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正常角膜缘干细胞的免疫染色
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
正常角膜缘干细胞的免疫染色 试剂和材料： 1. 一抗： （1） ABCG2-----------------小鼠单克隆BXP-21---------1：100 （2） 连接蛋白-43-----------兔多克隆CX43-------------1：100 （3） 细胞角蛋白3（K3）-----小鼠单克隆AE5----------- 1：500 （4） 细胞角蛋白12（K12）---兔多克隆J7-------------- 1：200 2. 二抗； （1） 抗小鼠IgG-------------Alexa-488----------------1:2500 （2） 抗兔IgG---------------Alexa-546----------------1:1500 3. 封闭抗体：PBSA配制的10%热灭活羊血清； 4. Trion X-100； 5. PBSA； 6. 多聚甲醛（PFA），将16%原液用PBSA现配成4%的工作浓度； 7. Immu-Mount防褪色封片剂； 8. 载玻片和#1盖玻片； 9. 共聚焦显微镜； 实验方法： 1. 培养在塑料平皿或羊膜上的细胞； 2. CMF-Saline G洗一遍； 3. 用新鲜配制的4% PFA室温固定15min； 4. PBSA洗一遍； 5. 0.1% Triton X-100破膜10min； 6. 样本与一抗室温孵育1h； 7. PBSA洗2遍； 8. 加入二抗室温孵育1h； 9. 用PBSA洗2遍； 10. #1盖玻片，用最小体积的防褪色的封片剂封片； 11. 在荧光或共聚焦显微镜下用40×油镜对样本进行观察；
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正常人角膜上皮细胞和干细胞的分离
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
正常人角膜上皮细胞和干细胞的分离 实验材料： 1. 完整的人角膜； 2. GMF-Saline G； 3. 中性蛋白酶Ⅱ，1.2U/ml（用DMEM/F12/GASP稀释2.4U中性蛋白酶Ⅱ）； 4. 胰蛋白酶/EDTA； 5. DMEM/F12/GASP； 6. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS； 7. CMF/GASP； 8. LSC培养基； 9. 弯虹膜剪，11cm（4-3/8in）； 10. Jeweler’s镊，10cm（4in）； 11. 角膜剪，19mm刃，尖头； 12. Colibri缝纫钳，0.1mm； 实验方法： 1. 清洗角膜3×5min； 2. 剪除残留的巩膜，结膜和虹膜； 3. 加入2ml中性蛋白酶Ⅱ，4℃过夜，轻微搅动； 4. 将加入中性蛋白酶Ⅱ的角膜放入4℃摇床摇30min； 5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜； 6. 解剖显微镜下，小心去除角膜中央的上皮细胞（此时多数的中央上皮细胞已经剥脱）并除去角膜缘包含有Vogt栅栏区的色素上皮细胞； 7. 用胰蛋白酶/EDTA消化角膜缘上皮细胞片37℃，10min； 8. 加入等体积DMEM/F12/2FB/GASP； 9. 400g离心10min，弃上清； 10. 用DMEM/F12/2FB/GASP洗一遍，离心，弃上清； 11. 加入LSC培养基，将细胞拍散并用血细胞计数板计数； 12. 将细胞以1×104/cm2的密度接种至铺有3T3饲养层的组织培养皿或准备好的人羊膜上； 13. 每三天更换一次培养基； 14. 当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代：
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测定比旋光度
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
有些有机化合物，特别是很多的天然有机化合物，在分子结构上呈现为螺旋形。这样的构成能使偏振光的振动平面旋转一定的角度α，其中使偏光振动向左旋转的为左旋性物质，使偏光振动向右旋转的为右旋性物质。 角度α就是相对应得旋光度。旋光度的大小和样品管的长度（即溶液厚度）成正比。在一定的范围内与溶液的浓度大约为正比关系。此外，旋光度还和溶剂、温度、波长等因素有密切的关系。 所以有必要使用一个标准，以便于比较光学活性化合物的旋光度大小，这个标准就是比旋光度，用于考察单位浓度，单位溶液厚度下的旋光度。 比旋光度是旋光物质重要的物理常数之一，经常用它来表示旋光化合物的旋光性。通过测定旋光度，可以检验旋光性物质的纯度并测定它的含量。测定旋光度的基本结构及其测量原理如下图。 光线从光源经过起偏镜，再经过盛有旋光性物质的旋光管时，由于物质具有旋光性，使得产生的偏振光不能通过第二个棱镜，必须旋转检偏镜才能通过。检偏镜转动角度由标尺盘上移动的角度表示，此读数即为该物质在此浓度时的旋光度α。 旋光度α除了与样品本身的性质有关以外，还与样品溶液的浓度、溶剂、光线穿过的旋光管的长度、温度及光线的波长有关。一般情况下，温度对旋光度测量值影响不大，通常不必使样品置于恒温器中。因此常用比旋光度[α]λt来表示各物质的旋光性。在一定的波长和温度下比旋光度[α]λt可以用下列关系式表示： 纯液体的比旋光度= [α]λt=α/（d·l） 溶液的比旋光度= [α]λt=100·α/（c·l） α：标尺盘转动的角度读数（即旋光度），用旋光仪测定； λ：光源的光波长； d：纯液体的密度（单位：g/cm3）； l： 旋光管的长度（单位：dm）； c：溶液的浓度（100mL 溶液中所含样品的质量，g）； t： 测量时的温度（℃）。 操作： 1. 溶液样品的配制： 在分析天平上精确称取0.1至0.5g 纯样品，溶解，置于25mL的容量瓶中定容，溶剂常选水、乙醇、氯仿等。溶液配好后必须透明无固体颗粒，否则须经干滤纸过滤。
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晶体的光学活性
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
晶体物质的种类很多，按照晶格结点上粒子的种类和粒子间作用力的不同，可以分成不同的类型。从立体化学的角度可以将晶体分成2大类，具有光学活性，和不具有光学活性。和具有光学活性的化合物一样，晶体中粒子的排列如果存在一重反轴S1（一重对称反轴即对称面），二重反轴S2（即对称中心），四重反轴S4或更高级的反轴时，则此晶体不具有光学活性。如果不存在以上几种对称因素，则具有光学活性。即粒子在晶体中的排列是非手性的，就不具备光学活性，若是手性的就具备光学活性。从宏观上观察晶体，若具有光学活性，则晶体的晶形是手性的，若不具有光学活性，则晶体的晶形是非手性的。当然，只有透明的手性晶体才能观察到它的光学活性。从光学活性晶体的微观结构观察，其中的粒子都是以某种螺旋的形状排列的。有些晶体的晶面螺纹在显微镜下可以清楚的观察到。 光学家很早就发现，晶体中的粒子若以右手螺旋的形式排列时，晶体呈右螺旋。若以左手螺旋的形式排列时，晶体呈左螺旋（如下图）。 左侧是右手螺旋，右侧是左手螺旋 由于平面偏振光是由左旋圆偏振光和右旋圆偏振光组合而成。当平面偏振光射入各向异性的晶体时。这2种圆偏振光的折射率不相等。折射率的差别，其本质上是因为2种圆偏振光在晶体中的传播速度不同而产生的。传出晶体时，2种圆偏振光不会是同步的，重新组合成偏振光时，就改变为椭圆偏振光，其偏振面将会产生一个角度的变化，这个角度就是晶体的旋光度。偏振面向右旋转，称为右旋，用“+”来表示。偏振面向左旋转，称为左旋转，用“-”来表示。为了比较各种不同晶体旋光能力的大小，须要排除晶体厚度、晶体浓度、光的波长等对旋光度测定的影响因素。因此要将旋光度转化为比旋光度（即在单位密度、单位厚度下的旋光度）。 [a]D20=a/（l*d） 式中： [a]--比旋光度，20表示在室温20摄氏度下测定，D表示钠光D线589nm。 a--实际测得的旋光度。 l--光通过的晶体厚度，以dm为单位。 d--晶体的密度，以g*cm-
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脂肪族化合物的旋光性
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
脂肪族化合物从光学活性物质的数量及其复杂性上看都是一类重要的化合物。脂肪族化合物的结构是非刚性的，容易发生变化。各种不同构象之间的转化能垒很小，这些构象在平衡体系中所占的比例易受外界条件的影响。理论上每个C-C单键的自由旋转都可产生无限多的构象。因此它是分析和研究旋光性与结构之间关系最困难的一类化合物。 尽管这类化合物中每一个C-C单键都可产生无限多个构象，但是只有3个能量最低的交叉式和3个能量最高的重叠式构象，其他都是介于交叉式和重叠式之间的构象。在常温下每个C-C键的构象平衡体系中，3种交叉式构象的总百分比含量约占99%以上。这个百分比实际上包含交角接近于60度的构象，因为这些构象的能量与交角为60度的交叉式构象能量差值很小，而且这些中间构象中6个共价键的相对平均位置，其交角都是60度。常温下，在构象平衡体系中的重叠式构象很少。因此在一般情况下，在分析结构和旋光性之间的关系时，只考虑3个交叉式构象及其百分含量，不必考虑重叠式构象。只有个别的特殊化合物在极性很小的溶剂中或气相中，有可能存在接近于重叠式的构象。当电负性很强的原子取代丙烷中C1上的氢原子时，就会出现这种情况。因取代的原子电负性很大，诱导效应使它们带有过剩的负电荷。由于同样的原因，使其相邻原子上的氢原子带有部分正电荷。氟、氧、氯原子与邻位C上的氢原子都有较强的静电引力。因而接近于重叠式的构象反而稳定。在极性溶剂中，如水、醇，因溶剂化效应，这种重叠式构象会因此而消除。在确定最稳定的构象时，还须注意通常2种取代基处于对位交叉式是最稳定的构象。如果2种取代基之间可以形成氢键或其他某种引力，也会使邻位交叉式成为最稳定的构象（如下图）。 邻位交叉式为稳定构象的几种化合物 由此可见，在分析结构和旋光性之间的关系时，要特别注意构象分析。在确定稳定构象时，要注意能否形成氢键以及偶极间的作用力。构象分析时不能忽略溶剂的作用。 范德华力和弯曲键
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正常人原代角膜间质细胞的分离
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
正常人原代角膜间质细胞的分离 实验材料： 1. 完整的人角膜； 2. GMF-Saline G； 3. 中性蛋白酶Ⅱ；PriCellls原代细胞分离试剂盒 4. L型胶原酶，1mg/ml在DMEM/F12/GASP中； 5. GMF-Saline G配制的TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶； 6. DMEM/F12/GASP； 7. DEME/F12/2FB/GASP：DMEM/F12/GASP含2%FBS； 8. CMF/GASP； 9. 3.5cm塑料组织培养皿或6孔板； 10. 手术刀或单刃的安全刀片； 11. 细胞滤网，70μm血液尼龙过滤网； 12. 塑料刮片，“Cell Lifter”或“Cell Scraper”； 13. 弯虹膜剪，11cm（4-3/8in）； 14. Jeweler’s镊，10cm（4in）； 15. 角膜剪，19mm刀刃，尖头； 16. Colibri缝纫钳，0.1mm； 17. SDS样本缓冲液，使用终浓度：0.058mol/L Tris，5%丙三醇，1.67% SDS，0.02%溴酚蓝； 18. PriCells原代细胞特制基础培养基； 19. PriCells原代细胞培养特制添加剂； 实验方法： 1. 用GMF-Saline G清洗角膜3×5min； 2. 剪除残留的巩膜，结膜和虹膜； 3. 加入PriCells原代细胞分离试剂盒的试剂，4℃摇床摇动过夜； 4. 将加入试剂的角膜4℃摇30min； 5. 用DMEM/F12/GASP清洗角膜； 6. 解剖显微镜下，小心去除上皮和内皮细胞； 7. 用塑料刮片轻刮基膜的上皮细胞面和内皮细胞面。显微镜下观察，以确保完全去除这些细胞层； 8. 用新鲜培养基清洗角膜基质一次； 9. 用手术刀或安全刀片或精细手术剪将基质剪碎成2mm左右的小块； 10. 用DMEM/F12/2FB/GASP配制的胶原酶37℃消化3h，直至大多数组织消失； 11. 400g离心10min，弃上清； 12. 用DMEM/F12/2FB/GASP重悬细胞，用70μm细胞滤网过滤消化液，并离心； 13. 重复上述清洗步骤2遍，每遍之后细胞计数； 14. 用MJM将分离出的间质细胞重悬并以1×104/cm2的密度接种至塑料组织培养皿； 15. 每三天更换一次PriCells原代细胞特制基础培养基＋PriCells原代细胞培养特制添加剂； 16. 当细胞达90%汇合时用胰蛋白酶消化传代：
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利用Hoechst 33342外流性质分选原代角膜间质干细胞
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
利用Hoechst 33342外流性质分选原代角膜间质干细胞 试剂和材料： 1. 2—4代的间质细胞； 2. HBSS/2FB； 3. Hoechst 33342染料，1mg/ml水溶； 4. 碘化丙啶（PI），2mg/ml水溶； 5. 维拉帕米，500μg/ml水溶； 6. DEME/2FB； 7. 胰蛋白酶/TrypLE：TrypLE Express或0.25%胰蛋白酶，溶于CMF-Saline G； 8. MoFlo（或与其类似的）高速细胞分选仪，具备350nm激发能力； 实验方法： 1. 用PriCells原代细胞分离试剂盒2—4代的间质细胞； 2. 细胞计数，用DMEM/2FB将细胞稀释至1×106/cm2个细胞/ml； 3. 加入5μg/ml Hoechst 33342染料，37℃，90min，每20min搅动一次； 4. 对照组细胞在加入Hoechst 33342染料前，先加入50μg/ml维拉帕米孵育20min； 5. 染色后，在4℃环境下用HBSS/2FB将细胞洗两遍并离心，之后在冰上用冷HBSS/2FB重悬细胞； 6. 于分选前加入2μg/ml PI以鉴别无活性的细胞； 7. 无菌条件下分选细胞，高速细胞分选仪，用350nm激发。收集蓝色（670nm）和红色（450nm）荧光均减弱的细胞。边群细胞通过上述步骤与死细胞和完全被染料标记的细胞分离开并被收集起来。对照组要确保用维拉帕米先行孵育后使边群细胞消失；
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叶绿素荧光技术：常量和微量营养元素胁迫测量
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
植物生长与各种常量和微量营养元素密切相关，所以测量各种常微量元素对植物的胁迫效应具有很重要的意义。大量的研究表明，Fv/Fm、Yield和ETR是与植物CO2固定能力密切相关的三个参数，所以在研究中倍受瞩目。 但我们应该知道，植物营养元素的胁迫除非到了非常严重或者较为严重的程度才会影响到光系统II。这三个参数并不能反映所有的植物营养元素胁迫，有的可以反映轻度胁迫、有的只能反映中度胁迫、有的则只能反映非常严重或者较重程度的胁迫。 下面的内容指出了Fv/Fm和 Yield两个参数在指示作用上的局限性。 Fv/Fm – 暗适应条件下测量 Fv/Fm 对非常低水平的氮素胁迫比较敏感。 (Baker 2004) Fv/Fm 对较为严重的硫素胁迫比较敏感。 (Baker 2004) Fv/Fm 对镍元素胁迫不敏感。 (Joshi 2004) Fv/Fm 对锌元素胁迫不敏感。(Joshi 2004) Yield or ⊿F/Fm’ –光照条件下测量 Yield 对较为严重的硫素胁迫比较敏感。(Baker 2004) 注：Fv/Fm需要在暗适应条件下测量，可使用OPTIC公司的所有调制式荧光测量仪进行测量，包括OS-5P、OS1P 性价比很高的便携式OS-30P；Yield的测量需要在光照条件下当叶片达到光合作用稳态的时候进行测量，可使用OPTIC公司的OS1-FL、OS5p进行测量。K-Step、 Performance Index、NPQ、qP、FRFex360/FRFex400等参数则只能使用OS5P进行测量。硫元素和氮元素胁迫可以通过叶绿素相对含量测定仪CCM200进行测量 下面的列表显示了对不同植物胁迫类型敏感的测量参数，及其应用文献。 营养元素 测量参数 参考文献 Fv/Fm Yield 硼 Yield and ETR Kastori R.， 1995 Unknown Yes 钙 Fv/Fm Shmidts-Eiberger 2002 Yes Unknown 氯 没有文献 - - - 钴 Yield Joshi 2004 Tripathy 1983 Unknown Yes 铜 1. Yield， 2. Fo/F 测量时间5 minutes 1. Joshi 2004， Lanaras 1993 2. Adams 2000， Kriedemann 1985 Unknown Yes 铁 K Step in O
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人衰老成纤维细胞经紫外线损伤后的DNA 修复和细胞周期调控
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
人衰老成纤维细胞经紫外线损伤后的DNA 修复和细胞周期调控 段建明 张宗玉 童坦君 (北京医科大学生物化学与分子生物学系, 北京 100083) 摘要 以体外培养的不同代龄的人胚肺二倍体成纤维细胞(2BS) 为对象, 紫外线诱导DNA 损伤后, 观察细胞形态、增殖特性、细胞周期、DNA修复变化等细胞应答以及gadd153、p21、p53 等基因的转录水平的表达变化. 结果显示: 紫外线诱导DNA损伤后, 衰老(>55代) 2BS 细胞形 态及增殖能力的改变不如年轻细胞(
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ACQUITY UPLC-TUV测定奶粉和牛奶中三种牛乳清蛋白的含量
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
ACQUITY UPLC-TUV测定奶粉和牛奶中三种牛乳清蛋白的含量 赵淑军 沃特世科技（上海）有限公司 摘要：一种α-牛乳清蛋白和两种β-牛乳清蛋白标准分别用超纯水稀释配制，采用ACQUITY UPLC BEH300 C18色谱柱分离，ACQUITY UPLC-TUV超高效液相色谱检测。Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种乳清蛋白可达基线分离，线性范围为1.000-100.000mg/kg，复相关系数R2_0.999，方法的检出限为1.000 mg/kg。 关键词：超高效液相色谱 奶粉 牛奶 牛乳清蛋白 Bα-La Bβb-Lg Bβa-Lg 前言 乳清蛋白是牛奶中的主要蛋白质，乳清蛋白主要包括α-牛乳白蛋白（Bα-Lactalbumin，Bα-La）、β-牛乳球蛋白（Bβ-Lactoglbulin，Bβ-Lg）、蛋白酶-胨和牛血清白蛋白等，前两者是乳清蛋白的主要成分，分别占其总量的10-20%和40-50%，β-牛乳球蛋白包括Bβb-Lg和Bβa-Lg两个遗传变异体。[1-2] 乳清蛋白具有营养价值高、易消化吸收、含有多种活性成分等特点，已经被越来越多地应用于食品工业，市场上同时出现了不同种类和品牌的乳清蛋白保健品，如儿童营养蛋白粉、婴儿配方奶粉等[3]。但有报道乳清蛋白又是一种常见的过敏原，β-乳球蛋白是最主要的过敏原，α-乳白蛋白紧随其后[4]。UPLC以其1.7μm超细填料色谱柱和15000psi的超高效液相色谱系统，可以完美实现Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg三种乳清蛋白分离；尤其对于Bβb-Lg和Bβa-Lg两个遗传变异体可实现完全分离。以及配备高灵敏度Waters ACQUITY TUV紫外检测器，整个系统检测三种乳清蛋白检出限达到1ppm。该检测方法可应用于牛奶或奶粉中α-牛乳白蛋白和β-牛乳球蛋白的定量检测。 实验方法 材料、试剂和仪器 乙腈为色谱纯，三氟乙酸为优级纯，Triton X-100，氯化钠（优级纯），实验用水为超纯水（18MΩ，TOC3ppb），牛乳清蛋白标准品Bα-La、Bβb-Lg和Bβa-Lg；ACQUITY UPLC®超高效液相色谱系统，配Acquity TUV检测器、FILTER MIXER （425μl，P/N 205000403）。 数据处理系统 Empower 2 中文版 前处理方法 称取0.20 g奶粉样品或2ml液
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安全阀的介绍及选用
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
安全阀是锅炉、压力容器和其他受压力设备上重要的安全附件。其动作可靠性和性能好坏直接关系到设备和人身的安全，并与节能和环境保护紧密相关。而有的用户和设计部门在选型时，总是选错型号。为此本文对安全阀的选用加以分析。 安全阀的选用 由操作压力决定安全阀的公称压力，由操作温度决定安全阀的使用温度范围，由计算出的安全阀的定压值决定弹簧或杠杆的定压范围，再根据使用介质决定安全阀的材质和结构型式，再根据安全阀泄放量计算出安全阀的喉径。以下为安全阀选用的一般规则。 （l）热水锅炉一般用不封闭带扳手微启式安全阀。 （2）蒸汽锅炉或蒸汽管道一般用不封闭带扳手全启式安全阀。 （3）水等液体不可压缩介质一般用封闭微启式安全阀，或用安全泄放阀。 （4）高压给水一般用封闭全启式安全阀，如高压给水加热器、换热器等。 （5）气体等可压缩性介质一般用封闭全启式安全阀，如储气罐、气体管道等。 （6）E级蒸汽锅炉一般用静重式安全阀。 （7）大口径，大排量及高压系统一般用脉冲式安全阀，如减温减压装置、电站锅炉等。 （8）运送液化气的火车槽车、汽车槽车、贮罐等一般用内装式安全阀。 （9）油罐顶部一般用液压安全阀，需与呼吸阀配合使用。 （10）井下排水或天然气管道一般用先导式安全阀。 （11）液化石油气站罐泵出口的液相回流管道上一般用安全回流阀。 （12）负压或操作过程中可能会产生负压的系统一般用真空负压安全阀。 （13）背压波动较大和有毒易燃的容器或管路系统一般用波纹管安全阀。 （14）介质凝固点较低的系统一般选用保温夹套式安全阀。
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从人关节软骨中分离软骨祖细胞
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
从人关节软骨中分离软骨祖细胞 试剂和材料： 1. 骨关节炎患者行膝盖关节半切开手术时未累及的部分； 2. 链霉蛋白酶消化培养基：DMEM/F12（1：1）、5%的FBS、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素（50mg/ml），0.2%（终浓度100μg/ml）、链霉蛋白酶 70U/ml、HEPES 10mmol/L； 3. 胶原酶消化培养基：DMEM/F12（1：1）、5%的FBS、抗坏血酸 50μg/ml、葡萄糖 1mg/ml、庆大霉素（50mg/ml），0.2%（终浓度100μg/ml）、Ⅰ型胶原酶 300U/ml、HEPES 10mmol/L； 4. 胰蛋白酶/EDTA：胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.53mmol/L）PBSA配制； 5. PBSC：含1mmol/L CaCl2，1mmol/L MgCl2的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液； 6. PBSA：无Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液； 7. 胎牛血清； 8. 牛血清白蛋白（BSA），10μg/ml和1mg/ml，PBSC配制； 9. 血清纤连蛋白，10μg/ml，PBSC配制； 10. 尼龙膜，40μm筛网； 11. 普通器皿，30ml，或离心管50ml，带圆锥底部便于细胞离心； 12. 解剖刀片，10号； 13. 解剖刀柄，3号； 14. 镊子，2对（1大1小）； 15. 矿油凝胶（凡士林）； 16. 克隆杯，6mm； 17. 分离软骨用的锁子甲手套； 实验方法： 1. 组织收集和细胞分离； （1） 无菌条件下，用10号解剖刀片小心从软骨下骨下面解剖软骨。将软骨薄片置于含PBSA的9cm Petri培养皿中； （2） 用镊子和刀片仔细将软骨切成1mm3小块； （3） 将软骨小块转移至含18ml链酶蛋白消化培养基的普通器皿或离心管中； （4） 置于滚转机37℃处理1h； （5） 吸出消化液弃之； （6） 加入18ml胶原酶消化培养基，再次置于滚转机37℃处理1h； （7） 40μm细胞滤网过滤； （8） 用血细胞计数板进行细胞计数； （9） 加入黏附测定培养基，620g离心10min进行洗涤，用黏附培养基以2000个细胞/ml密度重悬细胞（4000个细胞）； 2. 差异黏附测定； （1） 用10μg/ml纤连蛋白包被3.5cm Petri培养皿，4℃过夜。阴性对照使用10μg/ml BSA； （2） 吸出液体，用含1mg/ml BSA的PBSC封闭培养皿30min
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人软骨细胞的分化
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
人软骨细胞的分化 试剂和材料： 1. 分化培养基：DMEM/F12（1：1）、1%ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒；V/V）、TGF-β1 1ng/ml、HEPES 10mmol/L； 2. 胰蛋白酶/EDTA：胰蛋白酶（0.05%）和EDTA（0.53mmol/L）PBSA配制； 3. PBSA：无Ca2+,Mg2+的Dulbecco′s磷酸盐缓冲液； 4. 离心管，15ml； 5. 普通器皿，30ml，或圆锥底的离心管（50ml）； 实验方法： 1. 从培养瓶中吸出生长培养基弃之； 2. PBSA润洗后弃之洗液； 3. 加入足量的胰蛋白酶/EDTA覆盖培养瓶底； 4. 在37℃孵育5—10min（在显微镜下观察细胞是否脱落）； 5. 重悬细胞，置于15ml离心管中，300g离心5min； 6. 用1ml生长培养基洗涤，转移至普通器皿或离心管中； 7. 用血细胞计数板对细胞进行计数； 8. 重复离心（620g，10min），弃去上清液； 9. 用分化培养基将其稀释到1×106个细胞/ml； 10. 按1ml/管分装到新Eppendorf管中； 11. 300g离心5min，上清保留不动； 12. 置于37℃孵箱； 13. 每2—3天更换培养基； 14. 培养2—3周软骨生成；
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在WB实验中为什么需要使用内参抗体
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，**方法是Western Blot。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用的。 我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。艾美捷向您推荐使用内参抗体来检测您的实验系统，或者校准您的实验结果。内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异
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旋转蒸发器的常见故障和排除方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-30
旋转蒸发器的常见故障和方法 一、电机不转检测内容： 1、电控箱指示灯（或数显）亮，检测电箱内外部插头联线是否松动、断线。 2、电控箱指示灯（或数显）不亮。 3、确认"1、2"无异常。 4、变频器受高频干扰显示"O.U."。 5、变频器保护机能显示。 采取方法： 1、重新插插头，接通断线。 2、更新保险丝或确认供电无异常。 3、更新线路板或电控箱。 4、接妥地线或变动工作地点。 5、按变频器说明书P33排除。 二、浴锅不加热检测内容： 1、浴锅无数显。 2、温控仪中"OUT"或"ON"绿色指示灯亮不加热。 3、浴温低于设定温度时，温控仪中"OUT"或"ON"绿色指示灯不亮。 4、温控仪上显示"OVER"或"000"。 采取方法： 1、检测电源220V。 2、换加热圈。换固态继电器或继电板。 3、换温控仪。 4、检测探头接线或更新探头。 三、浴锅冲温检测内容： 1、浴温高于设定温度时，温控仪中"OUT"或"ON"绿色指示灯不灭。（1-2℃属正常） 2、温控仪中"OUT"或"ON"绿色指示灯已灭，仍继续加热。 3、数显浴温远远低于实际浴温。 采取方法： 1、换温控仪。 2、换固态继电器或继电板。 3、换探头或温控仪。 四、真空抽不上检测内容： 1、容器内有溶剂，受饱和喷射器压限制。 2、真空油泵能力下降。 3、真空皮管，接头松动，真空表具泄漏。 4、磁粉探伤仪作保压试验，在没有任何溶剂的情况下，关断所有外部蝶阀和管路，保压一分钟，真空表指针应不动，表示气密性良好，反之见右。 5、放料阀、压控阀内有杂物。 6、玻璃丝棉夹芯板破损。 采取方法： 1、放空溶剂，空瓶试。 2、真空油泵换油（水），清洗检修。 3、沿真空管路逐段检测、排除。 4、①重新装配，玻璃丝棉夹芯板磨口擦洗干净，涂真空硅脂，法兰口对齐拧紧。 ②更新失效密封圈。 5、清洗。 6、更新或修复。 五、电机飞车（只有最高速）检测内容： 1、检测测速发电机线圈是否断路，用万用表量七芯插头"1、2"脚（插头对正槽两边）正常电阻400Ω左右。 2、发电机线圈与外壳短路。 3、发电机磁环不转
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