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研域讨论: 血清的主要成分包含了哪些？
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
血清是由血浆去除纤维蛋白而构成的一种很杂乱的混合物，其组成成份虽大部分已知，但还有一部分尚不清楚，且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。血清中含有各种血浆蛋白、多肽、脂肪、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等，这些物质对促进细胞生长或按捺生长活性是到达生理平衡的。 针对血清的成分和作用的研究虽有很大发展，但仍存在一些问题。主要是： 1.血清的成份可能有几百种之多，目前对其准确的成份、含量及其作用机制仍不清楚，尤其是对其间一些多肽类生长因子、激素和脂类等没有充分认识，这给研究工作带来许多困难。 2.血清都是批量生产，各批量之间差异很大，而且血清保存期至多一年，因此，要保证每批血清的相似性极为困难，从而使试验的标准化和连续性受到限制。
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日本三菱MGC 7L密封厌氧培养盒供应商3.5L罐子
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
日本三菱MGC 7L密封厌氧培养盒供应商3.5L罐子 日本三菱MGC 3.5L密封厌氧培养罐 3.5L密封厌氧培养罐 产品货号：c-33 包装规格：1只/包 规格尺寸(W*L*H)：17×24×8cm，体积：3.5L。 罐体材料：Polycarbonate 可耐受温度：－50℃~140℃ 密封材料：Polyacetal 可耐受温度：－30℃~140℃ 外观透明，可分别放置15 只标准培养皿（直径：9cm）。 三菱瓦斯化学株式会社MITSUBISHI GAS CHEMICAL CO., INC. 厌氧产气袋AnaeroPackTM-Anaero： 于2.5L 或以上体积密封罐，药剂放入容器密封后，容器内的氧气在0.5~1 小时内被完全吸收，同时产生等量的二氧化碳，适合厌氧菌培养。 微需氧产气袋AnaeroPackTM-MicroAero 药剂放入容器密封后，容器内的氧气在0.5~1 小时内被吸收一半，同时产生等量的二氧化碳，O2 浓度变为8-9%，CO2 浓度变为7-8%， 二氧化碳产气袋AnaeroPackTM-CO2 药剂放入容器密封后，容器内的氧气部分吸收，浓度变为15%左右，二氧化碳浓度变为6%左右，适合嗜二氧化碳菌培养。 培养基脱氧剂AnaeroPackTM-Keep 当厌氧菌要求苛刻时，用于对培养基的预还原，室温下5-6 小时内，能够将培养基中的溶解氧完全吸收。 氧气指示剂Oxygen-Indicator： 无氧状态（O2＜0.1%）：浅紫色到粉红色； 有氧状态（O2＞0.5%）：淡蓝色到深蓝色。 用于检测氧气的存在，可重复使用4-5 次，受氧气、温度等因素影响，敏感性逐渐降低。 自封口式密封培养袋： 自带封口条，外观透明，易于操作，易于观察。 品名 编号 包装规格 用途、配套及培养量 2.5升系列产气袋（AnaeroPack 安宁包） 厌氧产气袋 C-1 10只/包 完全厌氧菌培养；适用于2.5L或7L密封培养罐 微需氧产气袋 C-2 10只/包 微需氧菌培养；适用于2.5L或7L密封培养罐 二氧化碳产气袋 C-3 10只/包 嗜二氧化碳菌培养；适用于2.5L或7L密封培养罐 AnaeroPack-Anaero-5% A-7 10只/包 低氧试验用；适用于2.5L或7L密封培养罐 3.5升系列产气袋（AnaeroPack 安宁包） 厌氧产气袋 C-35 10只/包 完全厌氧菌培养
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注意事项：抗体试剂的保质期与储存温度
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
根据产品的不同品牌、功用，其保质期是不必定的；抗体试剂的保质期与储存温度有着亲近的关系，以下为我司技术部整理出来的以供大家参考：抗体因为性质和所运用的储存条件不同，其存储的“保质期”可能从几周到几年不等。一些确诊性抗体被证明通过12-在4℃的储存能坚持其功用。抗体的储存时刻取决于抗体固有的性质和储存条件。抗体（尤其是酶）有必要存放在恰当的温度和pH值规模。一、抗体保存温度要求一般来说，抗体存放在≤4℃的清洁，灭菌的玻璃或塑料管。储存在室温下一般会因为微生物的生长导致抗体退化和/或失活。抗体储存液放在4℃环境中1天或许几周内其活性不会遭到显着影响。一般我们为了防止重复冻融，能够分装抗体。还能够参加抗微生物药物以防止微生物的生长。二、抗体储存和运送的干冰运用研究标明蛋白的储存和运送常用的干冰可引起存储液的酸化，导致蛋白调集或堆积。这个问题在酸性蛋白（这些蛋白在pH小于7）上更显着。多克隆IgG抗体倾向于呈酸性，pH为4.7-7.5。因此，蛋白和抗体必需储存在气密封的小瓶和/或气密封的塑料袋里，以尽量削减干冰酸化的问题
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试剂盒标本处理
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
试剂盒样本处理及要求1. 血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。3. 尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。6. 标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.7. 不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
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ELISA试剂盒的这些事项要注意
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
ELISA试剂盒的这些事项要注意使用ELISA检测试剂盒进行试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应。在ELISA中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。包被抗体（或抗原）的选择：将抗体（或抗原）吸附在固相载体表面时，要求纯度要好,吸附时一般要求PH在9.0～9.6之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采用4℃18～24小时。蛋白质包被的适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度（0.1、1.0和10μg／ml等）进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的OD值。选择OD值大而蛋白量少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为1～10μg／ml。除此之外还要注意以下事项：1.确定ELISA检测试剂盒在有效期内；2.仔细阅读说明书；3.按说明书确定所有试剂齐全（数量、体积）；4.标本制备要规范，每份标本体积要按2-3个复孔以上的量制备，尽量分装做备份。短期内无法实验者，注意低温保存；5.根据检测标本数量确定所需试剂的量；6.准备好所有实验额外所需物品，如试管、吸头、移液器、离心机等；7.按说明书将所用试剂平衡至室温，配制所需试剂。
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ELISA试剂盒实验中需留心的细节
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
为了确保实验的成功，ELISA试剂盒实验中需留心下列的细节 1. 严格按照规定的时刻和温度进行温育以保证成果。一切试剂都必须在运用前到达室温20-25℃。运用后当即冷藏保存试剂。 2. 洗板不正确能够导致不的成果。在加入底物前确保尽量吸干孔内液体。温育过程中不要让微孔枯燥掉。 3. 消除板底残留的液体和手指印，否则影响OD值。 4. 底物显色液应呈无色或很浅的色彩，现已变蓝的底物液不能运用。 5. 防止试剂和标本的穿插污染以免形成错误成果。 6. 在储存和温育时防止强光直接照射。 7. 平衡至室温后再打开密封袋以防水滴凝聚在冷板条上。 8. 任何反响试剂不能触摸漂白溶剂或漂白溶剂所散发的强烈气体。任何漂白成分都会损坏试剂盒中反响试剂的生物活性。 9. 不能运用过期产品。 10. 假如可能传播疾病，一切的样品都应管理好，按照规定的程序处理样品和检测设备。
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敌草快纯度检测方式
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
一、概 述 本标准物质主要用于生产部门和检测实验室对产品质量的控制、环境和食品领域相应残留检测、分析仪器的校准、检测方法确认评价等。 二、原材料来源和制备工艺 本标准物质候选物是通过定制相应纯品，并根据其物化特性，通过重结晶、柱层析等方法进一步纯化后制得，经定性和定量分析满足要求后，进行干燥分装(CAS号：6385-62-2)。 三、认定值和不确定度 编号 名称 标准值（%） 扩展不确定度（%）（k=2) SPL-BG-083 敌草快纯度标准物质 99.0 0.5 四、均匀性和稳定性检验 参照JJG1006-94《一级标准物质技术规范》，随机抽取分装后的样品，小取样量为3-5mg，采用差示扫描量热法（DSC）对纯度进行均匀性检验、稳定性考察。检测结果表明均匀性和稳定性良好。 经标准物质稳定性跟踪考察，有效期为自定值日期起2年。研制单位将继续检测该标准物质的稳定性，有效期内如发生量值变化将及时告知用户。 五、特性量值的测量方法 采用差示扫描量热法（DSC）和色谱归一法进行测量。 六、溯源性描述 经中国上海测试中心行业测试点对其定值，通过使用满足计量学特性要求的测量方法和计量器具，保证其溯源性。 七、正确使用说明 用前必须在干燥其中恢复至室温后方可称量：样品开封后，应尽快恢复密封状态，在规定条件下保存。 八、运输和贮存 本纯度标准物质采用5mL棕色螺口玻璃瓶包装。低温（0-8℃）、避光、干燥条件下保存。 九、安全 本标准物质属于有毒有害物质，使用时应注意防护，避免吸入或皮肤接触。
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敌草快纯度标品的出来流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
一、概 述 本标准物质主要用于生产部门和检测实验室对产品质量的控制、环境和食品领域相应残留检测、分析仪器的校准、检测方法确认评价等。 二、原材料来源和制备工艺 本标准物质候选物是通过定制相应纯品，并根据其物化特性，通过重结晶、柱层析等方法进一步纯化后制得，经定性和定量分析满足要求后，进行干燥分装(CAS号：6385-62-2)。 三、认定值和不确定度 编号 名称 标准值（%） 扩展不确定度（%）（k=2) SPL-BG-083 敌草快纯度标准物质 99.0 0.5 四、均匀性和稳定性检验 参照JJG1006-94《一级标准物质技术规范》，随机抽取分装后的样品，小取样量为3-5mg，采用差示扫描量热法（DSC）对纯度进行均匀性检验、稳定性考察。检测结果表明均匀性和稳定性良好。 经标准物质稳定性跟踪考察，有效期为自定值日期起2年。研制单位将继续检测该标准物质的稳定性，有效期内如发生量值变化将及时告知用户。 五、特性量值的测量方法 采用差示扫描量热法（DSC）和色谱归一法进行测量。 六、溯源性描述 经中国上海测试中心行业测试点对其定值，通过使用满足计量学特性要求的测量方法和计量器具，保证其溯源性。 七、正确使用说明 用前必须在干燥其中恢复至室温后方可称量：样品开封后，应尽快恢复密封状态，在规定条件下保存。 八、运输和贮存 本纯度标准物质采用5mL棕色螺口玻璃瓶包装。低温（0-8℃）、避光、干燥条件下保存。 九、安全 本标准物质属于有毒有害物质，使用时应注意防护，避免吸入或皮肤接触。
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H9c2（2-1）-LUC大鼠心肌细胞-荧光素酶标记 培养步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
细胞名称 ： H9c2(2-1)-LUC大鼠心肌细胞-荧光素酶标记 培养步骤 组织 大鼠乳腺癌细胞系 母细胞来源 客户 转染方法与标记过程的描述 慢病毒转染Hygromycin筛选 1.质粒部分 1.酶切载体：pGL4.10（luc2）由酶切获得1400bp的luc2基因片断；EGFP和mCherry片段由PCR扩增获得700-800bp左右片段；pSin-hyg-T2A载体酶切线性化。 2.电泳和胶回收：上述酶切产物DNA电泳，TAKARA试剂盒胶回收，回收产物取少量电泳鉴定。 3.连接载体与目的片段:使用Invitrogen T4连接酶连接luc2、EGFP或mCherry片段和pSin-hyg-T2A线性化载体，连接使用20ul体系，25℃，10min。 4.转化：感受态菌One Shot Stbl3在冰上融化后，加入连接产物，静置25min后在水浴42℃，45sec热休克，后加入250ul无抗培养基225转摇菌1h，将转化的菌铺于有氨苄抗性平板37度过夜。 5.挑取单克隆：观察平板后挑取15个单克隆至含2ml氨苄抗性 LB培养基摇菌管中，255转摇菌6.5h。 6.小抽质粒与鉴定：使用碱裂解法小抽，质粒用25ul含RNA酶ddH2O溶解；酶切鉴定: 重组质粒用通过酶切鉴定。 7.荧光素表达鉴定: 重组质粒pSin-hyg-GFP/luc2（以下简称Gluc）或pSin-hyg-mCherry/luc2（以下简称Mluc） 转染293T细胞：DNA定量后，使用PEI转染Gluc或Mluc至24孔板已预铺的293T细胞中。转染采用脂质体法转染，试剂采用JetPEI (Polyplus公司)。两管EP管中分别加入50ul生理盐水，其中一管加入1ug量的质粒（DNA体积=1ug/DNA浓度），轻轻震荡混匀，再轻微离心；在另一管中加入PEI 2ul轻轻震荡混匀，轻微离心，然后把PEI管中的溶液加入含有的质粒管中，室温孵育20min。将脂质体包绕DNA的混合液加入需要转染的24孔内，37 ℃、5 % CO2条件下培养，8小时后换培养液。 8.报告基因检测：Passive Lysis Agent裂解细胞，加入荧光素酶作用底物，将转染质粒的细胞与阴性，阳性对照共同进行单报告基因检测。培养步骤： 1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合
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逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
原位杂交实验 1 探针的设计与合成 1) 根据实验室已有的p8 基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和 p82，以卤虫 cDNA 为模板，PCR 扩增得到 346bp 的产物，用 Takara 胶回收试剂盒 回收纯化。 引物编号 引物序列 长度 p81 TGCGGACGAAACAGGAAG 18 bp p82 GCTCAAACAGTGATGCCAGT 20 bp 2) 目的片段克隆 a. 在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝 胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下： 目的PCR片段 5 μl pGM-T载体（约50ng/uL） 1 μl 10×T4 DNA Ligation Buffer 1 μl T4 DNA Ligase（3U/uL） 1 μl 无菌去离子水 3 μl 总体积 10 μl b. 轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于 PCR 仪中 16℃过夜连接，反应结束后 将离心管置于冰上。 c. 向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG （50mg/ml）、40 μl的X-gal （20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于 37℃培养箱 1-3 小时， 使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。 d. 将10 μl的连接产物加到100 μl DH5感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心 管置于 42℃水浴 90 秒，取出管后立即置于冰浴上放置 2-3 分钟，其间不要摇动离心管。 向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养 45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心 10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌 的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。 e. 挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。 f. 将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行 序列测序。 3) 重
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Cell警示：基于身高或智商等特征的胚胎选择并不现实
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
一直以来，“设计婴儿”的想法一直存在，特别是体外受精和用于筛查遗传性疾病的胚胎技术出现之后。虽然近期人类胚胎CRISPR编辑婴儿引发了的探讨，但对胚胎进行遗传“增强”的实用方法还是对IVF胚胎进行植入前遗传筛选。 然后，11月21日Cell杂志上的一项研究指出，通过多基因（而不是由单一突变引起的遗传性疾病）筛选性状特征其实比大多数人意识到的要复杂得多。 文章作者，耶路撒冷希伯来大学Shai Carmi说：“对胚胎进行基因组测序，现在肯定比五年前要容易得多，而且我们也知道更多与某些性状有关的基因变异。但是选择具有特殊性状的胚胎非常有争议，除非它与像囊性纤维化这样的严重疾病有关，因此这引发了许多与优生学和机会不平等有关的问题。” 结果发现这些理论后代的预期优势相对较小。就智商而言，它增加到高于胚胎平均水平的高点是3分。而对于高度来说，它增加到高于平均高度的大高度为3厘米。Carmi的团队模拟分析了根据智商和身高等多个基因导致的性状来筛选胚胎的可行性，结果发现我们目前对这些类型的性状的遗传学知识可能不足以在IVF胚胎选择中大幅增加所需的性状。 在这项研究中，研究人员利用真实人的基因组序列进行了计算机模拟，模拟假想的胚胎基因组图谱，这些假想的胚胎是由一些是实际的夫妇，或者人工配对的进行筛选。在模拟中，他们假设每对夫妇将有十个胚胎可供选择。然后根据模拟胚胎基因组中的基因变异，预测每个后代的智商或成年身高。这一实验是基于选择得分高的胚胎进行植入这一假说进行的。 Carmi说：“这些特征有很多是无法预测的。如果有人选择了一个智商比平均水平高出两点的胚胎，那不能保证它会真正导致智商的提高。因为在已知的基因变异中并没有考虑很多变化性”。 Carmi指出还存在其他一些局限性，这使得准确筛选具有所需性状的胚胎非常困难。 研究人员使用每对夫妇的十个胚胎进行了模拟，但实际上，许多夫妇在进行体外受精时获得的存活胚胎要少得多。例如，对于五个胚胎，增益将降低
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MLPA在研究和诊断中的力量
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
北京华新康信生物科技有限公司代理MRC-Holland品牌。北京华新康信生物科技有限公司是MRC-Holland品牌代理商。 TR118-200 MRC-Holland 大量现货，欢迎电联，真诚合作共赢。 BP1511 BCP MRC-Holland 大量现货，欢迎电联，真诚合作共赢。 MRC-Holland MRC-Holland 北京代理，MRC-Holland 北京总代理，MRC-Holland华北代理，MRC-Holland华东代理，MRC-Holland华南代理， MRC-Holland华中代理，MRC-Holland代理，MRC-Holland 代理，MRC-Holland产品，MRC-Holland现货，MRC-Holland各系列产品，MRC-Holland知识介绍，MRC-Holland技术服务，MRC-Holland咨询服务，MRC-Holland合作服务，欢迎电联，真诚合作，合作共赢。 MRC-Holland代理 北京华新康信生物科技有限公司 北京华新康信生物科技有限公司专注于生命科学领域，由丰富从业经验的技术团队和管理团队组建而成，主营生物化学试剂，仪器，实验耗材等。 1广泛的产品辐射领域，试剂，耗材，仪器等。 2产品种类齐全，北京华新康信与国外诸多生命科学领域*合作众多，代理品牌Glycan Therapeutics，Intact Genomics，Integral Molecular，Medkoo，Niomech，Terragene，Anshlabs wako，EZbioscience，CMCTAG，Anatrance ，Favorage ，Affinity，Advanced biomatrix，bioplastics，天地人和，TRC，凯杰，义翘，sciencell；价格优势品牌：seracare，Streck，Toxin，Zeptometrix，sigma，ForteBio，CanSyn，MRC-Holland，santa，chormsystems，bethyl ，moltox， permagenlabware ，bioflux，Bio－Rad， coriell， listlabs， ZYMO ， ABclonal ， EY laboratories ，greatcellsolar ， agdia ， beckman ， Bioxcell，，biomax ，usascientific ， TRC ，MRC-Holland ，americanelements，cayman ， Fisher ，thermofisher ， nanopore， 日立， 三菱株式会社 ，RD， takara等，紧跟生命科学的发展，不断满足客户的需求，为各位的科研之路上添砖加瓦！ 3 一手货
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细胞凋亡检测实验（Annexin V/PI 双染色法）
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
细胞凋亡检测可以：（1）用于肿瘤细胞和组织在内的不同种类病理标本研究；（2）应用 于临床诊疗，新药研制、生物制品开发、肿瘤放化疗、以及从促凋亡角度探索肿瘤的基因治 疗；（3）对相关疾病的早期发现、放化疗的疗效评价具有举足轻重的地位。 1、实验方法和原理 细胞凋亡早期改变发生在细胞膜表面，目前早期识别仍有困难。这些细胞膜表面的改变之一 是磷脂酰丝氨酸（PS）从细胞膜内转移到细胞膜外，使 PS 暴露在细胞膜外表面。PS 是一 种带负电荷的磷脂，正常主要存在于细胞膜的内面，在细胞发生凋亡时细胞膜上的这种磷脂 分布的不对称性被破坏而使 PS 暴露在细胞膜外。 Annexin V 是一种 Ca+依赖的磷脂结合蛋白，初发现是一种具有很强的抗凝血特性的血 管蛋白，Annexin V 具有易于结合到磷脂类如 PS 的特性。对 PS 有高度的亲和性。因此， 该蛋白可充当一敏感的探针检测暴露在细胞膜表面的 PS。 PS 转移到细胞膜外不是凋亡所独特的，也可发生在细胞坏死中。两种细胞死亡方式间的差 别是在凋亡的初始阶段细胞膜是完好的，而细胞坏死在其早期阶段细胞膜的完整性就破坏了。 因此，可以建立一种用 Annexin V 结合在细胞膜表面作为凋亡的指示并结合一种染料排除 试验以检测细胞膜的完整性的检测方法。 2、实验材料、试剂、仪器和耗材 细胞； HEPES 缓冲液、NaCl、CaCl2、PI、ANNEXIN V-FITC 试剂盒； 流式细胞仪。3、实验步骤 一、试剂与仪器 1. 孵育缓冲液：10 mmol/L HEPES/NaOH，pH7.4，140 mmol/L NaCl，5 mmol/L CaCl2。 2. 标记液：将 FITC- Annexin V（宝灵曼公司产品）和 PI 加入到孵育缓冲液中，终浓度均 为 1 ug/ml。 3. 流式细胞仪。 二、实验步骤 1. 细胞收集：悬浮细胞直接收集到 10 ml 的离心管中，每样本细胞数为（1~5）×106/mL 500~1 000 r/min 离心 5 min，弃去培养液。 2. 用孵育缓冲液洗涤 1 次，500~1 000 r/min 离心 5 min。 3. 用 100 ul 的标记溶液重悬细胞，室温下避
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抗肿瘤药物 5-氟尿嘧啶对肿瘤细胞迁移的影响 （细胞划痕法）
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
实验导读 瘤组织的增殖失控、瘤细胞的分化异常、瘤细胞具有侵袭和转移的能力是恶性肿瘤基 本的生物学特征，而侵袭和转移又是恶性肿瘤威胁患者健康乃至生命的主要原因。因此研究 肿瘤侵袭和转移的规律及其发生机制，对恶性肿瘤的防治有重要意义。 肿瘤转移是指恶性肿瘤细胞从原发部位侵入淋巴管、血管或体腔，至靶组织或靶器官， 长出与原发瘤不相连续而组织学类型相同的肿瘤。前者称为原发瘤，后者称为转移瘤或继发 瘤。 图 1 肿瘤转移示意图 根据肿瘤异质性理论，大多数恶性肿瘤初虽属单克隆起源，但它在不断增殖演进至 临床明显的肿瘤时，由于瘤细胞遗传性状的不稳定性(来自基因突变或缺失等)而不断地变 异，造成该肿瘤内瘤细胞亚群表型的多样性，诸如瘤细胞的侵袭性、生长速率、转移能力， 核型乃至对激素的反应性和抗肿瘤药物的敏感性等，这些瘤细胞亚群具有被此不同的特性即 所谓异质性。异质性与肿瘤转移直接有关的就是癌细胞的转移潜能，癌细胞的转移潜能有高 低之分，具有高转移潜能的筋细胞易发生转移。 肿瘤细胞的运动性，来源于细胞运动“接触抑制”的概念。通过体外培养正常和恶性结 缔组织细胞，发现正常纤维母细胞在移动过程中引起的皱栖脑膜与其他细胞的表面接触时， 往往产生细胞膜活动的抑制和移动中细胞的缩短，然后停止。当纤维母细胞生长过程中在培养皿上融合形成一单层时，细胞运动即显著受到抑制。间变的肉瘤细胞则缺乏接触抑制，瘤 细胞的运动不会被正常纤维母细胞所抑制。 针对肿瘤转移这一复杂的过程，人们研制了各种抗转移药物，如血小板凝集抑制剂、血 管生成抑制因子、内皮稳定因子、干扰素－α 以及其他化学药物。 细胞划痕法是测定了肿瘤细胞的运动特性的方法之一。其借鉴体外细胞致伤愈合实验模 型，在体外培养的单层细胞上，划痕致伤，然后加入药物观察其抑制肿瘤细胞迁移的能力。 下图即为划痕实验的示意图，图中可见，在细胞层上出现一道空痕（A），当加入药物后，
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细胞周期测定实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-01
细胞计数法： 实验方法原理 体外培养细胞 生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线 有1定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞 群体中分裂细胞 所占的百分比，它是测定细胞 周期的1个重要指标，也 是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验材料 细胞 试剂、试剂盒 胰酶 甲醇 培养液 冰醋酸 Giemsa 染液 仪器、耗材 CO2 培养箱 普通显微镜 培养皿 盖玻片 吸管 实验步骤 1、消化细胞 ，将细胞 悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 二、CO2 培养箱中培养 48 小时，使细胞长在盖片上。 三、取出盖片，按下列顺序操作： PBS 漂洗 3 分钟→甲醇：冰醋酸=3：1 固定液中固定 30 分钟→Giemsa 液染色 10 分钟→ 自来水冲洗。 四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 五、计算 分裂指数=分裂细胞 数/总细胞 数×100% 展开 注意事项 1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 其他 1、Giemsa 染液配制 称 Giemsa 粉末 0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为 33 ml）。56℃ 中保温 90-120 分钟。加入 33 ml 甲醇，置棕色瓶中保存，此为 Giemsa 原液。使用时按要求用 PBS 稀释。1般稀释 10 倍。 BrdU 参入法 实验方法原理 细胞周期指细胞1个世代所经历的时间。从1次细胞分裂结束到下1次分裂 结束为1个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其 他方法测群体周期。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞 DNA 复制的原料，经过两个细 胞周期后，细胞中两条单链均含 BrdU 的 DNA 将占 l/2，反映在染色体上应表现为1条单 体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约1半为两条单体均浅染，另1半为1深1浅。细 胞如果仅经历了1个周期，则两条单体均深染。计分裂相中各期比例，就可算出细胞周期的 值。 实验材料 细胞 试剂、试剂盒 BrdU 甲醇
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