子正常工作,不陷凹进去,安装固定处地面应平整且牢固。 (4)找好水平:找较准确的小型水平尺,离心机盖子打开,在主轴上找水平,通过调整4个脚轮旁边的调整螺栓的拧动来找好水平,注意其中1脚不能落空。 2 装样找平衡 离心机在设计与制造时,对转子的加工误差带来的不平衡,已作了动平衡试验的补救,但凡是离心机,都有其允许的装样不平衡量。离心机厂商为了在离心机允许的最大不平衡限量这一指标上与其他厂家竞争,尽量给出较大值。在这较大值上,离心机可以运转,但这时产生的不平衡力以每分钟ｎ次频率猛然冲击轴承及支架,离心机是受损伤的。因此,用户对那些昂贵的离心机,尽量找好平衡后离心,对离心机的寿命有好处。 3 清理离心腔内的积水 离心机运转时使用制冷,由于空气的水分,在离心腔内结霜,停机后霜化为水。大部分国外的低速大容量离心机,没有排水孔,离心腔中水愈积愈多。此时,用户应自行拆下转子,清理积水。在重新安装转子时,一定要装好,避免出事故。 4 铝合金不能受腐蚀 离心机转子一般是用铝合金制造,当受腐蚀后强度降低,容易出事故。铝合金易受液体腐蚀,清洗后应用吹风机吹干,或倒置一段时间,确认干了才能使用。有的血站进口离心机,6个铝杯里应有的6个塑料托没有。塑料托中应放血袋,避免直接放在铝杯里。注意试管有无裂纹。若试管(尤其是反复使用的试管)有裂纹,万万不可使用,否则在使用中试管破裂
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锐博生物：RNAi作用机理及药物研发进展
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
RNAi历史 RNAi现象早在1993年就有报道：将产生紫色素的基因转入开紫花的矮牵牛中，希望得到紫色更深的花，可是事与愿违，非但没有加深紫色，反而成了白色。当时认为这是矮牵牛本来有的紫色素基因和转入的外来紫色素基因都失去了功能，称这种现象是“共抑制”。1995年，康奈尔大学的Su Guo博士用反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义RNA（anti sense RNA和正义RNA（sense RNA）都阻断了基因的表达，他们对这个结果百思不得其解。直到1998年，Andrew Fire的研究证明，在正义RNA阻断了基因表达的试验中，真正起作用的是双链RNA。这些双链RNA是体外转录正义RNA时生成的。于是提出了RNAi这个词。 RNAi作用机理 目前RNAi的作用机理主要是在线虫，果蝇，斑马鱼等生物体内阐明的。生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染，转座子的转录产物，外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制，结果是病毒被清除，转座子的表达被阻断，外源导入基因表达被阻断同时，与其同源的细胞基因组中的基因表达也被阻断。 双链RNA进入细胞后，一方面在Dicer酶的作用下被裂解成siRNA，另一方面在RdRP（以RNA为模板指导RNA合成的聚合酶，RNA-directed RNA polymerase）的作用下自身扩增后，再被Dicer酶裂解成siRNA。SiRNA的双链解开变成单链，并和某些蛋白形成复合物，Argonaute2是目前唯一已知的参与复合物形成的蛋白。此复合物同与siRNA互补的mRNA结合，使mRNA被RNA酶裂解。 另一方面结合的产物以SiRNA作为引物，以mRNA为模板，在RdRP作用下合成出mRNA的互补链。结果mRNA也变成了双链RNA，它在Dicer酶的作用下也被裂解成siRNA。这些新生成的siRNA也具有诱发RNAi的作用，通过这个聚合酶链式反应，细胞内的siRNA大大增加，显著增加了对基因表达的抑制。从21到23个核苷酸的siRNA到几百个核苷酸的双链RNA都能诱发RNAi，但长的双链RNA阻断基因表达的效果明显强于短的双链RNA。 化学合成siRNA的优势 越来
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锐博生物：miRNA的特征、功能及识别方法等详解
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
什么是miRNA MicroRNAs (miRNAs)是一种大小约21—23个碱基的单链小分子RNA，是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。据推测，这些非编码小分子RNA（miRNAs）参与调控基因表达，但其机制区别于siRNA介导的mRNA降解。第一个被确认的miRNA是在线虫中首次发现的lin-4 和let-7，随后多个研究小组在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中鉴别出数百个miRNAs。 miRNA 的特征 已经被鉴定的miRNAs据推测大都是由具有发夹结构、约70个碱基大小形成发夹结构的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成的，有5’端磷酸基和3’羟基，大小约21—25nt的小分子RNA片断，定位于RNA前体的3’端或者5’端。 最近3个研究小组分别从线虫、果蝇和Hela细胞中鉴定的100个新miRNAs中，有15%跨越线虫、果蝇和哺乳动物基因组具有高度的保守性（只有有1—2个碱基的区别），Lau 和Bartel 实验室的同事更加认为：所有的miRNAs可能在其他物种中具有直向同源物（Ortholog，指那些起源于同一祖先，在不同生物体中行使同一功能的基因群就可比作为一个门类，这些类似的基因被称为“直向同源物”）。 Bantam 最早被认为是果蝇中参与细胞增殖的一个基因位点。已知几个包含增强子的转座子插入跨越这个位点的一段12.3kb区域会导致果蝇的眼和翅重复生长，而由转座子介导的一段跨越该位点的23kb片断缺失则导致突变果蝇个体小于野生型果蝇。Cohen和同事用一段3.85kb的片断导入21kb片断缺失的果蝇中使其恢复原来的大小。但是奇怪的是表达这个3.85kb片断中的EST却没有同样的效果。Cohen将这个片断和疟蚊Anopheles gambiae的同源序列进行比较，发现一段90bp的高度保守区，经过RNA folding program (mfold)发现这个保守序列可以形成发夹结构，使得这个区段很象是一个miRNA的前体。这个结果经过Northern blot证实突变果蝇的幼体缺少一个21bp的bantam miRNA ，用这个90bp的mRNA前体经过一系列的“
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多肽抗生素研究进展
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
多肽抗生素研究进展 孙超 王晖 孙波 彭学贤 摘要 多肽抗生素是生物界中广泛存在的一类生物活性小肽，一般具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病毒或癌细胞的功能。按照化学结构的不同，多肽抗生素可分为5类：①具有螺旋结构的线性多肽；②富含某种氨基酸的线性多肽；③含有一个二硫键的多肽；④含有两个或两个以上二硫键的多肽；⑤羊毛硫抗生素。根据作用机理的不同，多肽抗生素又可分为裂解细胞膜的裂解肽和非裂解肽。多肽抗生素已经开始用于医药、食品和植物抗病基因工程等方面，并且有着很大的发展潜力。 多肽抗生素是指相对分子质量通常在1×104以下，具有抗菌活性的多肽类物质。但是由于区分小肽与蛋白质的界限不很严格，不同学者对多肽抗生素的分子量上限有不同的观点。最初，人们把这类具有抗菌活性的多肽称为“antibacterial peptides”，中文译为“抗菌肽”，其原意应为“抗细菌肽”。后来发现有些“抗细菌肽”还具有抗真菌等其它微生物的功能，便称之为“antimicrobial peptides”。但是随着研究的深入，人们相继发现这类多肽还具有抗寄生虫、病毒、癌细胞等功能，尤其是随着这类多肽物质在医药学上的应用，许多学者倾向于称之为“peptide antibiotics”――“多肽抗生素”。也许是由于几乎所有的多肽抗生素都具有抗细菌的功能，“抗菌肽”作为一个约定俗成的名称，在国内依然被广泛采用。如果没有特殊说明，本文中的多肽抗生素特指由基因编码，在核糖体上合成的多肽抗生素。那些在代谢过程中通过酶促反应合成的多肽性质的 多肽抗生素研究的真正兴起是从20世纪80年代初开始的。1980年，Boman等人从美国天蚕蛹中分离得到了具有抗菌活性的多肽――cecropins，并于次年在《Nature》上公布了其氨基酸序列。同是在1980年，Lefur等人从兔的巨噬细胞中分离到了另一种多肽抗生素――defensins，并于3年后公布了其氨基酸序列。此后数年间，人们相继从细菌、真菌，到两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、直至人类体内，发现了多肽抗生素
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多肽物质分离与分析方法研究进展
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
多肽物质分离与分析方法研究进展 赵锐 顾谦群 管华诗 摘 要 综述了近几年来多肽类物质的提取分离与分析方法，主要包括高效液相色谱法、电泳、质谱及核磁共振等方法在肽类物质研究中的最新应用进展。 多肽类化合物广泛存在于自然界中，其中对具有一定生物学活性的多肽的研究，一直是药物开发的一个主要方向。生物体内已知的活性多肽主要是从内分泌腺组织器官、分泌细胞和体液中产生或获得的，生命活动中的细胞分化、神经激素递质调节、肿瘤病变、免疫调节等均与活性多肽密切相关。随着现代科技的飞速发展，从天然产物中获得肽类物质的手段也不断得到提高。一些新方法、新思路的应用，不断有新的肽类物质被发现应用于防病治病之中。本文介绍了近几年肽类物质分离、分析的主要方法研究进展。 1 分离方法 采取何种分离纯化方法要由所提取的组织材料、所要提取物质的性质决定。对蛋白质、多肽提取分离常用的方法包括：盐析法、超滤法、凝胶过滤法、等电点沉淀法、离子交换层析、亲和层析、吸附层析、逆流分溶、酶解法等［1］。这些方法常常组合到一起对特定的物质进行分离纯化，同时上述这些方法也是蛋白、多肽类物质分析中常用的手段，如层析、电泳等。 1.1 高效液相色谱（HPLC） HPLC的出现为肽类物质的分离提供了有利的方法手段，因为蛋白质、多肽的HPLC应用与其他化合物相比，在适宜的色谱条件下不仅可以在短时间内完成分离目的，更重要的是HPLC能在制备规模上生产具有生物活性的多肽。因此在寻找多肽类物质分离制备的最佳条件上，不少学者做了大量的工作。如何保持多肽活性、如何选择固定相材料、洗脱液种类、如何分析测定都是目前研究的内容。 1.1.1 反相高效液相色谱（RP-HPLC） 结果与保留值之间的关系：利用RP-HPLC分离多肽首先得确定不同结构的多肽在柱上的保留情况。为了获得一系列的保留系数，Wilce等［2］利用多线性回归方法对2106种肽的保留性质与结构进行分析，得出了不同氨
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生物安全柜的几个误区及引发的安全问题分析
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
生物安全柜是一种对操作人员、样品和环境提供安全保护的安全设备，也是实验室生物安全中一级防护屏障中最基本的安全防护设备。随着科学技术的发展和人们对生物安全意识的提高，生物安全柜在实验室、医院及研究单位的应用日益广泛，但是在人们在观念里认为是最简单的排风设备，选型、安装、使用等方面中存在很多问题和误区，给生物安全防护、避免实验室感染带来极大的隐。 2003年暴发流行SARS和高致病禽流感，特别是2003-2004年三起实验室SARS-CoV感染事件发生，已经引起了我国政府和广大科学工作者的高度重视。 目前，我国生物安全问题形势严峻，必须采取措施，扭转局面，以下对生物安全柜目前存在的的有关问题、误区进行详细分析，引以为患。 医疗单位生物安全观念淡漠，医院临床诊检、化验室、实验室等所接受的各种病人血液、黏液和各种标本都可能含有各种致病因子，如肝炎病毒、AIDS病毒等已知和未知的病原体，给工作人员带来很大的威胁。 很多临床检验人员没有采取任何防护措施，或采取措施不到位，例如目前大多数化验室人员工作时只佩带一次性乳胶手套，即使戴口罩也是无纺布口罩；用洁净工作台代替生物安全柜；工作人员对生物安全柜的选择、操作等知识缺乏；生物安全柜安装、排风安装存在诸多问题；开展科研工作缺乏危险度评估等等。 实验室国外学者Pike对3921例实验室相关感染进行统计发现，不明原因的实验室感染只占18%，不明原因的感染占到了82%。 经过近年来的研究认为其中65%的不明原因感染是因为病原微生物形成感染性气溶胶随空气扩散，实验室工作人员吸入了污染的空气感染的。实验室中，许多操作都可以产生气溶胶，有人对239种操作进行了测试，其中239种操作可以产生气溶胶，占86.6%。在现在的实验室中，像搅拌、振荡、撞击、离心、超声波破碎、接种等都可产生气溶胶，实验室微生物气溶胶的产生，大多数是在不知不觉中形成的。 中国从1964-1988年发生20多例汉坦病毒感染事件，2003年国家CDC的SARS病毒感染事
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如何选购生物组织自动脱水机?
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
生物组织自动脱水机如何选购? 在医院组建病理科时，生物组织脱水机是必不可少的设备之一，其关键地位仅次于切片机；病理科的工作人员听过很多厂家或代理商对他们的产品的介绍，往往会被五花八门的所谓先进功能所误导，导致选购的脱水机在使用的过程中发生脱水效果不好或经常出现故障，让使用人员苦不堪言。那么，怎么样才能选购一款称心如意的脱水机呢，作为专业的病理仪器制造商，我们为您提供以下几点，供您在选购脱水机提供参考： 一、 脱水机的传动方式：脱水机的传动方式的好坏决定了脱水机故障率的高低。目前脱水机的传动方式主要有两种：钢丝传动和齿形带传动。1、钢丝传动--在使用的过程中时间久了，会出现松弛现象，一旦出现钢丝松弛现象就会出现定位不准确，由此出现的现象就是病理界常说的“卡缸”，其结果就会损坏标本组织，标本损坏严重时就会出现医患纠纷。2、齿形带—每个齿形带的齿和带轮之间有大约3-4毫米的间隙，在运动的过程中会产生积累误差，积累误差大于12毫米时就会出现“卡缸”现象，这就是很多脱水机在刚买的时候还可以，后来就故障不断的原因。目前最可靠的传动系统为精密齿轮轴传动和直线导轨传动。这两种传动系统的造价是钢丝传动和齿形带传动的30倍。 二、 脱水效果。脱水机的重点作用就是脱水效果，排除试剂纯度的因素，加温的均匀度是决定脱水效果优劣的前提因素之一，加温方式通常采用水浴加温和无水加温，在效果上各有所长，最新应用的加温技术为梯度加温技术，即每个石蜡缸的温度各不相同：第一缸为60度，第二缸为62度，第三缸为65度，就处理效果而言脱水质量得到了很大的提升。 三、 标本安全保护。脱水机应该具备标本自动安全保护功能。以避免不必要的医疗纠纷。 四、 空气净化。脱水机的环保性能与工作人员的身体健康也是必须考虑的范畴，采用塑料罩子那种环保只是概念上的环保，没有什么作用。建议不考虑塑料罩子的所谓环保脱水机。 五、用户量。 有很多销售代表说他们的用
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新一代平行分析的SPR生物传感器
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
新一代平行分析的SPR生物传感器 摘要：基于表面等离子体共振的生物传感器是一种非标记的，实时生物分子相互作用检测工具。由于技术的限制，早先的SPR技术采用顺序分析的方式。现在，最新一代的SPR仪采用平行分析的方式，单次进样就可以测定1－6对相互作用的动力学。与传统技术相比，平行分析具有数据质量好、基线联动和通量高的优点。 表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）技术研究生物分子以及和小分子药物之间的相互作用，具有非标记、实时检测和样品用量小的特点，因而在基础生命科学、医学研究和药物开发中应用越来越广泛 ，几乎成为研究生物分子相互作用必不可少的一种方法。 基于SPR技术的生物传感器，只有大约20年的历史。根据美国Utah大学David Myszka教授的相关文献，我们可以将SPR生物传感器的发展划分成5代，其中最先进的一代传感器具有高通量和平行分析的特点 。美国Bio-Rad公司最新推出的一款ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统，就是其中的优秀代表，本文将着重介绍它的技术特点以及给互做研究带来的提升。 与传统的SPR生物传感器一样，最新一代技术也是将一个分子固定在芯片上，叫做ligand，另一个分子在溶液中流过ligand，叫做analyte。所不同的是两者的工作方式。以Bio-Rad公司的ProteOn XPR36系统为例，它有一套非常独特的流动池，称之为MCM（Multi- Channel Module）。MCM上有6条平行的凹槽，它先以垂直方向扣在芯片表面上，就形成了垂直方向上的6条平行通道，用以标记ligand，如下图“Step 1”。随后MCM旋转90°后再芯片表面结合，就形成6条与原先交叉的通道，可以同时流过6个不同浓度的analyte，如下图“Step 2”。这样两组通道交叉形成36个互做位点，如下图“Step 3”所示，可以实现一次analyte注入就完成它和最多6个ligand结合的动力学常数（Kon、Koff）和解离平衡常数（KD）的测定 ，而无需反复再生ligand。这种分析方式就称之为平行分析。而此前的SPR传感器芯片上不管有多少位点，都只
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检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术简介
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
检测自身免疫抗体的蛋白质芯片技术 自身免疫性疾病是由异常免疫反应引起的慢性退行性或炎症性疾病。不同的自身免疫性疾病对机体的影响各有不同。例如，在多发性硬化症中，自身免疫反应的侵害对象是中枢神经系统，而在克罗恩病中则是肠道。此外，同种疾病对不同个体的组织和器官的影响程度不尽相同。 此类疾病的严重程度取决于患者的免疫系统情况。其人群患病率在3%以上，女性和老年人居多。炎症是许多此类疾病的常见症状，其他症状包括：眩晕、疲劳、不适及低烧。器官特异性自身免疫性疾病可侵害靶器官或组织，导致功能受损。 对此类疾病的诊断相当困难，尤其是在发病初期。对健康个体进行的特异性自身抗体检测表明：不同疾病的阳性结果发生率少则接近0%，多则超过10%。健康个体中的大多数抗体的滴定浓度都很低，对健康没有不良影响。 自身抗体并不总是针对某种风湿性疾病。例如，与天然双链DNA (dsDNA) 发生反应的抗体通常对系统性红斑狼疮(SLE)具有诊断意义。但是，抗双链DNA抗体也可见于患有其他疾病的个体中，如风湿性关节炎、干燥综合症、硬皮病、药物性狼疮、慢性活动性肝炎、格雷夫斯氏病及其他疾病。抗双链DNA抗体在上述疾病的患者中发生率一般低于5%。因此抗双链DNA抗体对SLE没有诊断意义。 在少数情况下，自身抗体具有很强的疾病特异性。目前已鉴别出一些常见风湿性疾病的自身抗体靶点（表I）。 本文就自身抗体检测技术进行了回顾性评述，开篇先介绍一些成熟的检测方法，最后则展望未来的发展趋势。多路复用蛋白质分析技术是讨论的核心焦点。本文还研究了各种多路复用自身免疫测定法，并阐述了开发人员所面临的困难。 目前的检测方法 检测自身免疫相关抗体的第一种方法是琼脂凝胶平板双向扩散法，但是这种方法早已被更快速、更灵敏的半定量方法所取代。 检测血清中自身抗体的常用实验室试验：免疫测定（通常为酶免疫测定）、间接免疫荧光显微技术 (IFA)、免疫印迹及免疫沉淀。上述试验中只有第一种是半定
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利用ProteOn XPR36分析蛋白与小分子相互作用
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
很多小分子化合物具有特殊的活性基团，可以结合某些特定的蛋白或核酸，激发或者抑制生物大分子的活性，从而影响生命的过程。人体内种类繁多的维生素类、辅酶等物质就是这些活性小分子化合物。在药物方面，有很多药都是一些有着特殊活性的小分子化合物，分子量从200 Dalton到数千Dalton。因此，小分子药物筛选、优化和药物机理研究成为了制药和药理学研究的重点。目前关于这方面研究的手段，从不同的目的出发有不同的方法。但如果要测定某些化合物和靶蛋白之间的相互作用动力学和亲和力，**的办法非SPR技术莫属。 ProteOn XPR36蛋白相互作用阵列系统是Bio-Rad公司2007年隆重推出的新一代SPR生物传感器。它具有6×6的芯片格式，可以在芯片上同时或分次固定6种蛋白（ligand），然后化合物（analyte）以6种不同的浓度平行地流过所有ligand，36对相互作用的反应曲线同时记录，同时分析。只需一次进样就可以分析一种药物和多种不同靶蛋白之间相互作用的动力学和亲和力常数。这种分析方法不仅大大提高了分析速度，而且由于分析的时候多个浓度、多个不同的ligand和analyte是在完全相同条件下反应的，得到的结果最准确，重复性也**。 ProteOn XPR36系统分析小分子化合物采用灵敏度最高的GLH芯片。这种芯片的基质较长，羧基位点较多，因此能结合较多的ligand蛋白，而且蛋白活性保持较好。这样的芯片能够产生较高的反应信号，非常适合分析小分子化合物。以下是使用该款芯片分析蛋白和小分子化合物相互作用的几个例子： CAII蛋白和小分子抑制剂的相互作用： 首先将CAII蛋白标记在GLH芯片上。采用氨基偶联，将CAII蛋白用pH 5.0的NaAc溶解，标记在芯片上，可达21,200 RU。待基线稳定后再上小分子抑制剂溶液。待反应全部结束后，用ProteOn Manager软件分析结果。这些小分子抑制剂的名称、分子量、反应最高浓度和结果等信息见下表，反应曲线见下图： 名称 MW 反应最高浓度（mM） ka (1/Ms) kd (1/s) KD
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孔雀石绿检测试剂盒说明书
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
使用之前要读说明书（中文说名书仅供参考请以英文为准） 适用 本试剂盒适用于水产品中孔雀绿的定量检测。 原理 本试剂盒原理是竞争酶联免疫检测方法，利用萃取剂从样品中提取到孔雀石绿. 在固相载体微孔板中加入标准和处理的样品，然后加入孔雀石绿抗体，反应30分洗孔，然后加入HRP标记的孔雀石绿孵育30分后洗板，洗涤后加入显色剂，结合的酶将无色的显色剂转化为蓝色的产物；加入反应终止液后使颜色由蓝色变为黄色；在450nm波长进行检测，样品中的孔雀石绿浓度与吸收光强度成反比 。 特异性 与孔雀石绿类似物的交叉反应 Compound % CR Malachite green 孔雀绿 100% Leucomalachite 隐色孔雀绿 1% Crystal Violet 结晶紫 120% Leucocrystal Violet 隐色结晶紫 2% 检测限 水产品: 0.5 ppb 试剂盒组成 96孔酶标板：1块（8×12条）。 标准品贮备液（Standard）: 1瓶（0.4ml/瓶），100ppb。 酶标记物：1瓶（25倍, 0.8ml）HRP标记的孔雀石绿结合物 孔雀石绿抗体：1瓶（9ml） 底物显色液：1瓶（16ml） 终止液：1瓶（12ml 、1N HCl）。 结合物稀释液：1瓶（15ml）。 样本稀释缓冲液：2瓶（25ml） 浓缩洗涤液：1瓶（5倍， 100ml/瓶）、酶标板的洗涤。 使用说明书 注意 不要使用过了有效日期的孔雀石绿检测试剂盒，不同批次、不同试剂盒之间的试剂等内容不可混用。不使用被污染和稀释的试剂。使用前将所有的试剂拿到室温（20℃-28℃），但不要超出24小时。孔雀石绿是抗生素应小心对待。终止液为1M的盐酸避免接触皮肤，如果不小心滴到皮肤上要马上用水清洗。洗液是5乘的在使用时要稀释。 还需设备 去离子水或重蒸水 100ml或更大的量筒 样品提取和采集用的玻璃器皿 甲醇 25、50、100 和250μL 单道或多道移液器 计时器 旋涡混合器 洗瓶 吸水纸 离心机 450nm 滤光片的酶标仪 样品制备(肉 1:20 稀释) 1 鱼虾去皮取肉，用匀浆器均质样品，称取5g均质好的样品置于离心管中2 加入10 mL乙腈，振荡器震荡30分 3 4000g离
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流式细胞仪主要构造和工作原理
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
流式细胞仪主要构造和工作原理 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上
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流式细胞术在血液学中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
DNA倍体分析及细胞周期分析 在细胞周期内,DNA含量随细胞内时相发生周期性变化,正常情况下,大多数细胞处于休止期(Go), G1期细胞虽有DNA合成，但DNA含量仍为2N，为二倍体细胞,;处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞DNA含量为2N-4N;正经历细胞分裂(G2/M期)的细胞含有最大量的DNA(4N)。细胞经固定后用PI(Propidium Iodine 碘化丙啶)等荧光染料染色即可上机测定。但标本需先经RNA酶处理以排除RNA干扰。FCM可在测量大量细胞(数分钟可测定105个细胞)后给出DNA分布直方图,见图12.10.正常人外周血DNA示意图，图中第一个峰(G1)是DNA含量为2N 的细胞峰, 第二个峰是DNA含量为4N 的细胞峰,两峰之间是DNA含量为2N-4N的处于活跃的DNA合成期(S期)的细胞。用厂家提供的Multicycle软件，计算机可自动计算出G1%、S+G2M%;如用DNA/RNA双参数分析,可得到G0:G1%,G0/G1期DNA指数, 如标本中有凋亡细胞,在G1峰前会出现一个亚G1期峰,软件可自动计算出凋亡细胞的%。 图12.10.正常人外周血DNA示意图(采自Coulter Training Guide) DNA倍体分析的临床有价值的指标是DNA非整倍体和/或超二倍体%和四倍体%增高。这些改变是肿瘤细胞的特异性改变,和实体瘤相比,急性白血病非整倍体发生率较低,约30～40%。 淋巴细胞亚群测定 淋巴细胞担负着免疫的主要功能。淋巴细胞亚群的测定有助于了解机体免疫状况及一些疾病的监测。临床经常测定的淋巴细胞亚群包括T淋巴细胞 (CD3+), T 辅助细胞 (CD3+CD4+), T 抑制细胞(CD3+CD8+), B 淋巴细胞（CD19+或CD20+），NK 细胞 (CD3-CD56+)等。 常用来测定淋巴细胞亚群的单克隆抗体(Monoclonal Antibody McAb)都是小鼠抗人Ig,有精制抗体,有直标荧光抗体,现在一些国外公司有双色和三色McAb出售,如CD4-FITC/CD8-RD1、CD3-CY5/CD4-FITC/CD8-PE等,此时应根据这些双色或三色McAb的Ig性质选择相应的阴性对照,如MsIgG1-RD1/MsIgG2-FITC等。上机测定时应先测定阴性对照管,阴性对照的阳性细胞应＜2.0%。 三色测定可给出更为
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单克隆抗体制备技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
单克隆抗体制备技术 单克隆抗体制备标准化操作方案(McAb-sop) 第一章: 小鼠免疫 第二章: 细胞融合 第三章: 细胞建株 第四章: 细胞株鉴定 第五章: 腹水制备 第六章: 抗体纯化和鉴定（略） 第一章. 小鼠免疫(BALB/c) 小鼠免疫是单抗制备的关键一环,质控小鼠免疫是制备优质单抗的唯一保证。 一.小鼠免疫分两程方案:根据免疫学原理小鼠免疫方案设计如下: 1.短程免疫方案: 第一次: 1d 100ug(可溶性Ag)+等体积完全佐剂. 腹腔注射. 0.4ml/只 第二次: 7d 100ug+等体积不完全佐剂 腹腔注射. 0.4ml/只 第三次: 12d 50ug IV 0.3ml/只 (强化)第四次: 15d 20ug IV 0.3ml/只 第17 d~24d内融合 2长程免疫方案: 第一次: 1d 100ug+等体积完全佐剂 腹腔注射(IP)0.4ml/只 第二次: 14d 100ug+等体积不完全佐剂 IP 0.4ml/只 第三次: 21d 100ug IP或IV 0.4ml/只 第四次: 25d 50ug IV 0.3ml/只 (强化)第五次: 28d 20ug IV 0.3ml/只 第30d~37d内融合. 注意:a.在融合前(即加强免疫前)必须测定免疫鼠血清滴度,短程免疫滴度必须≥1:8000,长程免疫≥1:32000,方可做融合.b.免疫周期完成后所有小鼠需在一周内做完融合. 否则不能保证融合质量。 二． 小鼠免疫质控标准 1．免疫鼠血清滴度 短程≥1：8000，长程≥1：32000； 2．小鼠免疫后需在一周内做完融合； 3．免疫鼠脾脏明显大于空白鼠脾脏并且较粘连。 免疫鼠选择：免疫种类为:baleb/c小鼠；性别.雌性佳：大小：6-7周龄
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用阵列式SPR传感器ProteOn XPR36系统进行抗体开发和研究
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
进行抗体开发和研究，不管是完整的单克隆抗体分子还是Fab、scFv，我们需要了解抗体分子的表达量、亲和力、反应动力学（特别是解离速率koff）以及抗体的其它特性如亚型、特异性等等。使用传统的ELISA方法筛选抗体，通常只能先看哪些克隆有表达，然后把表达水平较高的克隆挑出来进一步研究。这种方法筛选抗体，速度虽然快，但充其量只能知道大致的表达水平，其余所有的信息都必须进一步研究，对后续的工作带来很大压力，而且常常会丢掉虽然表达水平不高，但抗体亲和力、特异性等非常好的克隆。 后来，人们尝试用一些新的手段来筛选抗体或抗体片段，其中较常用的是SPR技术。SPR生物传感器技术问世以来，它的通量一直成为问题，测定抗原-抗体反应动力学数据通常需要数小时时间，远远达不到抗体筛选的要求，而通量较高的产品的价格又贵得几乎能令世界上最奢侈的实验室望而却步，所以大多数拥有SPR传感器的实验室只是拿它来做后期的抗体特性分析。前期的筛选阶段还是采用ELISA方法。 现在Bio-Rad公司推出的一种新型阵列式SPR生物传感器技术有望彻底打破现有方法的各种瓶颈，做到较高通量的基础上同时获得浓度、亲和力以及反应动力学等相关数据。这种新型阵列式SPR生物传感器叫ProteOn XPR36系统。如下图所示，它具有可90°旋转的6通道流动池，可在芯片上产生纵向或者横向的通道各6条。首先，流动池旋转成纵向，在纵向的6个通道里可以标记最多6种不同的ligand在芯片上，随后流动池旋转90°变成横向，流过6个analyte，当analyte溶液接触原先标记的ligand时发生的相互作用即可被检测并记录下来。通过这样的分析方式可以实现高通量平行分析。 使用ProteOn XPR36系统进行抗体筛选和优化，Bio-Rad公司给出了一个完全不同于传统方法的新工作流程，如下图所示。 第一步，横向6个通道上标记捕获试剂，即可以和单抗结合的分子，如Anti-mouse IgG、Protein A/G等，如果筛选抗体Fab段，可以标记Anti-(Fab’)2。标记
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