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交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理方法结合液-质分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
交联聚乙烯基吡咯烷酮快速前处理方法结合液相色谱-串联质谱分析红葡萄酒中酪蛋白过敏原 张伟1 贺艳2 刘伟2 吴智渊1 江峥1 许泓2 王勇为1 张裕君2 郑文杰*2 1(赛默飞世尔科技(中国)有限公司,上海201206) 2(天津出入境检验检疫局动植物与食品检测中心,天津300461) 摘要 建立了红葡萄酒酪蛋白过敏原的质谱分析方法。选择专一性SRM 离子对,建立3 种亚型酪蛋白α-S1, α-S2, β的质谱定性与定量方法;利用交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)处理红葡萄酒有效提取蛋白,并直接快速酶解,使前处理缩短到2 h以内。结果表明,酪蛋白的回收率提高到80%以上,检出限达10 μg/ L。 关键词 红葡萄酒; 酪蛋白; 过敏原; 前处理; 液相色谱-串联质谱 1引言 引起过敏的物质称为过敏原,一般为蛋白质类物质。随着食物过敏患者的增多,以及可能导致过敏性休克甚至死亡等严重后果,已建立了一系列针对过敏原的法规及检测方法,包括核酸法(PCR)和酶联免疫法(ELISA)等。新兴的质谱法(MS)灵敏度高、假阳性概率低,并具有方法开发快速、运行成本低等优势。 葡萄酒酿造过程中需要加入澄清剂去除沉淀物质,使酒液获得长期稳定性。酪蛋白是常用的澄清剂之一。酪蛋白是一种来源于牛乳的过敏原,残留在葡萄酒中会对过敏人群产生危害。但是葡萄酒,特别是红葡萄酒含有大量单宁等鞣质,单宁与蛋白质之间存在多点疏水键和氢键的作用,有很强的蛋白结合能力。单宁常用作酶抑制剂使酶失活。单宁极大地抑制了葡萄酒蛋白的提取与酶解,传统蛋白提取方法(超滤、透析、有机溶剂沉淀等)用于葡萄酒时回收率只有20% ~30%[1,2] 。因此,关于葡萄酒过敏原质谱分析的报道很少,研究对象也集中在单宁含量很低的白葡萄酒,对于含有大量单宁的红葡萄酒的前处理和质谱分析仍无成熟的策略[3,4] 。已报道的方法如十二烷基硫酸钾(KDS)法、聚乙烯基吡咯烷酮(PVP)法等,提取后蛋白仍需要电泳去除单宁和两性电解质,工作量大,分析通量低,蛋白质的回收率很低[5,6] 。 交联聚乙烯基吡咯烷酮(PVPP)是PVP
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高通量SNP分子分型技术(KASP技术)经验分享
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
KASP技术经验分享 KASP技术经验分享 KASP技术经验分享 重要的事情说三遍，终于可以开始实验了,但在实验前或实验中乃在实验后,根据小编多年的经验,您可能会遇到以下问题,不用担心,待小编为您一一解答. 1.引物设计提交序列时的注意事项有哪些？ 我们要求所提交的序列长度至少为目标位点上下游各50bp。请注意序列来源，尽量保证序列准确，多态性位点BLAST结果证明为单拷贝也就是要特异。标注出不确定的序列及引物设计时需要跳过的碱基和序列，目标位点周围其他多态性位点（最多可以有2个）用IUPAC码标注。 2. PCR反应体系是怎样的？ 96孔板，10μL 体系，其中5μL DNA， 5μL mix, 0.14 μL引物。 384孔板，5μL体系，其中2.5μL DNA ， 2.5 μL mix, 0.07μL引物。 384 Array Tape, 1.6μL 体系，其中0.8 μL DNA, 0.8μL mix, 0.022μL 引物。 1536孔板，1ul 体系，其中1.5 μL DNA （烘干），1 μL mix, 0.014μL引物。 3. KASP技术对DNA有什么要求？ 建议最小的DNA浓度为2.5 ng / μL。根据基因组大小，所需的DNA的量为：待测样品基因组/3000Mb*5ng。建议设置DNA浓度梯度实验，来确定最合适的DNA浓度。 KASP 对DNA纯度的要求不高， 一般粗提的DNA即可满足，但请尽量保证DNA浓度的一致性, 提取及溶解过程中尽量不要用到EDTA， 因为 EDTA会阻止KASP酶的作用。如有EDTA，建议将DNA稀释一下，做一下浓度梯度实验或加MgCl2优化。 4. 多个引物可以同时跑在同一块板子上吗？ 可以，但KASP技术要求每个引物至少跑22个样品加两个NTC，否则可能影响分群判读，造成较大的误差。 5. NTC信号值很高，怎么办？ NTC跑很高可能有三个原因，一是NTC被DNA样品污染，二是循环数太多，引物 自身扩增。建议多加几个NTC，注意污染问题，再看看。三是，引物设计问题，扩增产物中有引物二聚体存在， 建议重新设计引物。 6. 为什么需要recycling(加循环）, 什么时候需要加循环？ 我们以36个循环作为标准的反应程序,由于不同的引物扩增速度及
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Comprehensive identification of novel proteins and N-glycosylation sites
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
Comprehensive identification of novel proteins and N-glycosylation sites in royal jelly Lan Zhang1,2†, Bin Han1†, Rongli Li1, Xiaoshan Lu1,3, Aiying Nie4, Lihai Guo5, Yu Fang1, Mao Feng1 and Jianke Li1* Abstract Background: Royal jelly (RJ) is a proteinaceous secretion produced from the hypopharyngeal and mandibular glands of nurse bees. It plays vital roles in honeybee biology and in the improvement of human health. However,some proteins remain unknown in RJ, and mapping N-glycosylation modification sites on RJ proteins demands further investigation. We used two different liquid chromatography-tandem mass spectrometry techniques, complementary N-glycopeptide enrichment strategies, and bioinformatic approaches to gain a better understanding of novel and glycosylated proteins in RJ. Results: A total of 25 N-glycosylated proteins, carrying 53 N-glycosylation sites, were identified in RJ proteins, of which 42 N-linked glycosylation sites were mapped as novel on RJ proteins. Most of the glycosylated proteins were related to metabolic activities and health improvement. The 13 newly identified proteins were also mainly associated with metabolic processes and health improvement activities. Conclusion: Our in-depth, large-scale mapping of novel glycosylation sites represents a crucial step toward systematically revealing the functionality of N-glycosylated RJ proteins, and is potentially useful for producing a protein with desirable pharmacokinetic and biological activity using a genetic engineering approach. The newly-identified proteins significantly extend the proteome cover
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三箱社交实验及自发活动实验-雷帕霉素对自闭症大鼠病症行为的改善作用
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
雷帕霉素对自闭症大鼠病症行为的改善作用 摘要： 目的探讨雷帕霉素(rapamycin)对自闭症大鼠病症行为的改善作用及相关机制。 方法采用丙戊酸钠( sodium valproate VPA)一次性腹腔注射孕12.5 d大鼠制备自闭症幼大鼠模型，雷帕霉素处理组于VPA注射后每天给大鼠口服4 mg/kg雷帕霉素直至断奶。将出生幼鼠分为4组:对照组，VPA处理组，雷帕霉素处理组与VPA联合雷帕霉素处理组。在幼鼠出生后35 d进行社会交往行为检测、神经行为学检测，并分离提取脑组织蛋白通过Western blot分析mTOR磷酸化水平及自噬标志蛋白LC3表达情况;电镜分析前额叶组织中自噬小体形成情况。结果成功制备自闭症大鼠模型。与对照相比，VPA处理组社会交往能力下降、在中央区活动时间增加、站立次数减少(P
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Interleukin-6 Induced Acute Phenotypic Microenvironment Promotes Th1 Anti-Tumor Immunity
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
Interleukin-6 Induced “Acute” Phenotypic Microenvironment Promotes Th1 Anti-Tumor Immunity in Cryo-Thermal Therapy Revealed By Shotgun and Parallel Reaction Monitoring Proteomics Ting Xue1, Ping Liu1, Yong Zhou2, Kun Liu1, Li Yang2, Robert L. Moritz2, Wei Yan1, Lisa X. Xu1 1. Key Laboratory of Systems Biomedicine (MOE), Shanghai Center for Systems Biomedicine, the School of Biomedical Engineering and MED-X Research Institute, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai, China. 2. Institute for Systems Biology, Seattle, WA, USA. Corresponding author: WY: weiyan@sjtu.edu.cn, Tel: +86-21-34201452; LXX: lisaxu@sjtu.edu.cn, Tel: +86-21-62932302; RLM: robert.moritz@systemsbiology.org, Tel: (206) 732-1244. © Ivyspring International Publisher. Reproduction is permitted for personal, noncommercial use, provided that the article is in whole, unmodified, and properly cited. See http://ivyspring.com/terms for terms and conditions. Received: 2015.11.11; Accepted: 2016.02.08; Published: 2016.03.21 Abstract Cryo-thermal therapy has been emerged as a promising novel therapeutic strategy for advanced breast cancer, triggering higher incidence of tumor regression and enhanced remission of metastasis than routine treatments. To better understand its anti-tumor mechanism, we utilized a spontaneous metastatic mouse model and quantitative proteomics to compare N-glycoproteome changes in 94 serum samples with and without treatment. We quantified 231 highly confident N-glycosylated proteins using iTRAQ shotgun proteomics. Among them, 53 showed significantly discriminated regulatory patterns ov
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一小时蛋白质组: 基于Q-OT-qIT质谱系统的蛋白质组学快速鉴定
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
张伟†, 顾培明†, 江峥*, 明红, 陈伟 赛默飞世尔科技(中国)有限公司, 上海 201206 † 同等贡献 * 联系人, E-mail: zheng。jiang@thermofisher。com 摘要 随着“一小时酵母蛋白质组”的实现, 短梯度下实现蛋白质组深度覆盖成为可能。本文利用全新Q-OT-qIT三合一质谱系统进行“一小时蛋白质组”分析与优化。50 min有效梯度, 单次实验分别从1 μg和50 ng HeLa全蛋白中鉴定到20860和14100条肽段, 对应到3865和2877个非冗余蛋白, 而目前的文献报道至少需要2~3 h。同时, 本文考察了Q-OT-qIT碎裂模式、检测方法、最大注入时间和自动增益控制等参数对蛋白质组快速分析的影响, 证明了不同采集方法间的互补性, 阐述了不同扫描参数对鉴定结果的影响。此外, 还讨论了Q-OT-qIT的并列运行原理和扫描组合模式, 为不同实验目的和样本类型的蛋白质组快速分析奠定了基础。 关键词 蛋白质组学 快速鉴定 深度覆盖 静电场轨道阱 Q-OT-qIT质谱 蛋白质组深度覆盖分析(in-depth proteome)已成为蛋白质组学研究的发展趋势, 通过大规模鉴定和挖掘极低丰度的蛋白, 为信号通路、分子靶点和生物标志物的研究提供重要信息。然而, 由于全蛋白样本的复杂性, 蛋白质组深度鉴定对色谱分离要求很高, 通常需要进行二维分离(强阴离子交换、高pH反相等), 或使用一维长梯度分离, 以降低高丰度蛋白的干扰[1,2]。但这样消耗了大量时间, 重现性也不佳, 成为蛋白质组深度覆盖研究的瓶颈。 静电场轨道阱(orbitrap)质量分析器具有超高分辨率、超高灵敏度等特点, 有效推动了蛋白质组学的发展[3,4]。新型Q-OT-qIT(Orbitrap Fusion)质谱系统首 次将四极杆(quadrupole, Q)、静电场轨道阱(orbitrap, OT)和线性离子阱(linear quadrupole ion trap, qIT)3种质量分析器集为一体, 利用动态扫描管理技术, 实现了3种质量分析器同时工作并相互协作, 一级、二级扫描同时进行, 使分析效率达到最大化[5]。Hebert等人[6]利用Q-OT-qIT质谱, 5次重复实验, 在70min有效梯度下鉴定到约4
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香港《食物内除害剂残余规例》的整体解决方案以及方法包介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
香港《食物内除害剂残余规例》的整体解决方案以及方法包介绍 赛默飞世尔科技三重四极杆串接气质 一．方法包简介 方法包是赛默飞世尔科技色谱质谱部应用部门针对客户需求提出的简易仪器使用流程，方法包内所涉及的化合物均为常见的能在 GC/MS 上检测的化合物，如农药残留、多环芳烃、多氯联苯、多溴联苯和多溴联苯醚、邻苯二甲酸酯等。 方法包的作用就是能使客户更快更简便得使用仪器，尽快上手。方法包包括进样方法，数据处理方法（TraceFinder 方法文件夹），相关应用文章，相关标准，色谱柱信息，前处理方法，数据文件等，客户可以直接调用进样方法和数据处理方法完成化合物的定性定量分析。 由于 Thermo ScientificTM TSQ 8000 Evo 采用 T-SRM 进样方法而不是分时间段的扫描方法，原来的进样的方法可以直接调用，即使保留时间会有微小的偏差，也不会影响最终的结果。另外，TraceFinder 软件自带的数据库可以直编辑数据处理方法，数据库里包括化合物的名称、离子对、碰撞能量、定量离子、定性离子、CAS 号等信息。同时，TraceFinder 软件可以根据数据处理方法自动关联生成TSQ 8000 Evo 的方法文件。这样应用 TraceFinder 就可以直接生成数据处理方法和部分进样方法。整个过程都是自动化的，几乎不需要操作者手动输入任何操作信息。 方法包（Method Kit） 对于常用分析化合物，我们可以提供方法包。 包括：邻苯二甲酸酯、PCB、PAH、PBDE、农残筛查、GB2763、烟草中农残、PM2.5、香港规管方案、亚硝胺、二恶英等。 目的：上手方便，直接使用。 二．仪器简介 TSQ 8000 Evo 三重四极杆串接气质联用仪 秉承着在气相色谱三重四极杆质谱中技术的一贯领先优势，Thermo Fisher Scientific 在推出 TSQ 8000 之后再次创新，推出了更新的一款气相串接质谱仪 TSQ 8000 Evo，该款高效的 GC/MS/MS 提供了永不停机的生产率，其出色的灵敏度，超快的扫描速度，简便的 MSMS 功能，满足最苛刻的定量定性分析要求，为食品
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如何选择合适的CBP标签抗体？
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
CBP标记的蛋白在低浓度钙缓冲液中能够异性的被钙调蛋白树脂捕捉吸附，并且在中性环境中能够被2 mM EGTA洗脱，这与6组氨酸亲合标签纯化体系相比反应条件要温和许多。仅有4-kDa 大小的CBP tag 与26-kDa GST 标签相比对蛋白分子的影响非常小。在所表达的蛋白分子上包含一个凝血酶或肠激酶列解位点，依靠它可以非常方便的移除CBP标签。（CBP Tag : KRRWKKNFIAVSAANRFKKISSSGAL） 如何选择合适的CBP标签抗体？ 我们在选择CBP标签抗体时，主要根据自己的需要，特别是实验应用上的需要。另外，一个抗体检测后的应用类型越多，在使用过程中的选择余地就越大；而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl CBP抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:5000，最终使用液相当于500ml），要比效价低的1ml的CBP抗体（假如WB检测的稀释比率是 1:200，最终使用液相当于200ml）性价比更高。 产品名称及描述 货号 产品说明 Anti-CBP Tag Monoclonal Antibody(12H5) A02190 详情 为什么推荐Abbkine品牌的CBP标签抗体 （克隆号12H5）？ 目前市面上能提供的CBP标签抗体有国产分装或原产的，国产分装的CBP标签抗体在质量稳定性上有不足，并且经过分装以后，其效价也有损失。而原产于国内实验室的CBP标签抗体有些具有较好的检测活性，在批次之间的稳定性上较难控制，而国内仅有的少量原产抗体也是多克隆抗体。至于原装进口供应CBP标签抗体的进口品牌并不多，仅Abcam、Sigma等等几个品牌能够提供CBP标签抗体，但是其在性价比上远逊于Abbkine产品。 《CBP标签抗体综合对比》 品牌 货号 应用类型 价格/规格 Abbkine A02110 WB：(1:5000-1:10000) 605/50ul 1800/200ul 6020/1ml Abcam ab119488 WB：(1:250-1：2000) 4076/100ul 由此，我们向您推荐Abbkine的Anti-CBP Tag Monoclonal Antibody(12H5)与Abc
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为什么选择组蛋白H3为细胞核的内参指标？
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
为什么选择组蛋白H3为细胞核的内参指标呢？ 当实验样品中只是核蛋白，而不是细胞总蛋白提取液时，可以用组蛋白H（Histone H），或者增殖细胞核抗原（PCNA）等为核内参抗体。除了这些，其它常见的核蛋白内参还有K70， K80， Lamin A和B。但是需要注意的问题是核蛋白内参的选择需要考虑实际的试验环境，比如在涉及细胞增殖相关试验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参；而在凋亡实验时，TBP、Lamin等也不适合作为内参。反之，组蛋白Histone H3等由于是染色体的组成型表达组分，表达比较稳定，经常被作为最广泛的核内参使用。 产品名称及描述 货号 产品说明 Anti-Histone H3 Mouse Monoclonal Antibody （2D10） A01070 详情 为什么推荐Abbkine品牌的组蛋白H3内参抗体（克隆号2D10）？ 目前市面上能提供的Histone H3抗体有国产分装或原产的，国产分装的Histone H3抗体在质量稳定性上有不足，并且经过分装以后，其效价也有损失。而原产于国内实验室的Histone H3抗体有些具有较好的检测活性，在批次之间的稳定性上较难控制，而国内仅有的少量原产抗体也是多克隆抗体。至于原装进口供应Histone H3抗体的进口品牌并不多，仅Abcam、Sigma等等几个品牌能够提供Histone H3抗体，但是其在性价比上远逊于Abbkine产品。 《Histone H3内参抗体综合对比》 品牌 货号 反应种属 应用类型 规格/价格 Abbkine A01070（单抗） 人，小鼠，大鼠，酵母 WB：(1:2000-1:5000) IF：（1:100-1:500） IP：（1:200） 605/50ul 1800/200ul 6020/1ml Abcam ab18521 （多抗） 牛，人，酵母，非洲爪蟾 WB：(1:1000) IHC：（1:1000） IP：（1:200） 4450/100ul Sigma H9289-200UL （多抗） 人 WB：(1:2000-1:5000) 3945/200ul 由此，我们向您推荐Abbkine的Anti-Histone H3 Mouse Monoclonal Antibody （2D10），与Abcam一样，Abbkine的Histone H3抗体的免疫原是重组的Histone H3全长蛋白，经过不断筛
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如何选择合适的高灵敏度RFP（DsRed）标签抗体？
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
红色荧光蛋白（RFP）是从太平洋与海葵相关的 (Discosomasp)中分离出来的一种能在紫外线的照射下可发射红色荧光的蛋白。在细胞中荧光转换效率高．是目前发现的具有最长激发波长与发射波长的自然发光荧光蛋白,RFP基因编码的蛋白质由225个氨基酸组成，相对分子质量（Mr）为25.9ku.RFP以被广泛用于动物、植物和酵母等真核细胞内基因表达，其基因在原核细胞中的应用也越来越受关注。 如何选择合适的RFP（DsRed）标签抗体？ 我们在选择RFP（DsRed）抗体时，主要根据自己的需要，特别是实验应用上的需要。另外，一个抗体检测后的应用类型越多，在使用过程中的选择余地就越大；而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl RFP抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:5000，最终使用液相当于500ml），要比效价低的1ml的RFP抗体（假如WB检测的稀释比率是 1:200，最终使用液相当于200ml）性价比更高。 产品名称及描述 货号 产品说明 Anti-RFP Tag Mouse Monoclonal Antibody (9D1) A02120 详情 为什么推荐Abbkine品牌的红色荧光蛋白RFP (DsRed) 标签抗体 （克隆号9D1）？ 目前市面上能提供的RFP标签抗体有国产分装或原产的，国产分装的RFP标签抗体在质量稳定性上有不足，并且经过分装以后，其效价也有损失。而原产于国内实验室的RFP标签抗体有些具有较好的检测活性，在批次之间的稳定性上较难控制，而国内仅有的少量原产抗体也是多克隆抗体。至于原装进口供应RFP标签抗体的进口品牌并不多，仅Abcam、Sigma等等几个品牌能够提供RFP标签抗体，但是其在性价比上远逊于Abbkine产品。 《RFP（DsRed）标签抗体综合对比》 品牌 货号 应用类型 价格/规格 Abbkine A02120 WB：(1:5000) 605/50ul 1800/200ul 6020/1ml Abcam ab65856 WB：(1:1000) IF : （自行摸索） 4340/100ul 由此，我们向
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如何选择合适的KT3标签抗体？
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
标签抗体的效价如何考察？ KT3表位标签经常被重组到目标蛋白的的N末端或C末端，以实用免疫组织化学或荧光化学技术来实现可视化观察和定位。KT3标签的氨基酸序列为KPPTPPPEPET。Abbkine特异性的KT3单克隆抗体能识别来源于来自猿猴病毒40大T抗原（ SV40）序列的KT3融合蛋白。 如何选择合适的KT3标签抗体？ 我们在选择KT3抗体时，主要根据自己的需要，特别是实验应用上的需要。另外，一个抗体检测后的应用类型越多，在使用过程中的选择余地就越大；而小鼠源的单克隆抗体一般在特异性、稳定性以及效价都要优于多克隆抗体。 另外，抗体的效价也是考察该抗体性价比的重要方面，也即相当于实际应用时的稀释比率。一个效价高的100μl KT3抗体（假如其WB检测的稀释比率是1:5000，最终使用液相当于500ml），要比效价低的1ml的KT3抗体（假如WB检测的稀释比率是 1:200，最终使用液相当于200ml）性价比更高。 产品名称及描述 货号 产品说明 Anti-KT3 Tag Mouse Monoclonal Antibody (14D8) A02110 详情 为什么推荐Abbkine品牌的KT3标签抗体 （克隆号14D8）？ 目前市面上能提供的KT3标签抗体有国产分装或原产的，国产分装的KT3标签抗体在质量稳定性上有不足，并且经过分装以后，其效价也有损失。而原产于国内实验室的KT3标签抗体有些具有较好的检测活性，在批次之间的稳定性上较难控制，而国内仅有的少量原产抗体也是多克隆抗体。至于原装进口供应KT3标签抗体的进口品牌并不多，仅Abcam、Sigma等等几个品牌能够提供KT3标签抗体，但是其在性价比上远逊于Abbkine产品。 《KT3标签抗体综合对比》 品牌 货号 应用类型 价格/规格 Abbkine A02110 WB：(1:5000) 605/50ul 1800/200ul 6020/1ml Abcam ab3859 WB：(1:1000-1：10000) 3996/100ul 由此，我们向您推荐Abbkine的Anti-KT3 Tag Mouse Monoclonal Antibody (14D8)与Abcam一样，Abbkine的KT3抗体的免疫原是合成的KT3多肽，经过不断筛选和优化，终于得到**的细胞株（1
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使用Q Exactive Focus液质联用快速灵敏测定肉、血浆和牛奶中的多类兽药残留
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
使用Q Exactive Focus液相色谱质谱联用系统快速灵敏测定肉、血浆和牛奶中的多类兽药残留 Olaf Scheibner, Maciej Bromirski, Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany 关键词 Q Exactive Focus，Orbitrap，兽药，HRAM定量，HRAM筛查，vDIA，未知物筛查，回顾性数据分析 目的 本实验利用可变数据非依赖采集（vDIA），建立了一种兽药分析的新方法。该法具备高灵敏度和高选择性，能够获得被测样品全面而高质量的数据，并可将定量分析与非目标物和未知物筛查相结合。 引言 考虑到样品预处理和质谱分析的复杂性，动物源食品中的兽药残留分析通常是一个费时的过程。利用传统方法对动物源食品（包括肉、奶和血浆）中多类兽药残留进行定量分析，常常需要多次进样以获得各类成分的最佳分析条件，包括针对不同种类化合物而开发的不同色谱和质谱方法。并且所获数据仅仅包含目标化合物的信息，而不适用于其它化合物的回顾性分析。 本实验使用超快速液相色谱和Thermo ScientificTM Q Exactive FocusTM台式 OrbitrapTM质谱联用系统建立了一种新方法，其包含快速色谱方法和可变数据非依赖采集（vDIA）质谱方法。该法具有总分析时间短、选择性高和灵敏度高等优点，并且其采集的数据能够用于其它目标物和非目标物筛查。本实验利用vDIA方法制作标准曲线，并对样品中已知和未知目标化合物进行分析。vDIA允许设置多个MS/MS隔离窗口，窗口宽度可从50Da到800Da。通常较小的窗口宽度用于低质量区域以扩展动态范围和提高灵敏度，较大的窗口宽度用于更高质量区域以改善工作周期。该法的典型方法设置如本文所示，用5组MS/MS隔离窗口覆盖全扫描的整个质量数范围，同时保持MS/MS分析速度与快速色谱分离相匹配。 图1 Q Exactive Focus台式Orbitrap质谱仪 如表1所示，分析成分为44个不同种类的兽药残留，分析样品包括肌肉、肾脏、牛奶和血浆提取物，所有样品均采用相同的标准化色谱和质谱方法进行分析。为了进行绝对定量分析，44
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mRNA测序应用于玉米籽粒dek突变体研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
2017年1月1日遗传学期刊Genetics（影响因子4.6）在线发表了上海大学生命科学学院祁巍巍老师的有关玉米突变体基因克隆与功能分析新文章，题为：Mitochondrial function and maize kernel development requires Dek2, a pentatricopeptide repeat protein involved in nad1 mRNA splicing。 在开花类的植物中，很多和呼吸相关的蛋白都是受到了线粒体基因组编码基因以及细胞核编码基因协同调控。三角状五肽重复区(Pentatricopeptide repeat，PPR) 蛋白已经有报道其参与了RNA与蛋白质之间的相互作用。玉米籽粒突变体defective kernel 2 (dek2) 是一个典型的小籽粒以及发育迟缓的突变体。图位克隆以及等位测试确认dek2编码了一个新的线粒体中的P-type PPR蛋白。线粒体转录本分析表明dek2突变体引起了线粒体内nad1内含子1的剪切效率下降。dek2未成熟籽粒线粒体复合物分析表明复合物1显著缺失。转录组测序与透射电镜观察发现，由于AOXs蛋白的高表达，nad1适当的剪切对线粒体功能以及线粒体的内嵴至关重要。在该研究中，研究人员发现dek2是一个新的PPR蛋白，其影响线粒体nad1内含子1的剪切并且对于线粒体功能以及籽粒发育至关重要。 研究思路 研究结果 dek2影响籽粒正常发育 研究人员从玉米种质中心获取dek2的突变体并且对其与W22杂交，使其背景纯化，以利于表型观察。在对其表观以及细胞层面上的观察发现，dek2的突变体籽粒和野生型相比，显著变小，百粒重只有野生型32%，总蛋白含量下降4%，醇溶蛋白下降21%，非醇溶蛋白含量上升38%，淀粉粒体积显著减小，并且籽粒胚乳糊粉层发育受到显著抑制（图1，2）。 dek2的图位克隆 为了对dek2进行基因定位，研究人员使用了图位克隆的方法。经过对438粒突变体籽粒的初定位以及3358粒籽粒的精细定位发现，GRMZM2G110851的单碱基SNP导致了该表型的产生（图3）。 dek2编码了一个P-type PPR蛋白 GRMZM2G110851在基因组上含有1893个碱基长度并且编码了一个630个氨基酸的蛋白
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台式高分辨率质谱系统快速鉴定药物杂质
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
前言 杂质分析对于药物的研发至关重要1。在研究过程中，杂质谱信息能帮助药物化学家优化合成路线和避免潜在的有毒杂质。在开发过程中，当大量母体化合物存在时，鉴定和表征痕量杂质至关重要，从而促进了高分辨率、高灵敏度和高扫描速度的HR-MS 仪器和智能化结构鉴定软件的发展。 为了展示HR-MS 在杂质分析和结构鉴定方面的能力，本文选用了市售药物奥美拉唑。本研究采用了赛默飞世尔科技的Q Exactive 台式Orbitrap 质谱仪和数据处理软件Mass Frontier 来快速分析和鉴定奥美拉唑中杂质的结构。 方法 材料与试剂 奥美拉唑（CAS# 73590-58-6）购自Sigma-Aldrich，产品号O104-100MG。 乙腈和水来自Fisher Scientific 乙酸铵购自Sigma-Aldrich，产品号73594-25G-F。 甲酸购自Sigma-Aldrich，产品号33015-500ml。 样品前处理 奥美拉唑溶液（0.5 mg/mL）配制在1:1 乙腈/ 水混合溶剂中。 HPLC 方法 色谱分离采用Ultimate3000 UHPLC 系统。 色谱柱：Hypersil GOLD 柱，2.1mm×150mm，粒径3 μm. 柱温：35 ℃，流速：0.5 mL/min，进样体积：8 μL 流动相：A - 水；B - 乙腈；C -100 mM 乙酸铵，用乙酸调节pH 值到5 梯度洗脱： 质谱方法 质谱分析采用 Q Exactive 质谱仪的电喷雾正离子模式。在70,000 和 35,000 分辨率FWHM@m/z 200 下分别采集高分辨全扫描一级质谱数据和数据依赖Top3 二级质谱数据。 离子源条件： 离子化模式：正离子ESI 离子源：HESI-II 鞘气流速：45 单位N2 辅助气流速：10 单位N2 喷雾电压（KV）：+3.5 毛细管柱温度（℃）：320 S-lens RF 水平：50.0 加热器温度（℃）：400 Q Exactive 方法参数： AGC 目标（全扫描）：3e6 AGC 目标（MS/MS）：1e5 NCE：30，35% 阶梯变化 扫描范围（全扫描MS）：180 到1200 amu 结果与讨论 I.高分辨率全扫描-HCD MS/MS 鉴定杂质 采集得到奥美拉唑的高分辨率全扫描和三个最高强度的数据依赖HCD MS/MS 数据。HRAM 全扫描和MS/MS 数据提供了分子量和碎片信息。HCD
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新一代组合型质谱LTQ-Orbitrap Elite用于复杂糖蛋白完整糖肽结构解析
作者：德尔塔 日期：2022-04-21
张伟 赛默飞世尔科技 谭青乔 中信国健药业 1.前言 糖基化修饰是生命活动中最广泛、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。糖蛋白根据其糖链结构及糖基化位点主要有N-糖蛋白与O-糖蛋白两大类。据推断，有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰，但由于糖基化的高度复杂性，绝大多数糖蛋白尚未被发现，现有数据库中只有约10%的蛋白质被注释为糖蛋白[1]。首先，糖链的组成与结构非常复杂，糖链为非模板合成且呈二维结构，糖苷键连接位置和构象的不同都会形成差异的精细结构。据报道，仅仅由6 个不同单糖组成的寡糖链，其结构就可能达到惊人的1012种[2]。其次，当组成与结构各异的糖链连接在蛋白质上形成糖蛋白时，又构成微观不均一性，即糖基化位点上糖链结构多样化的问题，一个蛋白可能存在多个糖基化位点，而每个位点上又可能存在多种结构的糖链[3]。 随着以单抗为代表的糖蛋白药物的开发，质谱已广泛应用于糖基化解析，通常先利用酶切或化学手段将糖链从糖蛋白释放，再分别进行糖基化位点的鉴定和糖链结构的解析[4]。然而针对完整糖肽的解析，目前尚无成熟技术。本文利用新一代组合型质谱LTQ-Orbitrap Elite具有的HCD/ETD“双碎裂模式”，解析一种复杂糖蛋白的完整糖肽，利用最新Byonic与SimGlycan软件解析，成功发现2个N-糖基化位点，16个O-糖基化位点，83种位点特异性糖链组成与结构信息，在未脱糖状态下使蛋白序列覆盖度高达92.1%。 2.实验部分 2.1样品信息 样品为某种重组表达的高度糖基化蛋白，前处理使用二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酸（IAA）对二硫键还原烷基化，胰蛋白酶（Trypsin）酶解蛋白，最终浓度为1.5 μg/μL。 2.2液相色谱方法 色谱柱：纳流速C18 (2 μm, 100 A, 75 μm x 50 cm)，常规流速HILIC-NH2 (3 μm, 100 A, 2.0 mm x 15 cm) 色谱仪：C18柱使用纳流速液相Easy-nLC 1000，HILIC
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