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张伟 赛默飞世尔科技 谭青乔 中信国健药业   1.前言 糖基化修饰是生命活动中最广泛、最重要的蛋白质翻译后修饰之一，不仅影响着蛋白质的空间构象、生物活性、运输和定位，而且在分子识别、细胞通信、信号转导等特定生物过程中发挥着至关重要的作用。糖蛋白根据其糖链结构及糖基化位点主要有N-糖蛋白与O-糖蛋白两大类。据推断，有超过50%的蛋白质都发生了糖基化修饰，但由于糖基化的高度复杂性，绝大多数糖蛋白尚未被发现，现有数据库中只有约10%的蛋白质被注释为糖蛋白[1]。首先，糖链的组成与结构非常复杂，糖链为非模板合成且呈二维结构，糖苷键连接位置和构象的不同都会形成差异的精细结构。据报道，仅仅由6 个不同单糖组成的寡糖链，其结构就可能达到惊人的1012种[2]。其次，当组成与结构各异的糖链连接在蛋白质上形成糖蛋白时，又构成微观不均一性，即糖基化位点上糖链结构多样化的问题，一个蛋白可能存在多个糖基化位点，而每个位点上又可能存在多种结构的糖链[3]。   随着以单抗为代表的糖蛋白药物的开发，质谱已广泛应用于糖基化解析，通常先利用酶切或化学手段将糖链从糖蛋白释放，再分别进行糖基化位点的鉴定和糖链结构的解析[4]。然而针对完整糖肽的解析，目前尚无成熟技术。本文利用新一代组合型质谱LTQ-Orbitrap Elite具有的HCD/ETD“双碎裂模式”，解析一种复杂糖蛋白的完整糖肽，利用最新Byonic与SimGlycan软件解析，成功发现2个N-糖基化位点，16个O-糖基化位点，83种位点特异性糖链组成与结构信息，在未脱糖状态下使蛋白序列覆盖度高达92.1%。   2.实验部分   2.1样品信息 样品为某种重组表达的高度糖基化蛋白，前处理使用二硫苏糖醇（DTT）、碘乙酸（IAA）对二硫键还原烷基化，胰蛋白酶（Trypsin）酶解蛋白，最终浓度为1.5 μg/μL。   2.2液相色谱方法 色谱柱：纳流速C18 (2 μm, 100 A, 75 μm x 50 cm)，常规流速HILIC-NH2 (3 μm, 100 A, 2.0 mm x 15 cm) 色谱仪：C18柱使用纳流速液相Easy-nLC 1000，HILIC-NH2柱使用常规流速液相Accela 600上样量：2 μL 流动相：A: 0.1%甲酸水溶液，B: 0.1%甲酸乙腈溶液 梯度：C18: 3%-90% B, 120 min, 250 nL/min; HILIC-NH2: 95%-5% B,120 min, 200 μL/min   2.3质谱方法 质谱仪：LTQ-Orbitrap Elite组合型高分辨质谱仪 离子源： Easy-nLC 1000使用EASY-Spray纳流电喷雾离子源：喷雾电压2.3 kV，传输毛细管温度：275°C，S-Lens：60%； Accela 600使用HESI-II加热电喷雾离子源：喷雾电压3.5 kV， 鞘气：30，辅助气：10，传输毛细管温度：275°C，SLens：60% 扫描方式：数据依赖性扫描：一级全扫描（分辨率60,000），Top15二级全扫描（分辨率15,000）；扫描范围：母离子m/z 400-3500，子离子m/z 100-3500；动态排除：时间30s，排除范围m/z -0.5~+1.5 碎裂模式：高能碰撞诱导解离HCD（NCE 35%），电子转移解离ETD（100 ms for 2+）   2.4数据分析 数据使用Byonic软件搜库鉴定糖肽/非糖肽，具体参数为：酶：trypsin (KR)；专一性：全酶切；漏切位点：2；母离子质量精度：15 ppm；子离子质量精度：20 mD；固定修饰：C+58.005；可变修饰：M+15.995；糖基化修饰：N, O；肽段卡值标准：Score>150，Delta Mod>5，Log Probability<-1；糖基化位点卡值标准：Score>190，Delta Mod>10，Log Probability<-2。SEQUEST搜库参数相同，卡值标准为5%FDR。糖肽糖链部分结构使用SimGlycan软件解析。   3.结果与讨论   3.1分析策略 实验整体策略见图1。本实验采用nano-C18与氨基HILIC两种分离方式分别对样本进行色谱分离。C18是常用的蛋白/肽段分离色谱柱，而纳流速的C18柱使被分析物的单位浓度显著提高，灵敏度达到最佳，能够有效分析低丰度/低离子化效率的肽段。氨基HILIC属亲水色谱，根据寡糖/聚糖组成和结构进行分离，是糖链结构解析、糖组学研究的有效工具。   同时，由于目标蛋白的糖基化高度复杂，本实验同时采用HCD与ETD两种碎裂模式进行质谱采集。HCD倾向于碎裂低电荷/低分子量的肽段，存在糖基化修饰时，优先碎裂单糖之间的糖苷键，同时高能碎裂能够获得更充分的碎片信息。ETD倾向于碎裂高电荷/高分子量的肽段，存在糖基化修饰时，优先碎裂肽段骨架的酰胺键。因此，HCD与ETD具有良好的互补性，两者结合可以有效应用于完整糖肽的解析。     图1. 糖肽解析流程图   糖肽谱图同时含有肽骨架与糖链的碎片信息，因此质谱数据的解析也是分析难点。Byonic是专业的糖肽解析软件，采用创新的“Preview”算法和丰富的糖链组成数据库，实现对肽段、糖基化位点的鉴定，并根据精确质量数给出糖链组成。SimGlycan是专业的糖链结构解析软件，含有9650种糖链的理论碎片信息，是目前最大的商品化糖数据库。本实验先使用Byonic对数据进行序列鉴定，获得糖基化位点与糖链的单糖组成信息，再使用SimGlycan对数据进行糖链结构解析，最终获得糖肽序列、糖基化位点与位点特异的糖链结构。     图2. 样本LC-MS/MS总离子流图（TIC）   3.2序列鉴定 图2展示了样本经nano-C18+HCD流程分析获得的TIC图，色谱峰分布均匀，达到理想分离效果，质谱响应达9次方。所有质谱数据经Byonic进行序列鉴定，蛋白序列覆盖度达92.1%，而使用传统算法SEQUEST进行搜库，序列覆盖度只有76.6%（图3）。     图3. (A) SEQUEST/Byonic序列鉴定覆盖度对比；(B) Byonic对肽段二级谱图匹配   SEQUEST算法无法鉴定完整糖肽，只能根据未发生糖基化的肽段分析序列，一些完全发生糖基化的肽段难以解析。相反，Byonic鉴定时根据其糖链数据库，将糖基化作为可变修饰，因而能够直接解析糖肽。因此，Byonic解析糖蛋白序列覆盖度显著提高。   3.3糖肽解析 在上述Byonic鉴定结果中，共包含28条糖肽，对应18个糖基化位点，其中，N-糖基化位点2个，O-糖基化位点16个；同时，共获得位点特异的糖链组成83种，对应到每个位点最多17种，最少1种，平均每个位点5.2种。HCD与ETD两种碎裂模式显示出优异的互补性，使解析结果明显增多（图4）。     图4. HCD/ETD碎裂获得的糖肽解析结果比较   通过比较TKPREEQYNSTYR这条N-糖肽（N317）的质谱谱图（图5）可以看出，ETD与HCD都成功鉴定到这条糖肽，而ETD所获得的碎片信息（c/z）更加丰富，位点同时被c、z离子覆盖。相反，HCD所获得的碎片信息（b/y）明显减少，位点没有被碎片离子覆盖。但值得注意的是，HCD谱图的高分子量端出现显著的簇峰，峰之间相差162Da（Δm/z 81, 2+）或203 Da（Δm/z 101.5, 2+），表明糖肽的糖链部分发生碎裂。     图5. 糖肽TKPREEQYNSTYR的HCD/ETD碎裂谱图解析   ETD倾向于碎裂较强的肽骨架氨基酸之间的酰胺键，保留修饰基团，因此该糖肽在ETD中完整保留了糖链，获得较为充分的肽骨架碎片（c/z系列），能够更加有效鉴定肽段。HCD倾向于碎裂较弱的翻译后修饰基团，造成该糖肽的糖链在HCD模式下发生显著碎裂，呈现一系列相隔一个单糖的碎片峰，而肽骨架的碎裂被显著抑制，b/y系列离子不充分且信号较弱；同时，带有完整糖链的碎片难以产生，因此无法得到包含位点N的b/y碎片信息。   对于糖链较小的O-糖肽，HCD对糖链的影响没有N-糖肽那么大，而且ETD碎裂的信号响应（103）明显要弱于HCD（104），因此综合而言，两者鉴定到的糖肽和位点数量相当，展现了优异的互补性。   3.4位点特异性糖链结构解析 Byonic不考虑糖链碎片信息，只根据肽段碎片的精确分子量搜库得到糖链的组成信息，本实验进一步使用SimGlycan分析糖链具体结构。SimGlycan根据糖链碎片信息解析糖链结构，因此在解析具体结构的同时，也从另一方面对Byonic的鉴定结果进行了验证，使最终结果更加可信。     图6. 糖肽TKPREEQYNSTYR的HCD碎裂谱图糖链解析   本实验对所有鉴定到N317糖基化位点谱图进行SimGlycan解析，最终75.6%的谱图得到验证，相应93.8%的糖链获得结构信息。如表1所示，N317位点共有15种糖链结构，主要为高甘露糖型与双链复杂型N-糖链，还包含了核心岩藻糖、唾液酸等重要结构。图6进一步展示了图5中HCD谱图的糖链结构解析结果及部分碎片匹配图，充分的糖链碎片离子信息表明Hex2HexNAc8的结构为三分支的高甘露糖型。   3.4位点特异性糖链结构解析 Byonic不考虑糖链碎片信息，只根据肽段碎片的精确分子量搜库得到糖链的组成信息，本实验进一步使用SimGlycan分析糖链具体结构。SimGlycan根据糖链碎片信息解析糖链结构，因此在解析具体结构的同时，也从另一方面对Byonic的鉴定结果进行了验证，使最终结果更加可信。   表1. N317位点的糖链结构     另外，糖链存在诸多同分异构体，特别是组成一致，连接方式不同的精细结构差异，仅靠二级碎片难以区分。当然，LTQ-Orbitrap Elite所具有的多级解析能力（MSn），同样能够针对糖链实现有效的精细结构解析。   4.结论 本文使用新一代组合型质谱LTQ-Orbitrap Elite，利用技术领先的HCD/ETD“双碎裂模式”，结合先进的糖基化解析软件Byonic与Simglycan，成功解析了一种高度糖基化蛋白的完整糖肽。实验共获得2个N-糖基化位点，16个O-糖基化位点，83种位点特异性糖链组成与结构，在未脱糖状态下蛋白序列覆盖度高达92.1%，最大化地实现了复杂糖蛋白的高效解析。技术领先的LTQ-Orbitrap Elite是糖组学、蛋白质组学、生物制药领域复杂大分子解析的强大工具。   参考文献： [1] Apweiler, R.; Hermjakob, H.; Sharon, N. On the frequency of protein glycosylation, as deduced from analysis of the SWISS-PROT database [J]. Biochim. Biophys. Acta 1999, 1473 (1): 4-8. [2] Morelle, W.; Canis, K.; Chirat, F.; Faid, V.; Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation [J]. Proteomics 2006, 6 (14): 3993-4015. [3] 代景泉，蔡耘，钱小红；蛋白质糖基化分析方法及其在蛋白质组学中的应用[J]. 生物技术通讯 2005, 16 (3): 287-292. [4] Geyer, H.; Geyer, R. Strategies for analysis of glycoprotein glycosylation [J]. Biochim. Biophys. Acta 2006, 1764 (12): 1853-1869.