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土壤样品前处理的三种形式
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
现在的土壤监测法规已形成，全国的土壤环境监测系统如火如荼的建设中。作为土壤监测重要的一环，土壤的样品前处理至关重要。土壤样品前处理要求处理的土壤保持形态，没有物质流失，为准确判定土壤性质保驾护航。目前土壤样品前处理有三种形式：风干处理，烘干处理和冻干处理。本文详细介绍常见的风干处理和冻干处理法。 环境监测土壤样品原干燥方式：风干处理 采集的土壤样品放在样品盘上或用牛皮纸垫放在样品架上，摊成薄薄的一层，置于干净整洁的室内通风处自然风干。干燥时间一般在几天和半个月之间，以天气状况和湿度状况为准。 环境监测土壤样品现干燥方式：土壤冻干机干燥法 采集的土壤样品放在样品盘上，摊成20mm左右厚度，置于Pilot5-8ES土壤冻干机内，设置冻干程序，一键启动。干燥时间一般在24小时之内，以样品的厚度为准，超过20mm厚度时间会延长。 技术解析： 土壤样本处理一直采取风干或低温烘干的方式处理。缺点是效率低，干燥长。对于多样本量无法及时处置。几年前，一些环保监测部门率先采用进口冻干机作为干燥的处置设备，但由于采用的是通用而非专用设备，导致高投入，低回报。在土壤样品干燥处理方面市场空白的前提下，博医康组织科研力量，历时3年研制出土壤专用冻干机。 截止目前为止，博医康公司已形成完整的土壤监测样品前处理方案。土壤样品前处理方案涵盖土壤样品检测前元素的冻干锁定，土壤有机物的冻干锁定，土壤原形态的锁定，确保土壤样品检测前的物质保持，以保证土壤样本监测的真实性及有效性。 博医康土壤样品前处理方案硬件涵盖土壤冻干机（pilot5-8ES）、可挥发性有机物收集器，土壤冻干物质防流失保护装置等。 博医康土壤冻干机及解决方案已输送至部分省份的土壤监测的一线。接下来博医康将研制更多的环保设备服务中国环保事业，造福人类。
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亿康基因的MALBAC®技术在三代试管婴儿中单基因遗传病检测上的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
案例分享 2016年12月21日16时58分，随着一声清脆的啼哭声，承载着整个家庭梦想的“珍贵儿”诞生了。几天后的新生儿听力筛查结果显示：该婴儿听力完全正常。望着这个健康可爱的小宝贝，一家人喜极而泣。至此，这个家庭的显性遗传性耳聋被彻底阻断了。 此新生儿的奶奶及父亲均是耳聋患者，为了下一代能够彻底摆脱耳聋的困扰，他们四处奔波求医，希望查明致病原因，生育健康的宝宝。2015年6月，他们慕名来到解放军总医院求诊，通过新一代测序技术终于确定了给该家族带来耳聋困扰的是一个名为EYA4的耳聋基因发生了剪切突变（即单基因遗传病）。由于EYA4基因为常染色体显性遗传，这对夫妇如果自然生育，下一代会有50%的概率为耳聋患者。 为帮助这个家族彻底阻断困扰他们多年的耳聋“幽灵”，解放军总医院决定采用亿康基因的MALBAC®技术来帮助他们阻断耳聋基因的垂直传递生育健康婴儿。在充分知情同意后，他们很快进入三代试管婴儿周期。体外受精共获得14枚胚胎，这些胚胎全部由亿康基因进行MALBAC-PGD™/PGS™检测，检测报告显示：14枚胚胎中共有5枚胚胎是健康的（既无染色体异常也不含EYA4致病位点）。根据检测报告并结合胚胎形态学等因素综合考虑后，选取了一枚各项参数均最优的胚胎植入母体内，该枚胚胎成功着床，正常发育，顺利帮助这个家庭实现了生育健康宝宝的愿望。 图注：王秋菊教授（前排左）、彭红梅副教授（前排右），亿康基因北京分公司副总监张凤环（后排左二）等与新生儿合影 截至2017年，亿康基因运用MALBAC-PGD™技术成功阻断单基因遗传病150余种，已帮助2000多个家庭获得健康的宝宝。 这项技术为现今已知最有效阻断家族单基因遗传疾病、降低出生缺陷率的方法，适用于大部分致病突变基因明确的单基因遗传性疾病。 为了“小小王”不再重蹈他爸爸“小王”和他爷爷“隔壁老王”的覆辙。让我们通过下面的内容来进一步来了解单基因遗传病的相关知识，我们的目标是:争取通过三代试管婴儿技术把单基因遗传病扼杀在
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荧光定量PCR的操作流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
1 样品RNA的抽提 ①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。 ②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。 ③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。 ⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA质量检测 1）紫外吸收法测定 先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 ① 浓度测定 A260下读值为1表示40 ?g RNA/ml。样品RNA浓度(?g/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 ?g/ml。具体计算如下： RNA溶于40 ?l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495?l的TE中，测得A260 = 0.21 RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 ?g/ml = 840 ?g/ml 或 0.84 ?g/?l 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 ?l，剩余RNA总量为： 35 ?l × 0.84 ?g/?l = 29.4 ?g ②纯度检测 RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。 2）变性琼脂糖凝胶电泳测定 ①制胶 1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。 10×MOPS电泳缓冲液 浓度 成分 0.4M MOPS，pH
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体外细胞原代培养和传代培养实验步骤（1）冻存和复苏
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
一、实验原理 细胞培养可分为原代培养和传代培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养为原代培养；当原代培养的细胞增殖达到一定密度后，则需要做再培养， 即将培养的细胞分散后，从一个容器以1：2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养，为传代培养，传代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多采用甘油或DMSO作保护剂，这两种物质能提高 细胞膜对水的通透性，加上缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少由于冰晶形成造成的细胞损伤。复苏细胞应采用快速融化的方 法，这样可以保证细胞外结晶在很短的时间内即融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 二、实验方法 材料： 小鼠，生理盐水，100ml灭菌烧杯，15ml离心管，培养皿，滴管，无菌镊子、剪刀，筛网，泡沫板，大头针，酒精灯，培养瓶，培养 液，PBS，0.25%胰酶，超净工作台、二氧化碳培养箱、倒置显微镜，显微镜，计数板，离心机，恒温水浴箱，冰箱（4℃、-20℃、-70℃），液氮 罐，冻存管，冻存液，废液缸等。 方法： （1）原代培养： 1.取出小鼠后沥干酒精，放入超净台内，固定在泡沫板上。 2.用镊子提起皮肤，用解剖剪剪开皮肤一个横切口，将皮肤向上撕开，然后剪开肌肉等，暴露出腹腔，在左侧找到脾脏，用弯头眼科镊取出脾脏，置于无菌培养皿中。 3.用生理盐水将取出的脾脏清洗多次，并剔除多余无用的组织。 4.将筛网置于平皿中，脾脏置于筛网上，用弯头镊镊住，轻轻在筛网上进行碾磨，同时不停滴加不含血清的培养液冲洗。 5.将碾磨好的细胞悬液吸入至离心管中，离心(1000rpm,5min)，吸去上清（去除血液等）。 6.加入10ml培养液，吹打混匀，取样计数。 7.将稀释好的细胞悬液分装于培养瓶中，轻轻摇晃混匀，在培养瓶上。 面做好标志，注明细胞、组别及日期。然后将培养瓶置于二氧化碳
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银离子抗菌涂层机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
Esco生物安全柜采用ISOCIDE抗菌涂层，这种抗菌涂层为银离子和环氧树脂的混合物，能有效抑制微生物在生物安全柜表面的附着和繁殖，为工作人员提供了更好的安全防护。 抗菌钢按抗菌性能的产生方式一般可分为两种：镀膜式和自身抗菌式（或称合金式）。前者是在钢材表面镀上带有杀菌性的金属材料 （如Ag）或其他有杀菌作用的无机材料薄层；后者是在钢的冶炼过程中添加具有抗菌作用的金属元素（如Cu）,再通过特殊热处理使钢材本身产生抗菌性。Esco生物安全柜采用的是种镀膜式抗菌钢。 由于抑菌材料是混合在安全柜外表面上的粉末涂层中，因此其抑菌作用在安全柜的寿命周期中都有效，而不会因为表面清洗而被消除。ISOCIDE抑菌材料主要成分含有银离子，具有长期抑菌作用。将此涂层应用于钢材表面，表面释放出的银离子与细菌相结合，从而抑制杆菌，真菌，霉菌及其他细菌的生长。以下机制协同发生抗菌作用： 1.电场吸附作用杀菌。因为细菌的细胞壁和细胞膜带有负电荷，而银离子带正电荷。由于异性电荷相吸，从而限制了细菌活动。细菌周围的微环境发生紊乱，呼吸受到抑制，最终导致了细菌发生“接触死亡”。并且，这一过程会使得细胞壁和细胞膜发生变形，可引起物理性穿孔破裂和细胞质溢出，这种又被称为“溶解死亡”。 2.银离子破坏细胞内的酶系统来影响正常的新陈代谢。银离子会穿透细胞壁进入细胞内，并且与疏基（—SH）反应，使蛋白质凝固，破坏细胞合成酶的活性，因此细胞会丧失分裂生殖能力而死亡。此外，银离子还能破坏生物电子传输系统、物质传输系统和呼吸系统，从而导致微生物固有成分破坏和产生功能障碍而导致其死亡。 3.通过催化作用杀菌。在光的作用下，银离子可以激活空气中的氧，产生羟基自由基和活性氧离子，它们具有很强的氧化还原的作用，使得细菌无法进行正常能量代谢，细菌会一直处于抑制状态最后死亡。 虽然银离子具有很强的杀菌作用，但银离子抗菌涂层并不意味着可以一劳永逸地保持卫生条件，因此带有此涂层
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化学发光在磁性分离上不可忽视的问题
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
生物磁分离在免疫化学发光（CLIA） IVD试剂盒研发生产时的5个关键性误区 化学发光免疫分析(Chemiluminescent immunoassay,CLIA)将高灵敏的化学发光技术与高特异性的免疫反应结合起来，建立了化学发光免疫分析法。CLIA具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽、操作简便、使用成本低等特点。CLIA应用范围较广，既可检测不同分子大小的抗原、半抗原和抗体，又可用于核酸探针的检测。由于其优势，基于这一技术体外诊断测试的数量与日俱增。而每当一个化学发光分析仪安装在医院或诊断实验室后，其对应试剂盒的需求将可能达到一天数千套的用量。 因此，CLIA IVD试剂盒的需求量已开始飙升，但早期的小规模生产、纯人工操作和简略的质量控制手段已经无法应付大规模生产的需要。如何确保批次间的一致性；如何确保放大生产规模后质量的稳定性；如何确保成品最终应用的有效性（最终在分析仪中只使用不超过几百微升）都成CLIA IVD试剂盒生产的关键。在超过十年的发展阶段，我们发现了五个在生物磁性分离过程中的关键误区。这些误区容易被忽略但常常延误项目进度，造成重大的经济损失，有时甚至会使生产陷入风险。因此正确掌握磁性分离的技术信息是保证产品研发和生产成功的关键。 图1：新型生物磁分离系统 如何描述一个生物磁分离过程？ 当一个新的CLIA-IVD试剂盒从研发阶段转移到生产阶段时，所有的生产操作参数都需要重新调整以适应新的产量和处理体积。生物标志物的规格，缓冲液和包被的操作都得益于非磁性试剂盒生产时所积累的经验。抗体与磁珠的偶联珠与胶体金或乳胶粒子很相似，但清洗环节的操作使用磁性分离这一方法与其他非CLIA-IVD试剂盒生产有很大区别。 虽然CLIA试剂盒在生产的分离阶段使用生物磁分离似乎是显而易见的选择，但在实践的过程中仍存在着一些问题。第一个是描述整个流程本身，当和IVD试剂盒制造企业沟通时发现在生物磁分离方面，他们经常提到如下几方面： 分离时间：从缓冲体系中分离固相的时间。 磁
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如何快速的理解一篇高分SCI文章
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
各位读者大家好，感谢各位对Dr.S之前高分SCI文章解析系列软文的喜爱。近期也有不少读者反馈，有没有更简单粗暴的方法可以快速理解一篇高分SCI文章。Dr.S想说你为什么不早说呢？当然有啦。从今天起Dr.S会开一个新系列，专门服务我们高（TOU）效（LAN）的读者朋友们。 想发一篇10分左右的文章至少要具备哪些条件，我们来复习一下之前Dr.S教你的套路： → 一个新功能基因 → 新基因的三个研究层次（临床相关性，功能验证，机制探讨） 我们把这些套路给细化，可以形成一个关于课题总览的考卷，把空都填满了，项目都选对了以后你就可以尝试去投稿了，是不是很简单粗暴。 1. 新基因是通过___________找到的。 2. 验证的基因是___________功能方向的。 3. 为了验证基因功能使用了_________________等实验方法。 4. 新基因是通过________________通路/关键分子发挥的功能。 5. 新基因是否有临床相关性？（是或否） 6. 新基因是否在体内体外水平都有功能？（是或否） 7. 机制研究是否做了下游关键分子的功能回复实验？（是或否） 8. 机制研究是否做了与下游关键分子的直接互作验证？（是或否） 是不是很简单，我们可以用一篇近期发表的Hepatology的文章Up-Regulation of Histone Methyltransferase SETDB1 by Multiple Mechanisms in Hepatocellular Carcinoma Promotes Cancer Metastasis来检验一下我们的考卷。 答 案： 1. 新基因是通过 表达谱测序筛选肝癌患者癌和癌旁组织 找到的。 2. 验证的基因是 增殖及转移 功能方向的。 3. 为了验证基因功能使用了 细胞增殖实验，Transwell，裸鼠成瘤 等实验方法。 4. 新基因是通过 被Sp1和miR-29调控 发挥的功能。 5. 新基因是否有临床相关性？ 是 6. 新基因是否在体内体外水平都有功能？ 是 7. 机制研究是否做了下游关键分子的功能回复实验？ 否 Ps：这篇文章没有做回复实验，但文章也被成功接收，但是建议各位要加上这一部分，
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气相色谱仪填充柱的制备方法及注意事项介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
概述 气相色谱柱一般分为填充柱和毛细管柱，填充柱适合常规样品的定量分析，尤其是高纯度的样品；毛细管柱适合分离组成比较复杂或微量样品以及残留分析等。目前来说，在常规样品和高纯样品的定量分析时，经常使用的还是填充柱。 气相色谱仪不锈钢填充柱 毛细管柱一般为商品柱，买来后，接上仪器，老化一下即可直接使用。填充柱，大多是自己制备的，填充柱的柱效和柱的制备有很大的关系，尤其是填充物的制备。 下面就以制备5%OV-101/ChromosorbWHP玻璃色谱柱为例，简单说说填充柱的制备。 一、色谱柱的制备 1、固定液的涂渍 称取0.5g OV-101于200mL烧杯中，加入适量三氯甲烷溶解，将10 g干燥的Chromosorb W HP载体徐徐倾入，使载体完全浸没。将烧杯置于通风柜中，在红外灯下干燥，并不断搅拌至溶剂挥发干，然后移至110℃烘箱中干燥2h，备用。 2、色谱柱的填充 将一小漏斗接已经洗涤干燥的色谱柱的出口，分次把制备好的填充物填入柱内，同时不断轻敲柱壁，直至填到离柱口1.5cm处为止。将玻璃漏斗移至色谱柱的入口，在出口端塞一小团经硅烷化处理的玻璃棉，并包以薄层棉花或2层纱布，通过橡皮管接到真空泵上，开启真空泵，从漏斗处，继续缓缓加入制备好的填充物，并不断轻敲柱壁使其填充得均匀紧密。填充完毕，在入口端也塞一小团经硅烷化处理的玻璃棉，并适当压紧以保持柱内填充物不被移动。 3、色谱柱的老化 将色谱柱入口与气化室相连，出口端先不接检测器，以15mL/min流量通入载气(N2)。分阶段升温至250℃,并在此温度下至少老化24 h。 以上是采用气相色谱法检测一个农药有效成分的色谱柱制备典型操作。 二、注意事项 1、色谱柱的处理 a.玻璃柱： 新柱：接上胶管用清水直接冲洗约20分钟，然后依次用蒸馏水、乙醇冲洗，于烘箱中干燥。 注：冲洗方法：用一个干净的洗耳球吸入蒸馏水或乙醇，然后将液体用力挤入柱管中。 旧柱（指使用过的柱）：接上胶管先用清水直接冲洗约20分钟，然后将稀酸（一般为0.1mo
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紫外线杀菌灯的原理和结构详细说明
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
一、紫外线的杀菌原理 紫外线杀菌就是通过紫外线的照射，破坏及改变微生物的DNA（脱氧核糖核酸）结构，使细菌当即死亡或不能繁殖后代，达到杀菌的目的。真正具有杀菌作用的是UVC紫外线，因为，C波段紫外线很易被生物体的DNA吸收，尤以253.7nm左右的紫外线最佳。 紫外线杀菌属于纯物理消毒方法，具有简单便捷、广谱高效、无二次污染、便于管理和实现自动化等优点，随着各种新型设计的紫外线灯管的推出，紫外线杀菌的应用范围也不断在扩大。 二、紫外线杀菌灯的结构 紫外线杀菌灯（UV灯）实际上是属于一种低压汞灯，和普通日光灯一样，利用低压汞蒸汽（
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质构仪用于豆制品的检测
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
豆制品是以大豆、小豆、绿豆、豌豆、蚕豆等豆类为主要原料，经加工而成的食品。大多数豆制品是大豆的豆浆凝固而成的豆腐及其再制品。在豆制品的生产加工中，质构仪能够准确的评价其生产质量，优化豆制品的生产特性，提高生产效率。 目前，大量的文献报道了关于质构仪分析豆制品的加工生产条件优化及质量品质的判定，沈勇根[1]报道使用质构仪模拟牙齿咀嚼豆皮来研究最佳油炸工艺，并且与感官判定做了对比得出，质构仪代替感官判定是有必要的，它能方便、快速、准确地完成大量的食品品质的统计分析工作，其测试的参数为：采用HDP/VB探头，测量模式为阻力测试，测前、测中、测后探头的移动速度分别为5、5、20 mm/s，数据采集量为250pps。赵延伟[2]采用物性测试仪和感官评价法研究豆制品的质构与感官品质的相关性，结果表明了最佳测试参数为探头P/50，测试速度1.0mm/s，压缩形变量20%；不同凝固剂制得的豆腐，质构评价的咀嚼性、回复性分别与感官评价的韧性、可接受性存在相关性；不同添加物的豆腐，质构评价的回复性、弹性、黏附性分别与感官评价的结构、韧性、可接受性存在相关性；含水量不同的豆腐，质构评价的黏附性和咀嚼性分别与感官评价的可接受性和结构、韧性存在相关性；不同加工方法制成的豆制品，质构评价的弹性与感官评价的结构存在相关性。 下面为大家提供两个关于质构分析豆制品的质量品质的方法（仅供参考）： 图1是分析含水豌豆坚实度的质构图 图1 含水豌豆的质构图 本试验采用复合豆类测试刀具(HDP/MPT) 使用5kg 的力量感应元和承重平台 (HDP/90)，采用单次测试模式（Basic Single Test），探头下压深度15 mm，测前、测中、测后探头的移动速度分别为1.5 mm/s、20 mm/s、10 mm/s，图像攫取速率为200。由图1可以看出，第一个波峰是击穿样品表皮的平均值。在该点后，探针将穿刺到样品的内部。第二个波峰是样品穿刺到底板上的结果。该力高的原因是探针碰到了底板上的孔，试验测得最高峰为含水豌豆的坚实度
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气相色谱柱怎样进行安装和维护？
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
气相色谱柱是气相色谱仪的核心部分，所以色谱柱的使用、保养与维护的内容就很重要，本文主要介绍关于气相色谱柱的相关知识。 一、气相色谱柱的安装 首先，当然是色谱柱的安装。安装色谱柱可以说是气相色谱使用的入门级操作，大家一般情况下都是驾轻就熟的。但是，有几个问题还是要提起注意： 1、先将密封垫套在柱头上，此时应将柱头朝下，避免密封垫碎屑进入柱内而造成堵塞。 将石墨垫套在柱头后，应将柱头截去1-2cm。可用专门的柱切割器，也可用安倍瓶开瓶瓷片，在柱上轻划一下，然后掰断。这样可以保证柱端是整洁的，又避免了柱头污染物对分析的干扰，因为截去了穿过密封垫时可能进入柱头的污染物，或者运输过程中可能损坏的柱端。 2、柱端伸出密封垫的长度不同仪器有不同的规定，应严格按照仪器说明书确定。 总原则是进样口一端安装好后，柱端应处于分流点以上，位于衬管中央。检测器一端则是柱出口尽量接近检测点，以避免死体积造成的柱外效应。为保证柱端伸出的长度准确，可以截去柱端后，先量好柱头伸出的长度，然后在接头下方的色谱柱上做标记，拧紧街头后保证该标记正好位于接头端面。这样就避免了拧紧过程中色谱柱移动可能造成的伸出长度不准确。 3、接头不要拧得太紧，以免将色谱柱压裂或者压碎。 一般新的石墨垫用手拧紧后再用扳手拧1/4圈即可。如果是重复使用的石墨垫，则要多拧紧点，直到用手轻轻拉色谱柱拉不动为止。原则上每次安装色谱柱都要用新的石墨垫，不过同一色谱柱拆下再安装时，可重复使用石墨垫，但重复使用次数不要超过3次，否则会失去密封性。 二、气相色谱柱的维护 其次，就是色谱柱的维护。 每次安装了新的色谱柱后都要在进样前进行老化。一般办法是将柱温从60℃以5-10℃/min的速率程序升温到色谱柱的最高使用温度以下30℃，或者实际分析操作温度以上30℃，并在高温时恒温30-120min，直到所记录的基线稳定为止。如果基线难以稳定，可重复进行几次程序升温老化，也可在高温下恒定更
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漫谈核酸的提取和纯化之一：核酸分离与纯化的设计与原则
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
第一节 核酸分离与纯化的设计与原则 细胞内的核酸包括DNA与RNA两种分子，均与蛋白质结合成核蛋白（nucleoprotein）。DNA与蛋白质结合成脱氧核糖核蛋白（deoxyribonucleoprotein，DNP），RNA与蛋白质结合成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。其中真核生物的DNA又有染色体DNA与细胞器DNA之分。前者位于细胞核内，约占95%，为双链线性分子；后者存在于线粒体或叶绿体等细胞器内，约占5%，为双链环状分子。除此之外，在原核生物中还有双链环状的质粒DNA；在非细胞型的病毒颗粒内，DNA的存在形式多种多样，有双链环状、单链环状、双链线状和单链线状之分。DNA分子的总长度在不同生物间差异很大，一般随生物的进化程度而增长。如人的DNA大约由3.0×109个碱基对（base pair, bp）组成，与5 243bp的猿猴病毒（simian virus 40, SV40）相比，其长度约为后者的5.7×105倍。相对来讲，RNA分子比DNA分子要小得多。由于RNA的功能是多样性的，RNA的种类、大小和结构都较DNA多样化。DNA与RNA性质上的差异决定了两者的最适分离与纯化的条件是不一样的。 一、材料与方法的选择 （一）材料与方法的选择 临床常见的标本有血液、尿液、唾液、组织及培养细胞等；核酸分离与纯化的方法非常多，如何恰当地收集与准备材料，选择适宜的分离与纯化方法是一个首要的问题。首先我们应当明确核酸的分离与纯化并不是最终的目的，不同的实验研究与应用对核酸的产量、完整性、纯度和浓度可能有不同的要求；至于分离与纯化核酸所需的时间与成本也往往需要考虑；在不影响核酸质量的情况下，应选择安全无毒的试剂与方案。近年来，有关试剂盒的开发与自动化仪器的使用，能批量制备核酸样品，大大提高了分离与纯化的效率。 （二）选择的原则 核酸分离与纯化的方法很多，应根据具体生物材料的性质与起始量、待分离核酸的性质与用途而采取不同的方案。无论采取何种方法，都应遵循总的原则：一是保证核酸一级结构的完整性，因为完整的一级结构是核
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光化学法诱导脑缺血（MCAO）动物模型的建立
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
背景：缺血性脑血管病严重危害人类的健康，建立一种与人脑梗塞类似的动物模型使之适合溶栓**研究具有重要的研究意义和实用价值。目前被广泛应用的「阻断大脑中动脉制备局部脑梗塞动物模型」方法，由于其存在侧支循环，受累的脑组织缺血程度常不一致，梗塞灶的大小和位置也有差异，加之大脑中动脉阻断需要一定的手术技巧，故其应用受到定的限制。加之大脑中动脉阻断需要一定的手术技巧，故其应用受到一定的限制。静脉注射微血栓栓塞脑内小动脉造成的脑梗塞，受血栓大小的影响，而且栓塞部位不易控制，也有其应用局限性。 自 1984 年 Dietrich 和 Watson 等首先报道，采用光化学法诱导脑梗死动物模型以来，建立该模型的方法逐渐得到发展、完善和成熟，现已成为一种重要的脑梗死动物型，并广泛用于脑梗死的神经生化、生理、病理，以及防治等方面的研究。这里我描述一种实验报告采用光化学法诱导脑梗塞模型的建立。 1.材料准备 1.1 动物：成年大鼠，250 g 1.2 试剂： 玫瑰红 （Sigma Aldrich, Steinheim, D） 4% 多聚甲醛 （Merck KGaA, Darmstadt, D） 1.3 设备和耗材： 1.3.1小动物麻醉、脑立体定位（生产厂家：瑞沃德公司） 1.3.2显微外科手术器械包（型号：SP0003-R,生产厂家：瑞沃德公司） 1.3.3 561 mm 黄绿光激光器（型号：R-LG561-100-A5,生产厂家：瑞沃德公司）：用于对动物头部进行光刺激造模。 1.3.4 小动物保温箱（型号：912-001,生产厂家：LYON/USA），供动物手术后护理。 1.3.5 SMART3.0 小动物行为视频追踪系统（生产厂家：Panlab/Spanish），供造模后通过动物行为评判神经功能。 1.3.6脑模具（生产厂家：瑞沃德公司），供脑切片染色。 1.3.7其他辅助设备和耗材（生产厂家：瑞沃德公司） 2.实验方法 STEP1: 动物麻醉和头部固定：动物经麻醉机诱导进入麻醉，移到定位仪装置进行头部固定和麻醉维持，稳定一会后，使用镊子夹足，测试麻醉的深度，当呼吸平缓，无压足缩回反应时，说明
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蛋白-蛋白相互作用技术内容
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
技术内容 蛋白质并非孤立存在的生物分子，而是具有特定三维空间结构并与其他蛋白质相互作用，共同执行功能。因此，蛋白质的模块及空间组织与其表达水平具有同样的重要性。为了解析蛋白质组的组织结构单元而开发的基于质谱的蛋白质组学方法通常结合了质谱检测与各种生化试验。其中最经典的技术为1999[1]首次报导的亲和纯化－质谱技术（affinity purification – mass spectrametry，AP-MS）。既可进行大规模的protein interactome 构建[2]，也能针对特定条件下特定蛋白质的互作进行差异分析、时间动态分析等[3]。 图１：AP-MS技术的两种运用。 技术原理 使用亲和标签 (AP-MS) 或特异性抗体 (CoIP-MS)，在native条件下纯化与目标蛋白质相互作用的蛋白，进而使用质谱进行鉴定，通过test\control比对，过滤非特异结合蛋白，定性定量分析与特定蛋白质直接或间接作用的蛋白质。同时，结合 LFQ/TMT等定量技术，可以方便的研究特定蛋白互作关系随时间的变化情况。 图２：ＡＰ－ＭＳ技术实验原理。 样品要求 Sample Amount Antibody Tissue 200 mg Yes Cell 2×107 Yes Cell (tag) 2×107 No 案例展示 1、哈佛大学Steven P. Gygi教授实验室运用高通量AP-MS技术，进行了２594组AP-MS实验，鉴定了23744个相互作用，包括了7668个蛋白质，为研究蛋白尤其是功能未知蛋白提供了重要参考意义[2] 。 图３：高通量AP-MS技术． 2、为了更好的了解生物学过程的内在动态变化情况，苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold教授实验室运用AP-MS技术研究了14-3-3b scaffold protein 的蛋白互作组在IGF1刺激下，insulin-PI3K-AKT信号通路随时间的动态变化过程[3] 。 图４：运用AP-MS研究14-3-3 scaffold protein 互作蛋白的时间动态关系，发现５种不同的cluster模式，对研究该信号通路的动态变化过程具有重大指导意义。 参考文献 1. Rigaut, G.; Shevchenko, A.; Rutz, B.; Wilm,
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血液乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒使用说明
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
血液乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版） 主要用途 血液乙酰胆碱酯酶活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过乙酰胆碱酯酶反应系统中释放出巯基胆碱，使用Ellman试剂后，产生黄色5-巯基-2-硝基苯甲酸产物，出现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定血液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种动物和人体血液样品（血浆、血清、红细胞等）乙酰胆碱酯酶的活性检测。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。 技术背景 乙酰胆碱酯酶（Acetylcholinesterase；AchE；EC3.1.1.7），又称为红细胞胆碱酯酶（RBC cholinesterase），广泛存在于真核生物，包括某些植物，尤其在脑组织、神经肌肉连接处（neuromuscular junction）、中枢神经系统的胆碱能突触（cholinergic synapses）和红细胞膜上高度表达，催化主要的神经传导介质乙酰胆碱的水解反应，产生乙酸和胆碱，终止突触传导。其功能在于调节乙酰胆碱作用。神经毒气，例如有机磷沙林（Sarin），抑制乙酰胆碱酯酶活性，导致神经肌肉瘫痪，最终发生窒息（asphyxiation）。血清乙酰胆碱酯酶浓度显著降低与有机磷杀虫剂中毒有关，因此血液检测是环境污染的重要指标。基于人工合成底物碘化硫代乙酰胆碱（acetylthiocholine iodide）在乙酰胆碱酯酶的作用下，水解产生乙酸和硫代胆碱（thiocholine），与Ellman试剂5,5-二硫基-双（2-硝基苯甲酸）[5,5’-dithiobis-（2-nitrobenzoic acid）；DTNB]反应后，产生黄色的5-巯基-2-硝基苯甲酸（5-thio-2-nitrobenzoic acid；TNB），通过其吸收峰值的变化（412nm波长），来定量分析乙酰胆碱酯酶的活性。乙酰胆碱酯酶反应系统为： Acetylcholinesterase acetylthiocholine iodide → acetate + thiocholine DTNB + thiocholine → TNB + choline-S-S-TNB 产品内容 清理液（Reagent A） 120毫升 裂解液（Re
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