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高通量植物（转）基因检测的利器---植物材料直接PCR技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
高通量植物（转）基因检测的利器---植物材料直接PCR技术 摘要： 北京百泰克生物技术有限公司暨推出通用植物总RNA提取试剂盒（RP3301）成功解决了各种难提植物RNA的问题后，新近又针对高通量植物DNA的提取扩增推出了最新产品——植物直接PCR试剂盒（PR7501），该试剂盒不需要液氮和研磨杵研磨，也不需要钢珠破碎，更不借助任何特殊的仪器设备，方法及其方便快捷。 众所周知，在正向遗传学的基因定位，植物品质和品种鉴定，或者是植物有效成分检测，以及转基因检测等，都需要高通量植物的DNA提取，然后PCR检测。尤其是在基因图位克隆中，需要构建一个大的群体（少则几千株，多则上万株），然后提取DNA，PCR方法筛选性状的连锁标记（SSR，RAPD等），最后测序克隆基因。传统方法在DNA提取中，都要液氮研磨样品，然后氯仿抽提，最后再PCR。上千株系DNA的提取就需要几周的时间。一些公司进行改进，开发了相对简单些的方法，用96孔吸附板进行提取，完成整个实验也需要大约1个小时；也有些公司在96孔深孔板中加入钢珠或者其他比重大的金属小珠帮助破碎，直接裂解后取上清做PCR，能将时间缩短至半小时，但是需要借助专用的震荡器，而且钢珠的使用成本很高；也有的公司不借助钢珠，而提供小的研磨杵，在PCR管人工研磨后裂解取上清进行PCR，显然耗费的人工时间比较多，而且也容易相互污染。 以上的方法对于大规模的基因或转基因检测显然不理想，不仅时间长而且易污染！国内外很多知名的公司纷纷投入到改进新技术的研发中！北京百泰克生物技术有限公司暨推出通用植物总RNA提取试剂盒（RP3301）成功解决了各种难提植物RNA的问题后，新近又针对高通量植物DNA的提取扩增推出了最新产品——植物直接PCR试剂盒（PR7501），该试剂盒不需要液氮和研磨杵研磨，也不需要钢珠破碎，更不借助任何特殊的仪器设备，方法及其方便快捷。只需截取0.5-0.7厘米的植物叶片放入溶液L中，95℃孵浴10分钟，无需液氮研磨，然后加等体积溶液I，就可
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RIP 技术--研究肿瘤发生和转移中microRNA失调的有力工具
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
microRNAs（miRNA）是一种内源性非编码小分子RNA，一般具有18到25个核苷酸，其序列在进化上高度保守，通过靶向特定mRNA来调节基因的表达。 miRNA是越来越受关注的转录后调控网络（post-transcriptional control）中重要的调控因子。首先，miRNA结合到核糖核蛋白（Ribonucleoprotein，RNP）复合物中，形成RNA诱导的沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC），然后通过不完全的碱基互补靶向到目标mRNA的3’UTR区，再通过引导酶切影响了mRNA的稳定性，或直接阻碍翻译过程，从而介导特异mRNA靶标的转录后基因沉默。 miRNA参与转录后调控网络。miRNA靶向到目标mRNA的3’UTR区，抑制靶mRNA的蛋白表达。（摘自Chatterjee & Pal, Biol Cell. 2009） miRNA对许多生理过程产生重要影响，如细胞生长、凋亡、应激应答、干细胞分化潜能的维持以及新陈代谢等。据估计，脊椎动物基因组编码多达1000种不同的miRNA，研究人员推测，这些miRNA可能调控至少30%的基因的表达。尽管研究人员目前已在人体内发现超过530种miRNA，但仍需进一步研究以了解这些分子的确切的细胞学功能，及其在疾病发生中所扮演的角色。 对miRNA的研究表明，miRNA表达量的上调或是下降都可能与致癌基因或是抑癌基因的调节有关，因此miRNA在癌症生成中起重要的作用。通常而言，与发生分化了的细胞类型有关的miRNA在肿瘤细胞中的表达减少，而那些在早期发育及干细胞中便有所表达的miRNA却保留下来。 一些在肿瘤中过度表达的miRNA通过下调抑癌因子而促进肿瘤发生，如： --在肝细胞癌中高表达的miR-21，靶向抑癌基因PTEN ； --在淋巴瘤中高表达的miR-17-miR-92簇，靶向抑癌基因E2F1； --在睾丸生殖细胞肿瘤中高表达的miR-372和miR-373，靶向抑癌基因LATS2。（摘自：Lujambio,AEsteller,M Cell Cycle 2009） 同时，一些在肿瘤中表达缺失的miRNA起着抑制癌症的功能，如： --在肺癌中中低表达的lethal-7（let-7）miRNA家族，靶向致癌基因KRAS、NRAS、MYC和hig
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关于土壤分析仪器
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
一、自 80 年代研制推广的各类土肥测定仪，仪器本身是一个数字式浓度直读光电比色计，它是一个各行业通用仪。因便携、稳定、不再作标准曲线，操作简便，适于基层土化分析而取名土肥仪。从仪表分类定名来看土肥仪，“土肥”是不全面、不科学的，只能是土肥分析可以用的光电比色计。 二、数字化光电比色计的特点： 除有 T 、 A 两档外，增加了“ C “（浓度）档，这是 80 年代中以后新光电仪的特点，用 T 、 A 调整仪器零后，转 C 档，用标准显色液定位后，被测液浓度直接显示，不必再用 A 作曲线，查曲线 3 。这是我国长期从事土化分析，一直沿用传统指针式（没有 C 档）仪表的同志（包括当前教学工作和前仪器培养的大学生、研究生、博士生）应重新学习的新技术。 三、各种光电比色计的质量检查评价： 1、仪器的稳定性：一定要用一种不变的（长时间）稳定的色溶液，反复几次上仪器观察仪器显示值。若变化不大或不变，说明仪器稳定。这是国际、国家检查仪器的客观方法。即黄色用 Cr ，兰色用 Cu ，红色用 Co ，来检查可见光范围内从事 400-800 三个区段稳定性和灵敏度的标准规范。不能用分析工作中标准溶液的显色液，更不能用样品显色液，因它们的色都是在相对变化的，人们利用某一化学反应显色在相对显色稳定后马上经色进行该元素的测定（决不是用它检查仪器）。测定误差来源正是人们是否规范操作（如标准与待测液同时显色操作），是否尽量减少标准液和被测样品液显色中诸多条件的影响等所造成的。 2、 仪器的直线性：即仪器显示值和溶液显色物质浓度是否正相关。用不同浓度系列色液（色度稳定的 Cr 、 Co 、 Cu ）上仪器，仪器显示值（ A 或 C ）应按比例对应其浓度值，即是一条直线。但是指在一定浓度范围内是直线，则仪器线性姨，不是无限范围。人们利用线性**的中间浓度范围（即标准曲线的中段）进行样品测定，以减少误差，否则应调节样品、待测液用量或显色液体，即使待测的显色浓度在中段比色，发
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科研实验设计的原则
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
实验设计 一、实验设计的意义 实验设计是科学研究计划内关于研究方法与步骤的一项内容。在医学科研工作中，无论实验室研究、临床疗效观察或现场调查，在制订研究计划时，都应根据实验的目的和条例，结合统计学的要求，针对实验的全过程，认真考虑实验设计问题。一个周密而完善的实验设计，能合理地安排各种实验因素，严格地控制实验误差，从而用较少的人力、物力和时间，最大限度地获得丰富而可靠的资料。反之，如果实验设计存在着缺点，就可能造成不应有的浪费，且足以减损研究结果的价值。总之，实验设计是实验过程的依据，是实验数据处理的前提，也是提高科研成果质量的一个重要保证。 众所周知，科研工作者在进行医药方面的科学研究之前，需要制定完善的统计研究设计方案，那么什么样的设计方案才称得上是完善的呢？一般来说，完善的设计方案需具备以下几个条件：实验所需的人力、物力和时间资源；实验设计的“三要素”和“六原则”均符合专业和统计学要求，对实验数据的收集、整理、分析等有一套规范的规定和正确的方法。而其中准确把握统计研究设计的“三要素和六原则”，是科学实验设计的核心。 二、实验设计的“三要素” 1．实验对象：实验所用的材料即为实验对象。如用小鼠做实验，小鼠就是本次实验的实验对象，或称为受试对象。实验对象选择的合适与否直接关系到实验实施的难度，以及别人对实验新颖性和创新性的评价。一个完整的实验设计中所需实验材料的总数称为样本含量。**根据特定的设计类型估计出较合适的样本含量。样本过大或过小都有弊端。 2．实验因素：所有影响实验结果的条件都称为影响因素，实验研究的目的不同，对实验的要求也不同。影响因素有客观与主观，主要与次要因素之分。研究者希望通过研究设计进行有计划的安排，从而能够科学地考察其作用大小的因素称为实验因素（如药物的种类、剂量、浓度、作用时间等）；对评价实验因素作用大小有一定干扰性且研究者并不想考察的因素称为区组因素或
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实验技术：组织切片的制备
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
组织切片的制备 【目的】 组织标本必须首先被制成组织切片，再经过染色处理，然后才能在显微镜下进行临床诊断和科学研究。 【原理】 苏木素染色结合伊红染色是常规组织学染色技术，也称为H & E染色。苏木素是碱性染色，细胞核被染成深紫或兰色，常用作核染色；伊红是酸性染色，细胞浆染呈红色，常用作胞浆染色。 【材料】 1.试剂和溶液 （1）2-甲基丁醇(异戊醇) （2）干冰 （3）O.C.T.(Tissue-Tek, SAKURA) （4）冰冻或石蜡组织块 （5）酸性Harris 苏木素染料 （6）1％酸性酒精 70％酒精 99 ml 浓盐酸 1 ml （7）醇溶性伊红染料 （8）酒精 （9）二甲苯 （10）树脂封片液 2.设备 （1）塑料模具 （2）长镊子 （3）Superfrost Plus玻片(Fisher Scientific) （4）盖玻片 （5）刀片(一次性或非 一次性)； （6）冰冻或石蜡切片机(Leica , Micorm 或其它) 【方法】 方法1、冰冻切片的制备 一、准备冰冻组织 1. 用塑料或不锈钢容器盛上2-甲基丁醇(异戊醇)，然后不时放入小块干冰，使温度降至-40ºC到-50ºC,并保持低温。 2. 标记塑料模具并将O.C.T灌入模具，覆盖其底部。 3. 收集组织标本。快速，轻柔和准确地取材以保证组织标本的质量，是获得高质量免疫标记染色的最基本条件。 4. 将取下的组织标本置入灌有O.C.T 的模具，用O.C.T 灌满模具，直至标本完全被其覆盖。组织标本应尽量贴近模具底部，使标本在切片时易于暴露。酌情调整组织标本的位置。用长镊子挟住模具，放入冷却了的2-甲基丁醇(异戊醇)溶液中。为了避免产生空泡，先将模具底部触及溶液，盛有标本的模具从底部开始向表面冷冻，然后将整个模具放入溶液中5-10分钟。 （1）多数取下的组织标本可以直接放入模具。如标本沾有大量液体，应当用吸水性能好的纸沾去多余的液体，然后冷冻包埋。不要用溶液清洗标本。 （2）需要先固定处理的组织标本，可以在完成固定后，用10％到30％蔗糖-缓冲液处理，再冷冻包埋。 5
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免疫组织化学染色方法（S-P法）
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
免疫组织化学染色方法（S-P法） 免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。 常用的标记物有荧光素和酶。荧光素标记的称为免疫荧光法（immunofluorescent technique），常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate）、罗丹明（rhodamine）等。酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labeled antibody method），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。 抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。 【实验步骤】 1、石蜡切片4-5μm； 2、切片脱蜡至水； 3、3%甲醇双氧水阻断室温10分钟； 4、 0.01M(PH 7.2)磷酸盐缓冲液（PBS）洗5分钟´3次；抗原修复，加入0.01M（PH 6.0）柠檬酸缓冲液置微波炉中10档3分30秒，之后可进行2档1分至1分30秒微波维持。 5、自然冷却后PBS洗，加二抗同种动物非免疫血清封闭，室温10分钟； 6、免洗，倾出血清，分别滴加配制好的一抗4℃过夜； 7、PBS洗5分钟 ´ 3次； 8、滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10分钟； 9、PBS洗5分钟 ´ 3次； 10、滴加链亲和素-过氧化物酶，室温10分钟； 11、PBS洗5分钟 ´ 3次； 12、新鲜配制的DAB溶液显色3-10分钟； 13、自来水洗，苏木素浅染细胞核，分化。自来水冲洗返兰，梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
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实验技术：细胞培养基本技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
细胞培养 一、操作规程： 1.实验前,无菌室及无菌操作台用紫外灯照射30-60分钟灭菌,用70％酒精擦拭无菌操作台面,并开启无菌操作台风机运转10分钟后,才可开始实验操作.每次操作只处理一株细胞,以免造成细胞交叉污染.实验结束后,将实验物品带出工作台。如需要继续进行下一个实验,则用70％酒精擦拭无菌操作台面,再让无菌操作台风机运转10分钟后,才可进行下一个实验操作。 2.无菌操作工作区域应保持清洁与宽敞,必要物品,如试管架,移液器或吸管头等可以暂时放置,其它实验用品用完后应及时移出,以利气体流通.实验用品要用70％酒精擦拭后才能带入无菌操作台内。实验操作应在操作台中央无菌区域内进行,勿在边缘非无菌区域操作。 3.小心取出无菌实验用品,避免造成污染。切勿碰触吸管与吸头头部或容器瓶口,不要在打开的容器正上方操作实验。容器打开后,用手夹住瓶盖并握住瓶身,倾斜约45°角取用,尽量勿将瓶盖盖口朝上放在台面上。 4.工作人员应注意自身的安全,必须穿戴实验衣与手套后才进行实验。对于来自人源性或病毒感染的细胞株应特别小心,并选择适当等级的无菌操作台(至少两级)。操作过程中,应避免引起气溶胶的产生,小心有毒性试剂,例如DMSO及TPA等,并避免尖锐物品伤人等。 5.定期检查下列项目：CO2钢瓶内的CO2压力；CO2培养箱内的CO2浓度,温度,及水盘是否有污染；无菌操作台内气流压力是否正常,定期更换紫外灯管及HEPA过滤器滤膜,预滤网（300小时/预滤网,3000小/HEPA)。 二、粉末细胞培养基的配制(以1 升为例)： 细胞培养基通常须添加10％血清，因此粉末培养基之配制体积为900 ml，pH 为 7.2 - 7.4。NaHCO3另外添加，若将NaHCO3 粉末直接加入液体培养基中会造成 pH 之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3 粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2 气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH 易发生改变。 【试剂与设备】 1. 纯水(milli-Q 水或二次至三次蒸馏
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PCR实验技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
PCR（聚合酶链式反应） 【原理】 PCR（polymerase chain reaction）用于在体外将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。反应体系：①样品DNA；②引物（primer），是人工合成的一对寡核苷酸链（约15-20个核苷酸），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区之间的区域；③4种dNTP；④Tag DNA聚合酶，是从一种嗜热水生菌（Thermus aquaticus）中分离出来的。此酶最适作用温度为75～80℃，但短时间在95℃下不失活。⑤适宜的缓冲体系和适量的Mg2+。反应过程：①变性：将反应液置于PCR仪中，提高温度（约90-95℃）使DNA双链解离；②复性：降温（约60℃左右）退火，使引物与模板结合；③延伸：升温度至70-75℃，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成DNA双链片段；④重复上述“变性——复性——延伸”的过程。最初几次循环中形成的长链DNA较多，但随着反应的进行，长链DNA以算术级数增加，而夹在两个引物之间的目标DNA以指数级数增长，经大约20—30次循环后，扩增产物中主要是目标DNA。 【材料】 1. 试剂和溶液 （1）10 × PCR缓冲液 500 mM 氯化钾 100 mM Tris-Cl (室温时pH 8.3) 15 mM 氯化镁 （2）10 mM脱氧三磷酸核苷(dNTPs) 溶液－含有所有四种dNTPs(pH 8.0) （3）耐热的DNA 聚合酶： ① Taq DNA 聚合酶是从表达克隆嗜热水生菌的DNA 聚合酶基因的大肠杆菌提纯而来。此酶有5’→3’ DNA聚合酶和5’→3’外切酶活性，但是缺乏3’→5’ 外切酶活性。此酶由分子量约为94 千道尔顿的多肽组成。Taq DNA聚合酶对热稳定，能在较高的温度下利用引物将单链模板合成为DNA。 催化一典型的PCR所需酶量约为2单位。加酶量过多则有可能导致非靶序列的扩增。 Taq DNA 聚合酶缺乏校正功能，在PCR过程中核苷酸掺入错误率可达每循环2 × 10-4个核苷酸，约比使用大肠杆菌DNA聚合酶 I 的Klenow片段时高4倍。对于一个30轮循环的扩增反应来说，这一掺入错误率将导致0.25％的总错误频率。这一频率似随和浓度的升高而增大。这些错误的掺入可以发生在扩增产物的任何位置，既有颠换
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二抗的选择和定位
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
二抗的选择和定位 第一步：选择抗体。 三种二抗抗体：Whole IgG，F(ab&；rsquo；)2片段，Fab片段。 Whole IgG抗体适用于多数情况，是性价比最高的。Whole IgG是完整的抗体分子，有一个Fc部分和两个与抗原结合的Fab部分 (Figure 1, Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc网站)。 F(ab&；rsquo；)2片段抗体是胃蛋白酶消化IgG除去Fc部分，剩下靠二硫键连接的结合抗原的两个Fab部分。F(ab&；rsquo；)2片段抗体用在避免抗体与Protain A 或G结合，或者与有Fc受体的活细胞结合。如果一抗是完整的抗体分子，不管二抗是哪种形式都可能结合Fc受体。 Fab片段抗体是用木瓜蛋白酶消化IgG后得到的。这些抗体只含有一个Fab结合位点。它们用来封闭内源性的免疫球蛋白，或者在使用相同物种来源的一抗多标记的实验中封闭暴露的免疫球蛋白。 第二步：一抗的物种来源。 为了正确的选择二抗，必须知道一抗的物种来源。如果一抗是小鼠来源的，就找&；ldquo；anti-mouse&；rdquo；。 第三步：选择二抗的物种来源。 第四步：选择二抗的特异性。 因为不同物种来源的免疫球蛋白含有相似的结构，抗一个物种的抗体可能与其他物种发生交叉反应，除非事先特殊处理过(如标有&；ldquo；min X Hu, Bov&；hellip；Sr Prot&；rdquo； - minimal cross-reactivity to human and bovine serum proteins) ), 经过用圆括号中的物种 (human, bovine) 的血清蛋白的吸附处理来降低交叉反应)。在选择二抗时，只有在来自两个很相近的物种的一抗都存在而需要检测其中一种时，才使用针对其中一种特殊吸附处理过的抗体。这样的抗体可能不能和所有亚型的IgG都很好的反应。比如，在含有内源性免疫球蛋白的大鼠的组织样本中，使用针对大鼠吸附处理过的anti-mouse IgG来检测小鼠的一抗，或者在多标记实验中使用了大鼠的一抗时。当不含有大鼠免疫球蛋白时，**采用没有针对大鼠IgG处理过的anti-mouse二抗来检测小鼠的一抗。牛血清白蛋白（BSA）和奶粉中可能含有牛I
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耦联到抗体上的荧光团探针
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
荧光团探针的选择依赖于下面的重要标准： A. 仪器。比如，光源，滤片，检测系统。 B. 多标记中对探针色彩区分程度的要求。例如，若丹明红-X (RRX)和德克萨斯红(TR)荧光素的区别就比四甲基若丹明（TRITC）或者Cy3的区别明显。 C. 要求的灵敏度。比如，Cy3和Cy5就比其他的荧光团探针要亮。 Aminomethylcoumarin Acetate (AMCA) 耦联的AMCA吸收光波长最大为350nm，发荧光则为450nm。对于荧光显微镜来说，AMCA可以用汞灯来激发，用紫外滤板来观察。由于AMCA的信号相对较弱，单标实验中不推荐使用AMCA。AMCA和荧光素的荧光波长只有很小的重叠范围，而和发出长波长荧光的荧光基团没有或者只有极少的重叠，因此它最常用于多标记实验中，比如免疫荧光显微镜和流式细胞仪。由于人眼不能很好的检测蓝色荧光，在多标记的实验中，AMCA耦联的二抗应当被用于检测大量的抗原。AMCA和荧光素一样很快淬灭，使用抗淬灭剂可以减轻。如果使用在流式细胞仪中，AMCA可以用汞灯或者水冷却的氩光灯激发，因为它们发出的光线是在光谱的紫外区。 Fluorescein Isothiocyanate (FITC) 耦联的荧光素基团吸收的最大波长为492nm，发射的最大波长为520nm。由于FITC被使用了很长时间而且产量很大，FITC被广泛应用。荧光素的最大缺点是淬灭快，因此要和抗淬灭剂一起使用。DTAF是荧光素的一个衍生物，激发和发射波长均和FITC相同。当和链霉亲合素耦联时，因为荧光强度上有明显的区别，**不使用FITC，而使用DTAF。 Cyanine dyes （Cy2, Cy3, Cy5） Cy2耦联基团激发波长为492nm，发光为波长510nm的绿色可见光。Cy2和FITC使用相同的滤波片。由于Cy2比FITC在光下更稳定。要避免使用含有磷酸化的苯二胺的封片剂，因为这种抗淬灭剂和Cy2反应，在染色片储存后会导致荧光微弱和扩散。 Cy3和Cy5比其他的荧光团探针要更亮，更稳定，背景更弱。Cy3耦联基团激发光的最大波长为550nm，最强发射光为570nm。因为激发光和发射光波长很接近TRITC, 在荧光显微镜中
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免疫组化中抗体选择要求
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
免疫组化中抗体选择要求 1、一抗选择要点 （1）选择单克隆还是多克隆抗体。由一种克隆产生的特异性抗体叫做单克隆抗体，单克隆抗体能目标明确地与单一特异抗原决定簇结合，就象导弹精确地命中目标一样。另一方面，即使是同一个抗原决定簇，在机体内也可以由好几种克隆产生抗体，形成好几种单克隆抗体混杂物，称为多克隆抗体。在抗原抗体反应中，一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对较低；而多克隆抗体特异性稍弱，抗体的亲和力强，灵敏度高，但易出现非特异性染色（可以通过封闭等有所避免）。 （2）种属来源。一般家兔来源的抗体多是多克隆；而小鼠来源的抗体多是单克隆，但也有另外。这条主要要与后面的二抗来源相匹配。 （3）实验目的是检测什么种属的抗原，即species reactivity。这一点很重要，一般说明书上都有注明，如小鼠Ms、大鼠Rat、人Hum等等。 （4）能否做免疫组化。一般一抗说明书都会注明做WB、IHC、ICC、IF等，建议**选择注明的抗体，因为一般都是经过文章证明。 （5）检测标本类型。用于检测石蜡切片还是冰冻切片，一般能做石蜡切片的抗体，可能都可以用来检测冰冻切片，但能做冰冻切片的抗体，不一定能检测石蜡切片中的抗原。 （6）生产厂家。国外著名抗体生产商原装抗体质量一般没问题，但有点贵；而国内分装厂家用的一抗工作液，价格便宜，但有时结果的稳定性和重复性稍差，尤其不同批次重复性较差。 （7）价格与质量的矛盾。一抗原装质量可能会好点，因为许多一抗避免反复冻融，且在稀释液中稳定性较差（若时间长），但价格较贵。 2、二抗选择要点 （1）种属来源。主要根据一抗种属来源来决定购买二抗来源，如一抗是小鼠来源，那二抗就买抗小鼠的即可（羊、兔等均可）。 （2）标记物的选择。有HRP、Biotin、荧光素等标记物。一般SP三步法二抗选择Biotin标记的二抗，以与后面的SP结合反应；而免疫荧光染色就需要购买不同荧光素标记的二抗，如罗丹明、
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一抗的选择
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
一抗的选择 检测任何目的靶蛋白都有不止一种抗体可供选择，为缩小抗体的选择范围选中合适的抗体，需要考虑如下几种因素： 分析试验应用的类型l 样本蛋白的结构性质l 样本的种属l 抗体宿主的种类l 抗体的标记和检测l 1.分析试验应用的类型 一般抗体说明书都列出该抗体经试验验证过适用于何种分析类型，如：可以应用于WB IHC ICC ELASA分析等，如果抗体说明书没有提及的应用类型，并不意味着该抗体不适用于此种分析应用类型，而仅是说明尚未经过此种分析试验验证，如果抗体不适用某些分析试验，则会在抗体说明书上标注出来不适于某分析试验。 2.样本蛋白的结构性质 了解样本蛋白的结构性质有助于选择最合适的抗体，至少两方面因素需要考虑 待测样本蛋白的结构域：抗体是由各种不同免疫原免疫宿主而制备得来，其中的免疫原包括：全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体（如：细菌）或细胞，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果打算检测的是蛋白片断或一种特殊的同型物或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段域的免疫原制备出的抗体。如果打算用FACS流式检测活细胞的表面蛋白，则需要选择含该表面蛋白的胞外域来免疫制备的抗体。l 样本的提取或处理过程：某些抗体要求样本经过某些特殊处理，例如：许多抗体只识别还原和变性的、表位已暴露不受二级四级结构阻碍的蛋白样本，另一方面，某些抗体仅识别天然折叠状态的蛋白。当选择免疫组化的抗体时，应注意某些抗体只识别未固定的冷冻的组织，而另一些抗体则适用于无需抗原修复解交联步聚的甲醛固定石蜡包埋的组织，这些都会在抗体说明书上应用部分标示出来l 3.样本的物种 应选择物种相同或有交叉反应的抗体，抗体可能与不同物种的同种靶蛋白有交叉反应，因其氨基酸序列同源性较高，如果样本的种类未列入抗体说明书上的交叉反应种属表中，并不意味着该抗体不适用于检测该物种的蛋白，而只是表示该物种尚未用此抗体检测验证过，应通过序列比对的方法
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影响ELISA实验的因素和对策
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
影响ELISA试验效果常见问题原因分析及解决办法 来自Transhold 跳转到: 导航, 搜索 ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在科研上得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不全、花板等结果。 下面将操作中各个环节常出现问题的原因及解决办法总结于下： 操作步骤： 目录 [隐藏] 1 选择试剂： 2 标本收集与保存： 3 试剂使用中的准备工作及注意事项： 4 加 样： 5 温 育： 6 洗 板： 7 显 色： 8 终 止： 9 读 板： 10 全过程： 11 ELISA实验的结果判断和数据分析 选择试剂： 选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作前将试剂在室温下平衡30-60分钟。 参考准备ELISA实验的正确步骤#ELISA实验的事前准备工作一 标本收集与保存： 避免使用肉眼可见的溶血标本、高脂标本和混浊标本； 2-8℃下，标本可放置24-48小时，长期保存需放置-20℃下。 请避免反复冻融。 具体请参照： ELISA实验标本的采集与处理： ELISA实验标本的保存： 试剂使用中的准备工作及注意事项： 试剂盒中会有提示，一般需要准备的有： 洗涤液；用前配制；有的试剂盒会标明，配好的4度下一般可以放一个月；如果没有标明，尽量用新鲜的，不要多配制。 显色液（有A液和B液的），用前15分钟配制； 标准品：有的试剂盒中标准品是已经配制好的，4度保存；有的是要现配制的；按照说明书操作； 浓缩生物素结合的二抗和HRP：如果需要配制，试剂盒没注明配好可以保存多久的话，尽量现配现用（用前15分钟配制）； 原则是： 试剂盒上没有指出配制物的储藏方式的话，应该现配现用；不要怕麻烦； 还有，小瓶的管子开盖前要离心，以免盖子上粘连以後总量不够。 加 样： 室温温育的试剂，特别是温育时间比较短的实验操作的试剂，加样对数据的影响比较大。特别要注意加样问题。 不好的操作原因： 不会正确使用加样器； 血清或血浆标本分离不好即进行加样； 手
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溶解多肽的方法及多肽应用的注意点
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
多肽的溶解度取决元计算的物理特性。氨基酸可分类为酸性，碱性，极性，非极性，疏水性。多肽有高含量的非极性疏水性氨基酸或极性不带电荷的氨基酸。建议溶解在有机溶液中（例如：DMF，甲醇，丙醇，异丙醇，DMSO）。总之，酸性多肽一般溶解于碱性溶液中，而碱性多肽溶解在酸性溶液中。 氨基酸的属性 碱性：Arg,His(H),Lys(K) 非极性疏水性：Ala(A),Ile（I），Len(L),Met(M),Phe(F),Pro(P),Trp(W),Val(V) 极性不带电荷：Asn(N),Cys(C),Glg(G),Gln(Q),Ser(S),Thr(T),Tyr(Y) 酸性：Asp(D),Glu(E) Bachem公司发布每批号的产品分析报告(ADS），提供在特殊溶液中的溶解度。客户可以酌情按产品分析报告中溶液来溶解多肽。或者客户可以按下列方法试验小量样品中多肽的溶解度。由于多肽的溶解特性取决于其氨基酸成分。在选择适当的溶剂之前我们建议先查一下多肽的氨基酸序列， 1、 碱性多肽（碱性氨基酸数量＞酸性氨基酸数量）应该先用小量酸性氨基酸溶液（例如：醋酸或三氟醋酸）溶解，然后稀释剂所需的浓度。制备高浓度的储存液时，应用80%醋酸溶解多肽。也可用20%醋酸溶解减少醋酸对于检测系统的不良影响。 2、 酸性多肽（酸性氨基酸数量＞碱性氨基酸数量）应该先用小量碱性氨基酸溶液（例如0.1%氨水，NH4OH）,然后用水稀释到所需的浓度。应该注意，对于含有半胱氨酸(Cysteine)的多肽要避免使用氨水，因为在PH碱性条件下会促使二硫键的形成。 3、 中性或者高度疏水性多肽，含有许多极性不带电荷的氨基酸或非极性疏水性氨基酸，应该用小量的有机溶剂（例如：DMF，甲醇，丙醇，异丙醇，DMSO）溶解，因为DMSO可形成氨基酸甲风化。 4、 离液剂（例如尿素，盐酸胍）有时用来溶解凝聚的多肽，但如有可能应当尽量不用，因为离液剂会干扰多肽的生物学应用。在个别情况下，多肽的溶解时间较长，甚至达几个小时，在水浴中超声波打几分钟可促使大颗粒多肽的溶解。但是不要加度加热。含有Trp,Met,Cys的多肽要额外小心避免氧化，应该用无
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超声波在化工领域中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
超声波由于其在传质、传热和化学反应等方面的产，己成为世界各国研究的热点，特别是美、英、法、独特作用以及随着超声功率设备的研制和普及，逐渐日、俄等国在工业化方面已取得一些进展。我国的科技发展成为一门新兴交叉学科——声化学。它的发展受工作者在理论及应用方面也做了大量工作。 所谓的超声波一般是指频率范围在20k～10MHz的声波，其在化学领域的应用动力主要来源于超声空化。随着强烈的冲击波和速度高于100m/s的微射流，冲击波和微射流的高梯度剪切可在水溶液中产生羟基自由基，相应产生的物理化学效应主要是机械效应(声冲流，冲击波，微射流等)、热效应(局部高温高压，整体升温)、光效应(声致发光)和活化效应(水溶液中产生羟基自由基)，四种效应并非孤立，而是相互作用、相互促进，加快反应进程。 本文综述了近年来超声波在化工领域中主要应用情况，以期促进超声波技术在工程中的研究和应用推广。 1 清洗 超声清洗是超声波的主要应用之一，与其他清洗相比，超声清洗具有效率高、质量好，可清洗复杂零件、深孔、盲孔及狭缝中的污物，且易于实现清洗自动化等特点。目前，超声波清洗机生产企业已从20世纪90年代初的几家发展到现在的几百多家。随着我国国民经济进一步发展，它必定成为许多工业、医疗、环保等部门不可缺少的一种工艺手段。 超声波清洗机的工作频率根据清洗对象，大致分为三个频段：低频超声清洗(20～50kHz)，高频超声清洗(50～200kHz)和兆赫超声清洗(700k～1MHz以上)。低频超声清洗适用于大部件表面或者污物和清洗件表面结合强度高的场合。频率的低端，空化强度高，易腐蚀清洗件表面，不适宜清洗表面光洁度高的部件，而且空化噪声大。40kHz左右的频率，在相同声强下，产生的空化泡数量比频率为20kHz时多，穿透力较强，但空化强度较低，宜清洗表面形状复杂或有盲孔的工件和清洗污物与被清洗件表面结合力较弱的部件，并且空化噪声较小。高频超声清洗适用于微电子元件的精细清洗，如磁盘、驱动器、读写
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