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原代悬浮细胞吉姆萨染色法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
原代悬浮细胞吉姆萨染色法 涂片法： 1. 用含有5%—10%血清的等渗液将培养的细胞调制成密度为106个/ml的细胞悬液； 2. 将1滴细胞悬液滴于一张载玻片的一端，用另一块干净的载玻片，按照血液涂片法将细胞铺展于载玻片上； 3. 载玻片在空气中干燥后，再用甲醇固定； 4. 对涂有细胞的载玻片进行染色； 5. 注意，为避免细胞皱缩应尽快使涂有细胞的载玻片干燥，可摇动载玻片或用吹风机的冷风迅速吹干； 6. 用甲醇固定，吉姆萨染色； 离心法： 1. 需使用离心涂片机将细胞悬液的细胞直接离心沉淀在载玻片上，使细胞的离心沉淀和涂片同时进行； 2. 制备细胞悬液，细胞悬液中用含有少量蛋白质，并将细胞浓度调至106个/ml； 3. 将滤纸片孔对准出孔，然后插入机头凹槽内，用弹簧片顶紧，使滤纸片夹于标本室的出孔与载玻片之间； 4. 离心标本必须对称放置，保持平衡。然后吸取细胞悬液0.1—0.2ml迅速滴入标本室入口，以1000r/min离心5min； 5. 离心完毕后自动关机。取出载玻片在空气中干燥后； 6. 用甲醇固定，吉姆萨染色； 真空过滤法： 1. 用含有10%血清的培养液将培养物调制成浓度为106个/ml的细胞悬液； 2. 取5—10ml细胞悬液，用直径为25mm、孔径为0.5μm的Nucleopore多孔； 3. 当过滤悬液还剩余2ml左右时，轻轻加入110ml平衡盐溶液继续过滤，到 剩余2ml时，再加入10ml平衡盐溶液，继续过滤。如此再重复一次。此步骤中平衡盐溶液有漂洗细胞的作用，既能保证细胞充分、均匀地过滤，又为随后的甲醇固定作好准； 4. 然后加10ml甲醇到平衡盐溶液中，一直重复到过滤出的液体是纯甲醇为止； 5. 空气中干燥，待甲醇完全挥发后，进行吉姆萨染色； 染液制备： 1. 称取0.5g吉姆萨粉和22ml甘油； 2. 取少量甘油与吉姆萨粉在研钵内充分混合，研磨至无颗粒； 3. 将剩余的甘油倒入研钵，于56℃保温2h； 4. 加入33ml纯甲醇混匀，即为吉姆萨母液，将其保存于棕色试剂瓶内； 5. 取9份pH6.80—7.38的Sorensen缓冲液和1份吉姆萨母液混合即得染色液
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原代贴壁细胞吉姆萨染色法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
原代贴壁细胞吉姆萨染色法 染液制备： 1. 称取0.5g吉姆萨粉和22ml甘油； 2. 取少量甘油与吉姆萨粉在研钵内充分混合，研磨至无颗粒； 3. 将剩余的甘油倒入研钵，于56℃保温2h； 4. 加入33ml纯甲醇混匀，即为吉姆萨母液，将其保存于棕色试剂瓶内； 5. 取9份pH6.80—7.38的Sorensen缓冲液和1份吉姆萨母液混合即得染色液； 贴壁细胞染色步骤： 1. 去除培养器皿内的培养液，用平衡盐溶液反复漂洗单层培养物2次； 2. 加入平衡盐溶液，再逐滴加入等体积甲醇，边加边混合，静置10min； 3. 将50%甲醇-BSS混合液丢弃，加入新鲜的甲醇液浸泡固定细胞10min，然后用甲醇漂洗细胞1次； 4. 将瓶内细胞干燥后储存或直接染色； 5. 按2ml/cm2的比例滴加吉姆萨染液，覆盖细胞层，染色2min； 6. 移除染液，用自来水冲洗掉粉红色背景后，再用去离子水冲洗细胞； 7. 用显微镜观察单层潮湿细胞。若细胞已干，可重新使细胞潮湿后再观察； 结果： 细胞核被染成紫红色或紫蓝色，而细胞质则被染成浅红色； 吉姆萨染色法注意事项： 1. 染液宜现用现配，旧染液染色效果不佳。染液保存时间不宜超过48h； 2. 吉姆萨对pH极敏感，因此，缓冲液pH要准确，否则染色效果不佳。如用染色缸染色时，随染色时间的延长，在染液表面常形成一层氧化膜（发亮）易附着在玻片上形成污秽，且不易除掉。因此在用染色缸染色，尤其用的不是现配者时，染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化层再进行染色。染色完毕，应把标本浸入水中漂洗染液；
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ELISA技术与自动化
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
ELISA技术与自动化 在一般的概念里，ELISA技术的可操作性强，不需复杂设备，甚至完全手工加样、洗板和肉眼判读结果，便可完成该技术的操作。随着人们对质量控制意识的加强，尽可能做到最低限度的减少系统误差，以及减少劳动强度等观念的不断改进，解决ELISA技术中加样、温育、洗板及判读结果过程的系统误差问题及高效率运作问题导致了自动化概念的形成。ELISA技术的加样、温育、洗板及判读结果过程的科学地、有机地、系统地结合，尽可能地减少各环节的人为因素的影响，便成为自动化ELISA技术的理论基础。 在自动化ELISA技术中，可以将整个体系分成加样系统、温育系统、洗板系统及判读系统、机械臂系统、液路动力系统及软件控制系统等几种结构，这些系统既独立又紧密联系。加样系统包括加样针、条码阅读器、样品盘、试剂架及加样台等构件。加样针有两手中，一为有TEFLON涂层的金属针，另一为可更换的一次性加样头(Tip) 0有些仪器的加样针只配金属针，无一次性加样头，有些是两种针都配备。加样针的功能主要是加样品及试剂，它是靠液路动力系统提供动力，通过注射器样的分配器进行精确加样的。加样针的数量在各型号仪器上是不同的，有一根的、两根的或多根的O条码阅读器是帮助识别标本的重要工作，目前的仪器均配有此装置。样品盘除了放置标本外，还能放置稀释标本用的稀释管，供不同检测目的使用。试剂架是供放置酶标记试剂、显色液、终止液等试剂用的，有些型号的仪器这一部分是独立的，有些是并在样品盘上O加样台是酶标板放置的平台，有些仪器在台上设置温育装置，让温育在台上进行O整个加样系统由控制软件进行协调操作。 温育系统主要由加温器及易导热的金属材料板架构成O有些是盒式的，有些是台式的O一般控制的温度可在室温- 50°C之间。温育时间及温度设置是由控制软件需确调控的。 洗板系统是整个体系的重要组成部分，主要由支持板架、洗液注入针及液体迸出言路等组成。;洗液注入针一
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基于纳米粒子等离子体共振耦合的细胞中分子组装的动态影像
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
Dynamic Imaging of Molecular Assemblies in Live Cells Based on Nanoparticle Plasmon Resonance Coupling 基于纳米粒子等离子体共振耦合的细胞中分子组装的动态影像 Jesse Aaron, Kort Travis,‡ Nathan Harrison, and Konstantin Sokolov Department of Biomedical Engineering, Department of Physics, UniVersity of Texas at Austin, Austin, Texas 78712, and Department of Imaging Physics, UT MD Anderson Cancer Center, Houston, Texas 77030 Received June 8, 2009; Revised Manuscript Received July 21, 2009 ABSTRACT 摘要 We used molecular-specific gold nanoparticles to monitor epidermal growth factor receptors (EGFR) in live A431 cells over time. Dark-field hyperspectral imaging, electron microscopy, and electrodynamic modeling were used to correlate optical properties of EGFR-bound plasmonic nanoparticles with receptor regulation state. We showed that receptor trafficking resulted in a progressive red shift of greater than 100 nm in the nanoparticle plasmon resonance wavelength over a time period of 60 min. Furthermore, we demonstrated that changes in peak scattering wavelengths of gold nanoparticles from 546±15 to 574± 20, and to 597±44 nm are associated with EGFR trafficking from the cell membrane, to early endosomes, and to late endosomes/multivesicular bodies, respectively. Finally, we used the changes in scattering spectra of EGFR -bound nanoparticles and a straightforward statistical analysis of RGB-channel color images of labeled cells to create near real-time maps of EGFR regulatory states in living cells. 在A431活细胞中我们用含有特定的金纳米粒子的分子去监控表皮生长因子受体(E
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IBL公司 EB病毒 VCA/EA IgA ELISA 试剂盒与玻片法两种检测方法的比较
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
IBL公司 EB病毒 VCA/EA IgA ELISA 试剂盒与玻片法两种检测方法的比较 --样本来自中山大学肿瘤研究中心 1. 材料与方法 1.1 样本 90个样本中32例为女性其余为男性。玻片法检测VCA IgA 和EA IgA，其中50个样本都为阳性，40个样本都为阴性。样本年龄范围在28-83岁之间。 1.2 玻片法检测 玻片法是中山大学癌症研究中心一贯采用的方法，长期用于鼻咽癌的筛查，病理性符合率为98%。 1.3 ILB EB VCA/EA IgA 试剂盒检测 来自IBL公司的两种试剂盒编号分别为EB VCA IgA RE56271(批号EBA173); EB EA IgA RE56211(批号EAA150);样品严格按照说明书进行操作。 2 结果与讨论 2.1 IBL EB VCA IgA 试剂盒 (RE56271)检测结果与玻片法检测结果比较，如下表。 Table1：Numbers of positive and negative results of the two methods EIA-on-Slide method Total + - IBL EB VCA IgA ELISA Kit(RE56271) + 48 0 48 - 2 40 42 Total 50 40 90 Note: samples with OD value in grey zone (8-12U/ml)are considered positive. 结果显示： (1) 与玻片法比较，IBL EB VCA IgA的阳性率为48 / 50×100%=96.00 %. (2) 与玻片法比较，IBL EB VCA IgA的阴性率为40 / 40×100%=100%. (3) 与玻片法比较，IBL EB VCA IgA总的一致性为88 / 90×100%=97.78%. (4) 两种方法具有很高的相似性。 2.2 IBL EB EA IgA 试剂盒 (RE56211)检测结果与玻片法检测结果比较，如下表。 Table2：Numbers of positive and negative results of the two methods EIA-on-Slide method Total + - IBL EB EA IgA ELISA Kit(RE56211) + 35 0 35 - 15 40 55 Total 50 40 90 Note: samples with OD value in grey zone (8-12U/ml)are considered positive. 结果显示： (1) 与玻片法比较，IBL EB EA IgA的阳性率为35 / 50×100%=70.00 %.. (2) 与玻片法比较，IBL EB EA IgA的阴性率为40 / 40×100%=10
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热敏电阻应用与恒温循环器
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
说到恒温循环器，也只能从热敏电阻的主要参数中谈起，可以这么说恒温循环器的精度控制不好，零功率电阻误差就会扩大，自然影响自热测量，然而控制自热又是运用热敏电阻的关键，可见一个影响链的尾端的恒温循环器的重要性。 1 NTC的术语及主要参数 在家电开发研制领域里，工程人员在运用热敏电阻的过程中，有时对一些主要参数的细节产生歧义，原因之一是某些参数的定义和内容缺乏统一的标准和规范。随着国家标准《直热式负温度系数热敏电阻器（第一部分：总规范）》GB/T 6663.1-2007/IEC 60539-1:2002（以下简称“国标”）的实施（07年9月1日），情况开始有所改变。国内热敏电阻器生产家都应当按照“国标”标注热敏电阻的参数，使用者也可以根据“国标”向厂家索取热敏电阻的参数。 热敏电阻器是一种随（感应）温度的变化其电阻值呈显著变化的热敏感半导体元件。温度升高时阻值下降的热敏电阻器，称为负温度系数热敏电阻器（NTC）。家电领域里大量使用的是NTC。 自热:当我们对NTC进行测量和运用时总会通过一定量的电流，这一电流使NTC自身产生热量。NTC的自热会导致其阻值下降，在测量及应用过程中出现动态变化，所以控制自热是运用NTC的关键。当NTC用于温度测量时，应当尽量避免自热；当NTC用于液位或风速测量时，则需要利用自热。 零功率电阻：定义见“国标”。零功率电阻是热电阻器最基本的参数，厂家给出的热敏电阻器的阻值都属于零功率，，但“零功率”一词容易使人费解（因为物理含义上的零功率检测是不存在的），所以，理解它的工程含义是定义中后一句的内容“……自热导致的电阻值变化相对于总的测量误差可以忽略不计”。通常，对NTC的零功率测量是在恒温循环器中进行，影响总的测量误差有二个主要因素：一是通过NTC的电流，一是恒温循环器精度。一般说来，减少通过NTC的电流的方法比较多，一旦电流下降到一定程度，影响总误差的往往是恒温循环器的精度。 环境温度变化引起的热时间常数（τa）：一般情
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CCD尺寸与图像的关系到底有多大？
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
图森图像近期推出了针对荧光、化学发光等弱光拍摄使用的顶级1.8英寸大面阵CCD相机，分辨率达到了610万像素。 这颗大面阵CCD芯片的相机，到底有什么优点呢？ CCD技术所为人津津乐道的是像素的快速增长。大家都沉迷于像素快速增长的乐趣，昨天你的相机是五百万像素，今天我就推出八百万像素的相机，明年便是一千万像素，天真的认为越高像素拍出的图像会越清晰对我们的分析能有更多的好处。 但是当制造商站在用户的角度上的时候，用户真正需要的是什么？用户要的是**的成像质量的图片，这个图片能帮他发现更多的细节，突破肉眼的极限，能帮他做出更好的文章。 那么成像质量的重要因素是什么？究竟什么影响着我们拍摄的图片？ 其实这一切中最重要便是CCD的尺寸，在成像领域的重要性，应该使用这个公式： CCD尺寸 》CCD分辨率 除了尺寸你也许还听过很多其他的名词：曝光宽容度、信噪比、镜头焦距，灵敏度，我需要告诉你的是这些都是和CCD尺寸相关的参数。 CCD的感光元件是像素，而每个像素好比可以用来储存电荷的桶，这个桶能容纳电荷的极限表明了CCD的动态范围，也就是曝光宽容度。CCD尺寸的大小直接决定了这个桶的大小。相同尺寸 CCD，当像素的体积增大，当然这会造成CCD的像素数相对减少，其容纳电荷的能力就越强。 从图像噪声方面，在检测方面，过多的图像噪声是检测产生错误的重要原因。而过低的灵敏度，在获取同样的图像信号时候，你需要调节更大的增益值和更长的曝光时间，正是噪声增加的罪魁祸首，而 CCD尺寸的放大，使得像素可以获得更多的光子，相机的灵敏度增加，从而使得曝光时间和增益值都不用过大，图像更加清晰，噪声更低。 这就是为什么在荧光、近红外光、化学发光这些微弱发光的领域，分辨率成为退而求其次的要求，而更在乎大尺寸CCD芯片的原因。 在大尺寸CCD领域，图森图像拥有齐全的2/3英寸、1.8英寸CCD等大面阵相机。能够符合不同用户的需求。 因此CCD的尺寸才是选择
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原代细胞甲基绿-哌咯宁法显示DNA和RNA
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
原代细胞甲基绿-哌咯宁法显示DNA和RNA 基本原理： 甲基绿（methyl green）和哌咯宁（pyronin）均为碱性染料，因此可与带负电荷的磷酸根形成盐。甲基绿分子有2个正电荷，易与双链DNA分子结合使原代细胞核内的DNA呈蓝绿色。哌咯宁分子有一个正电荷，易与单链RNA分子结合使原代细胞质和核仁内的RNA显示红色。也有人认为染色原理与核酸分子的空间构型有关。 配制试剂： 1. 0.2mol/L pH4.8的乙酸缓冲液的配制 将1.2ml冰乙酸加蒸馏水定容至100ml，在使用时再加2.72g乙酸钠（NaAc·3H2O），待完全溶解后，即可使用； 2. 甲基绿-哌咯宁染色液配制 A液：取2g甲基绿加入100ml pH4.8的0.2mol/L的乙酸缓冲液中即可； B液：取1g哌咯宁加入100ml pH4.8的0.2mol/L的乙酸缓冲液中即可； 用时将A、B液按5：2混合即可； 染色步骤： 1. 取培养于盖玻片上的贴壁原代细胞，用Hanks液漂洗三次； 2. 70%乙醇溶液固定10min，取出后晾干； 3. 滴加甲基绿-哌咯宁染色液覆盖盖片样品，染色15min； 4. 蒸馏水冲洗3次； 5. 95%乙醇分色，晾干； 6. 用二甲苯透明，用光学树胶封片后观察； 结果： 原代细胞核因含DNA呈绿色，细胞质及核仁因含RNA呈红色；
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原代细胞DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
原代细胞DNA与RNA的吖啶橙荧光染色法 基本原理： 吖啶橙（acridine orange，AO）是一种常用荧光染料，吖啶橙与原代细胞内的DNA、RNA都有亲和力，但有一定的特异性，即结合后发不同颜色的荧光，DNA呈亮绿色，而RNA呈橘红色至火红色。此法简便快捷，既可染活原代细胞又可染固定原代细胞。用于直接染色观察活原代细胞或固定染色观察原代细胞均可。吖啶橙对活原代细胞毒性小，配成1×10-4—2×10-4可用于直接染色活原代细胞和进行荧光显微镜观察，但不持久，用固定染色观察法效果更好。 材料： 1. 盖片单层培养原代细胞； 2. 固定剂：95%乙醇或乙酸/甲醇（现配）； 3. 吖啶橙：用生理盐水配成1%的干液。使用时再用PBS稀释成1×10-4—2×10-4mol/L pH4.5—5.0的染色液； 4. 0.1mol/L的CaCl2； 5. 1%乙酸； 染色步骤： 1. 将盖片单层培养原代细胞从瓶中取出，立即用温Hanks液漂洗3—5s，以去除培养基中血清； 2. 投入95%乙醇或乙酸/甲醇固定15—30min，用滤纸接触盖片边缘，盖片微干； 3. 用1%乙酸酸化30s； 4. 用1×10-4—2×10-4的吖啶橙染液染色30s或1min； 5. 用0.1mol/L的CaCl2处理30s—2min； 6. PBS漂洗3次，每次数秒； 7. PBS封片，荧光显微镜下直接观察并拍照； 8. 注意事项：观察中应随时填加PBS以避免标本干涸。如用油浸镜观察，需再覆以大盖片盖在附有原代细胞盖片上，保证原代细胞面朝上，用无荧光性油浸镜观察。原代细胞盖片标本在95%乙醇中能保存数日后仍可观察，如退色，再用AO染色。镜下观察，DNA呈翠绿色，RNA呈火红色。 结果： 原代细胞核因含DNA呈绿色，细胞质及核仁因含RNA呈红色；
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xCELLigence系统实时检测神经毒性
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
xCELLigence系统持续检测神经细胞培养 Sebastian Diemert, Julia Grohm, Svenja,Tobaben, Amalia Dolga, Carsten Culmsee 德国，马尔堡大学，药理学与临床药学研究所 摘要：为了研究类神经元细胞HT-22，及原代培养大鼠皮质神经元细胞对不同细胞死亡刺激物的反应，我们使用由罗氏与ACEA Biosciences公司联合开发的实时细胞分析仪（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系统，应用非侵入式、无标记性技术，对类神经元细胞HT-22进行持续监测。研究表明，通过对细胞形态学改变、细胞粘附与细胞增殖的监测，xCELLigence系统可对神经细胞培养进行持续监测并追踪细胞的变化及其死亡情况。 关键词：神经细胞死亡、xCELLigence系统、原代皮质神经元细胞、HT-22 细胞、细胞阻抗、实时测定 前言 在很多神经退化性疾病中发现了神经元凋亡与坏死。近几年来，神经科学研究中建立了几种细胞培养模式，用于体外细胞死亡机制的研究。尽管近年来科学界对神经元细胞死亡信号传导原理已经得了一定成果，但技术上的局限性依然存在，从而限制了对数据的采集与解读。而无法进行神经细胞死亡的实时监测是一个主要的技术瓶颈。目前为止，主要的细胞增殖、细胞生存与细胞死亡检测方法均为侵入式终点检测，通常对细胞有毒性，并需要对细胞进行破坏处理。 同时，对神经细胞死亡与潜在机制进行动态变化分析，需要大量的实验操作，涵盖持续的、多个时间点。目前有几种终点实验法，可进行特定凋亡时间点上的特异性分子事件的检测，如磷脂酰丝氨酸转位至细胞膜外部，线粒体功能障碍、半胱氨酸蛋白酶激活，以及 DNA 断裂[1]。这些终点测定的一个缺陷是，其无法确定实验凋亡时间点。为解决这个问题，研究人员需要重复对细胞死亡形态学改变进行监测。 目前，使用由罗氏与 ACEA Biosciences公司联合开发的实时细胞分析仪（Real-Time Cell Analyzers，RTCA）xCELLigence系统，应用非侵入式、无标记性技术，可对细胞进行持续监测。
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原代细胞富尔根（Feulgen）反应显示DNA
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
原代细胞富尔根（Feulgen）反应显示DNA 基本原理： 显示DNA的传统方法是富尔根（Feulgen）反应，切片先用稀盐酸处理，DNA经弱酸（1mol/L HCL）水解后，在60℃条件下使DNA分子中脱氧核糖与嘌呤之间的连接打开，脱氧核糖的一端释放出醛基，并在原位与Schiff试剂反应生成紫红色产物。原理同PAS反应，使细胞核DNA显紫红色。在此过程中RNA不受影响，故染色具有DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水解时间是成功的关键。水解过度或不足均降低染色强度。 配制试剂： 1. 1mol/L HCL:将8.5ml浓盐酸和91.5ml蒸馏水混合即得； 2. 0.5%亮绿水溶液； 染色步骤： 1. 取培养于盖玻片上的贴壁原代细胞，用Hanks液漂洗三次； 2. 在卡诺（Carnoy）固定液中固定10min，然后蒸馏水洗三次； 3. 移入60℃浓度为1mol/L的HCL中静置10min； 4. 用蒸馏水漂洗几次； 5. 放入Schiff试剂中静置30—60min，可随时检查显色情况； 6. 用自来水冲洗5min； 7. 再用蒸馏水漂洗； 8. 不同浓度梯度乙醇溶液脱水； 9. 用二甲苯透明、树胶封片； 结果： 原代细胞核内DNA显紫红色，细胞质呈绿色；
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原代细胞骨架的染色方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
原代细胞骨架的染色方法 微丝的显示方法步骤： 1. 用PBS液漂洗盖片培养的原代细胞3次，每次30s； 2. 用2%的甲醛/PBS液固定原代细胞3min； 3. 用0.5%的三硝基甲苯/PBS处理3次，每次10min； 4. PBS漂洗3次； 5. 用罗丹明（rhodamine）标记的鬼笔环肽（phalloidin）（1：10）室温中反应15min； 6. PBS漂洗3次； 7. 60%甘油+荧光防淬剂封片； 8. 荧光显微镜观察； 微管的显示方法： 1. 用PBS液漂洗盖玻片的原代细胞3次，每次30s； 2. 在室温中用3%甲醛/PBS固定20min； 3. 用PBS液再漂洗3次，每次1min，最后用滤纸吸干多余的PBS液； 4. 投入冷丙酮中（-10—-20℃）7min； 5. 用PBS漂洗3次，每次1min，最后用滤纸吸干多余的PBS液； 6. 向直径6cm的干净碟皿中央滴一滴浓度为0.1—0.2mg/ml的一级抗微管蛋白抗体，令小盖片细胞面向下扣在抗体液上，覆以皿盖，于37℃温箱中放置45min—1h； 7. 向碟皿内匀速缓慢滴加PBS，令盖片浮起在液面，用镊子夹出，按步骤3处理； 8. 向干净碟皿中央滴一滴浓度为0.1—0.2mg/ml的荧光标记的二抗，其后操作按步骤6进行； 9. 按步骤7和3操作； 10.滴pH8.5的90%的甘油/PBS少许于载玻片上，把小盖片的原代细胞面覆在大盖片上； 11.将盖片置于荧光显微镜下观察；
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xCELLigence 系统内源性GPCRs 细胞功能研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
xCELLigence系统实时评测内源性G-偶联蛋白受体（GPCRs）功能 Jeff Irelan 美国圣地亚哥ACEA Biosciences 公司Jonathan H. Morgan 美国弗吉尼亚州Manassas ATCC 产品经理 前言 G-偶联蛋白受体（GPCRs），即 7-跨膜蛋白，是当今临床与科研药物的单一**靶点，也是迄今发现最大的靶点家族。据推测人基因组中，该家族的功能成员超过300个，涉及多种不同细胞与组织间的广泛信号途径。研究证实，对GPCR功能的调节，有助于免疫学、神经病学、心脏病学与肿瘤学领域多种疾病的**。通过应用新的基于细胞水平的受体功能检测技术，候选药物对新调节子的确认率显著提高，损耗率（定义为临床前检测/临床试验失败率）降低。但基础研究获得的GPCR 功能数据很难被应用于临床疾病中。造成这种情况的原因是，传统细胞学实验往往（1）使用异源细胞，或相关性较低的细胞类型，进行人造受体的过表达；（2） 使用外源性检测试剂，如荧光标记试剂；（3）使用侵入性处理手段，像染料负载以及细胞裂解，（4）生成的数据仅为单一时间点的数据，而不是持续性细胞监测数据。 最近开发的生物相关性程度更高的实验系统，可显著改善 GPCR 药物开发与研究应用的成功率(1)。罗氏应用科学部的 xCELLigence 系统，不需要使用外源性标记，即可对疾病相关细胞的内源性GPCR功能进行实时评测。将细胞接种于含有微电极的培养板上，可对GPCR 激活导致的细胞骨架结构的微小变化与细胞收缩情况进行准确测定。 通过与细胞浆鸟嘌呤核苷结合蛋白或 G 蛋白结合偶联，GPCRs 可进行细胞的信号传导活动。所有主要的与 G 蛋白偶联的第二信使通路，都已被发现会激活环化AMP/蛋白激酶 A、钙离子/磷酸酶 C、β-抑制蛋白/MAPK，以及 Rho 家族 GTP酶，使细胞发生形态学改变。而xCELLigence 系统可通过记录细胞阻抗，很容易对形态学改变进行检测(2)，从而完成对GPCR的检测。 与传统检测方法相比，形态学阻抗测定可对多个信号途径累积效应进行捕获。内源性GPCR 功能测定的
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小片段法进行基因分型
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
用高分辨率熔解数据的内部标准校正杂合子检测 摘要： 背景：用于基因分型的高分辨率熔解曲线技术既简单又有效。在以熔解为基础的方法中，探针法是基因分型的黄金标准，可以将等位基因与目标的匹配完全区分开。小片段基因分型法是代替探针的基因分型法。异源双链核酸分子的存在使得检测纯合子变得容易，其熔解峰的形状有明显的改变。纯合子G/C或A/T的基因分型比较困难，因为其等位基因的Tm值相似。这些碱基对改变的纯合子用小片段法很难区分。样品间的温度、buffer和体积的变化限制纯合子的分离。不管仪器是多么精确，用户操作的变化是需要注意的，减少这种变化的方法可以改进小片段基因分型。利用内部特定反应的标准可以克服这些限制。 方法：合成校准的核苷酸，与其互补链的浓度相同。用普通PCR仪进行PCR反应，反应时有LC Green和内标的存在。PCR反应之后，将其放入LightSanner中，扫描55℃-97℃范围内的数据。标准品熔解的特征是成一条线的，用于转换每个样品的荧光数据。测序之后确认基因型。我们通过测量每个样品的峰形与基因型一致的平均Tm值的距离，评估较正之前和之后纯合子基因分型的错误率。 当样品的Tm值与不正确分组平均Tm值相近时，可以观测到错误。 结果：通过扫描大量的样品板及PCR目标校准，使得碱基对SNP突变的基因分型敏感性从90%增至99%。校准之后，Tm标准差从0.056降至0.027℃。 结论：在小扩增子内用温度内标可以改进G/C和T/A的碱基改变的基因分型。此工作由美国国立卫生研究院的R44DK069106和R44HD053215到SFD和R42GM072419和R42GM073396到CTW资助。 背景： 由于核苷酸的遗传性能，变性或熔解，基因型之间的特征是多样性的。以探针为基础的基因分型有相当大的特定等位基因温度偏移——几摄氏度的优势。高分辨率提供全部双链转换的详细的图，使排除探针法变得可能。另外，检测全部扩增时，可以获得每个实验碱基数目的密度达到20倍的。尽管如此，因为潜在的相似的熔解
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应用非标记探针法进行基因分型
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
用非标记探针、遮蔽技术及高分辨率熔解扩增子分析对RET原癌基因进行基因分型 RET原癌基因单个碱基的突变可以引发多发性内分泌腺瘤2型。RET突变传统的基因分型方法是外显子测序。一种闭管操作的基因分型方法已经成熟，此方法用的是一种饱和DNA染料，非标记探针及高分辨率熔解扩增子分析。此方法需要两个连续的聚合酶链式反应阶段，主要的和第二次实验。主要的实验共用7个反应和8个非标记探针分析RET基因外显子10、11、13、14和16 。主要实验基因分型了野生型外显子，外显子13普通的多态性，外显子16的一个突变及其它检测到的序列变化。主要非标记探针数据限制检测到的RET基因序列突变的基因分型，这些突变位点的基因分型在第二次实验的2-5个反应中进行。设计6条探针，所用方法是：用遮蔽技术和遮蔽选择的序列变化使探针下其它位置的突变的分析变得明确。这两步RET基因分型之后，少于实验0.2%的外显子需要测序确定基因型。对5个野生型和29个可用的RET序列突变样品（与测序结果100%一致）做盲研究。用非标记探针和遮蔽技术进行高分辨率熔解分析是快速、精确的基因分型方法，>50的RET序列突变可以进行基因分型。 多发性内分泌腺瘤2型（MEN2）综合症，MEN2A，MEN2B及家族性甲状腺髓样癌由生殖细胞系RET基因外显子10、11、13和16的突变引发。MEN2综合症是常染色体显性秩序失调引起的高生命危险的甲状腺癌。RET突变的遗传学检测可以确认处于甲状腺癌危险中但是没有爆发癌症的病人，此时切除甲状腺可以增加存活的机率。 之前有许多实验方法检测或基因分型RET突变，比如说单链构象多态性，变性梯度凝胶电泳，温度梯度毛细管电泳，限制性内切酶消化PCR产物，焦磷酸测序，荧光标记杂交探针及微卫星。但是，这些方法中的大多数需要PCR反应之后的操作来检测突变。其中一些方法报道突变检测的敏感性为95%或少于95%，或者仅实验了RET突变样品的一小部分。这些方法分析RET序列变化的限制范围，可能只以普通突变为目
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