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空间转录组测序制备高质量样本的方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
10x Genomic Visium空间基因表达解决方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）在确定不同细胞群的同时保留空间位置，为细胞功能、表型和组织微环境中位置的关系提供了重要信息。该技术一经问世便受到了人们的广泛关注，而越来越多的研究成果也表明了空间转录组测序技术为广大科研工作者带来了前所未有的组织学研究深度。 在进行空间转录组研究时，实验样本的准备直接决定了研究的成败。如何高质量的准备组织样本呢？一起来看看这份秘籍吧。 秘籍1：组织样本要筛选 空间转录组研究的特点是基于空间物理位置的转录组学研究，所以组织样本的选择是该研究的前提条件。由于空间转录组捕获芯片的限制（6.5mmX6.5mm），组织样本最后上芯片的切片不能超过该面积范围。因此，在选择实验样本前，需要对进行研究的样本进行预实验。通过前期组织学检测，确认好样本的最佳取材位置，最合理组织大小。如果样本是较大的组织，可以在后续OCT包埋、切片过程中被分割（1mm切口的预冷刀片），避免深切口损伤组织。 秘籍2：样本保鲜很重要 空间转录组是针对转录组学的检测，因此，新鲜样本是保证RNA完整性的前提（后续RNA RIN值＞7）。将新鲜组织样本取下后迅速用预冷的PBC溶液或者生理盐水冲洗组织表面残留，然后用干净的纱布或吸水纸吸干液体（防止其他体液在组织表面形成冰晶，影响OCT包埋效果）。 组织冷冻与包埋过程 秘籍3：样本冻存不可少 空间转录组研究平台是基于冰冻样本（基于FFPE样本的空间测序须参照石蜡样本标准制备指南）进行研究的，所以在样本冻存前至少提前10分钟将异戊烷和液氮浴准备好（之所以用异戊烷而不直接用液氮进行速冻，是因为液氮沸点比较低，直接液氮处理可能在沸腾过程中使组织周围形成空穴，导致不同区域降温不同步而改变内部形态，甚至组织碎裂）。然后用镊子或者刮刀将新鲜组织转移到异戊烷中，使组织完全浸没且浸泡至少1分钟。冷冻后，可用镊子或者刮刀将组织转移到密封的预冷容器或者冻存管
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通过不同糖对纤维素酶保护的机理研究分析海藻糖对蛋白的保护机理
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
海藻糖是一类新兴的蛋白保护剂，可有效保护蛋白酶在不同条件下的活性，具体保护机制已有相关研究分析，本篇文章向大家介绍清华大学杨小民等的研究成果。 该研究通过测量海藻糖、葡萄糖、蔗糖、葡聚糖以及纤维素酶与这些糖的混合物的红外光谱和差示扫描量热谱图，比较糖和纤维素酶分子之间的相互作用，以深入研究海藻糖对纤维素酶的保护机理。 通过比较糖和纤维素酶及其混合物的红外（IR）谱图，判断海藻糖、葡萄糖和蔗糖原有氢键的作用形式发生了改变，纤维素酶和糖分子之间形成了氢键。而纤维素酶对葡聚糖的红外光谱特征频率几乎没有影响，说明酶和葡聚糖分子之间没有明显的相互作用。此外，红外谱图还表明，海藻糖、葡萄糖和蔗糖的羟基与纤维素酶分子的酰胺基之间存在比较强的分子间作用力。 根据差示扫描量热谱图结果，测得海藻糖玻璃化转变温度为107℃，相转变温度为123℃，葡聚糖玻璃化转变温度为92℃，相转变温度为132℃。葡萄糖和蔗糖没有玻璃化转变现象。说明海藻糖和葡聚糖都存在玻璃化转变温度且温度较高，其在比较高的温度下仍可处于玻璃态。 图1 海藻糖、葡聚糖、葡萄糖和蔗糖的差示扫描量热谱图 差示扫描量热谱图显示，纤维素酶的物理热变性温度为120℃，在添加海藻糖之后，物理热变性温度提高到137℃，添加葡萄糖后该物理热变性温度提高到140℃，说明海藻糖和葡萄糖同纤维素酶的分子之间存在较强的分子间作用力，且该作用力增加了酶分子空间结构的热稳定性。 图2 纤维素酶与糖混合物的差示扫描量热谱图 综合以上结果，葡萄糖和蔗糖在高温下，其羟基可以替代水分子同纤维素酶分子表面的酰胺基形成氢键，但实验观察发现，高温下葡萄糖和蔗糖与酶的混合物发生明显的褐变现象，说明有化学反应发生，差示扫描也说明葡萄糖和蔗糖在高温下不能形成玻璃态，因此高温下葡萄糖与蔗糖无法保护纤维素酶的酶活性。 葡聚糖的羟基不能与纤维素酶分子形成氢键，但在高温下能形成玻璃态对酶分子
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疼痛研究的新进展及常见的研究方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
When we live with pain, we are not living our true selves. We are not living our best selves. We are not even living at all, because the pain overtakes our ability to think, feel. Even to love. -- 《成瘾剂量》 疼痛研究是全世界科学家、医生、药厂都在关注的重要科学问题，是寻找药物和相关应用的重要研究方向，也是目前神经科学研究的热点之一。 1. 2021年诺贝尔生理学或医学奖——人类痛觉和触觉全新研究方向 今年大卫·朱利叶斯 (David Julius) 教授和阿登·帕塔普蒂安 (Ardem Patapoutian) 教授因先后发现“温度和触觉感受器”共同获得2021年诺贝尔生理学或医学奖。他们的突破性发现，为我们对热觉、冷觉和机械刺激感知形成的理解奠定了基础，也开启了全新的研究方向[1]，揭示了热觉、冷觉和机械刺激是如何被我们的神经系统感知的；温度和触觉感受器参与多种生理和病理过程。 2. 疼痛的新定义 1979年，国际疼痛学会(The International Association for the Study of Pain, IASP) 在世界范围对疼痛进行了定义。《中国疼痛医学杂志》的翻译：疼痛是一种与实际或潜在的组织损伤相关的不愉快的感觉和情绪情感体验，或与此相似的经历。 2020年7月16日，IASP对“疼痛”(Pain) 定义进行了修改，并在线发表在其会刊《PAIN》杂志上，这是IASP对自1979年开始在全世界使用的疼痛定义的首次修订。 图注：1979年版与2020年版疼痛定义的区别 图注：疼痛定义句型结构解析 3. 常见的疼痛研究方法 伤害感受性疼痛是由于刺激组织损伤的疼痛感受器(伤害感受器)造成，这些感受器主要位于皮肤或内脏。引起伤害性疼痛的伤害有切割伤、挫伤、骨折、挤压伤、灼伤、或其它任何可损害组织的伤害。该类疼痛常规会采用机械疼痛检测设备（如Von Frey，Randall-Selitto、面部刺痛温度刺痛），温度测痛设备（如：冷热盘、温度位置偏好测试、温度梯度测试、热痛甩尾、Hargreaves）等设备。 炎症性疼痛
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手动计数vs自动计数：手动计数方法的注意点
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
血球计数板 你知道吗？血球计数板自18世纪首次被应用于分析人的血液样本以来，逐渐发展为实验室细胞计数的标准工具。因为其操作简单，对实验环境要求不高，只要有一台显微镜即可进行细胞计数操作。但如果想使用它得出较为精准的结果则对操作者的要求很高，因为在操作时可能会带来各种误差： 1、计数操作引入误差 血球计数板使用步骤较为复杂，计数结果的准确度不仅和上样后铺满计数池的均匀程度相关，同时浓度较高时的镜下计数难度较大，不同操作者之间的计数差异甚至高达52%，即使同一个人的操作差异仍有可能达20%[1]。所以需要在实际计数过程中，同一操作者在相同的条件下进行多次计数以减小误差[2]。 2、计算过程引入误差 通过血球计数板获取的数据结果，需要在镜下一边计数一边记录，再对结果通过一系列的计算，从而转化成实际的细胞浓度数据，然后计入细胞原液的稀释倍数（如台盼蓝的稀释等），即可得到目的细胞样品的浓度。计算过程中的误差也会影响到最终的实验结果[3]。 3、样品制备引入误差 首先，均匀细胞悬液样本的准备对计数结果的准确性至关重要。对于某些极易聚团或未能均匀打散的细胞悬液，人工计数时，往往不易识别导致误差被放大。其次，依据大多数实验室的习惯，通常会采取对四个顶角的大格内的细胞进行统计计数，每个大格的细胞量一般在30-50个之间时，计数结果会更加准确。这就意味着，细胞悬液浓度过高或过低都不利于获得准确的结果。多数情况下，我们需要对悬液进行有效的稀释。 另外，不仅操作因素会导致误差出现，本身血球计数板的设计对标准化的操作流程也有一定考究。 据一项研究表明，在计数过程中，盖玻片的位置偏移可造成7.6%的计数差异[4]，不同品牌的盖玻片质量厚度对样品的均匀扩散也会有一定影响。同时血球计数板计数的视野面积也影响着计数的准确度，常用计数板进行普通细胞系计数时的计数面积为1mm2，取样面积越小，CV值越高、误差越大[5]。并且，若血球计数板清洁过度、清洗
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小鼠眼球注射实验操作和方法与技巧
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
背景： 目前在全球范围内因为眼部疾病致盲人数约有4000万，这其中有相当一部分属于遗传性视神经病变，如老年黄斑变性、Leber先天性黑朦、Leber遗传视神经病变等等[1]。 随着基因疗法的兴起，通过腺相关病毒(AAV)、慢病毒(LV)等作为药物递送载体，对遗传性眼部疾病进行基因修正已经取得许多重大进展，越来越多的基因药物被开发出来，而小鼠作为常用的药物筛选模型，在基因**的临床前研究中占据重要地位。 眼球作为相对独立的器官，球内注射是最有效的药物递送方式。眼球注射可突破血眼屏障,使药物迅速浓集于眼内, 继而在眼内扩散到达作用部位。具有代表性的眼内注射给药途径有视网膜下(subretinal)注射和玻璃体腔(Intravitreal)注射，玻璃体内注射能够使基因药物可以较快扩散至视网膜或脉络膜部位，如临床上常用于老年性黄斑变性的药物输送；视网膜下注射可将药物直接传递到视网膜和视网膜色素上皮细胞(RPE)之间的潜在空间，是将药物直接递送至RPE细胞的最佳方法。 玻璃体注射和视网膜下注射示意图[2] 一、视网膜下注射 实验仪器耗材： 手术器械、吸入式麻醉机、Hamilton注射器（30G、33G）、托品酰胺、去氧肾上腺素、手术显微镜 实验步骤： 1. 动物麻醉 1) 小鼠置于诱导盒内进行吸入式异氟烷麻醉，捏合小鼠脚指确认是否麻醉完全 2) 将老鼠转移到解剖显微镜下，连接鼻锥持续给予异氟烷 3) 待注射眼睛滴加一滴丙美卡因(或类似的表面麻醉剂)防止注射引起局部反射，轻触结膜确定麻醉深度。 2. 扩瞳 1) 倾斜鼠标头部，使待注射眼睛在视野范围内，用棉签擦去任何多余的液体 2) 向待注射眼球滴加1-2滴1%托品酰胺和0.5%去氧肾上腺素用于扩大瞳孔 3. 巩膜切口 1) 使用镊子在上下眼睑之间滑动，使眼球从眼窝中伸出，暴露巩膜 2) 采用30G针头在角巩膜缘后面做一个小的巩膜预切口，如果液体从切口处流出，则针头穿刺过深而进入玻璃体腔，之后注射过程中的液体可能进入玻璃体腔 角巩膜缘稍后处切口示意图 4. 注射
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基于根提拉力和X射线成像的玉米根系结构表型研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
根系不仅是绝大多数陆生植物赖以生存的基础，还是提高作物抗逆性、养分积累和产量的重要抓手之一。对玉米而言，整个主根、侧根、冠根共同形成了一个复杂的系统，控制着植株汲水、觅养和抗倒伏的能力。尽管目前已有不少根系表型新方法，但在田间试验中，最常用的方法仍是提取测量根系上部（根冠），接着基于人工测量或二维成像技术进行性状量化，如PSTOL1、DRO1、土壤取芯、根提拉力测量等。然而，二维的表型技术受单一视角限制，无法达到足够高的准确度。 根提拉力测量法由于操作简便，常用于实地测量中，因而也具备大规模表型分析的潜力。根提拉力通常与根系生物量和分枝大小有关，但目前尚未有研究证实根提拉力与目前常用的根系结构测量数据间的关联。 近日，Plant Phenomics在线发表了题为Complementary Phenotyping of Maize Root System Architecture by Root Pulling Force and X-Ray Imaging的研究论文。 针对以上问题，该文章使用X射线计算机断层扫描（CT）技术，扫描生成高精度玉米根冠三维模型，并建立了能够同时测量71个特征的处理方法（Figure 1）。该方法改进了估测根系结构遗传贡献的流程，且具有极高的精度，能够全局检测根系结构生长发育的各种变化或者由环境变化而产生的根系分布的细微变化（Figure 2）。论文结果表明，根提拉力测量是一种高通量的根系形状提取方法，可估计根系质量，并且与该文方法中的多个三维特征显著相关（Figure 3）。总而言之，该文提出的方法能够用于校准和解读多种试验场景下的根提拉力测量值，并且能够辅助对根系结构的遗传研究工作。 Figure1：Pipeline for 3D root imaging using X-ray computed tomography. Figure2：RPF and 3D global root system architecture traits are affected by genotype, environment, and developmental time point. Figure3：RPF and 3D root system architecture traits are strongly associated with each other an
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维生素高通量靶标定量技术介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
维生素(Vitamin)又名维他命，分为水溶性维生素和脂溶性维生素，有“维持生命营养素”之称，是一类微量有机物质，是生物酶的辅酶或辅基，主要参与人体新陈代谢或调节能量转化，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要的作用。 人体中维生素绝大部分必须从食物中摄取, 一旦缺乏就会引发相应的维生素缺乏症，对人体健康造成损害。长期缺乏某种维生素，会导致代谢过程障碍、生理功能紊乱抵抗疾病能力减弱，进而引发多种病症。世界卫生组织报告指出，人类常见疾病有135种，其中106种与维生素摄取不足有关。因此，维生素检测能为改变饮食习惯，调整膳食结构提供一定的依据。 水溶性维生素检测参考列表 技术路线 技术参数 样本要求 植物组织：1g/sample 动物及临床组织标本：200 mg/sample 血清、血浆：200 μL/sample 尿液：1 mL/sample 细胞、微生物：1X 107 cells/sample 粪便、肠道内容物：200 mg/sample 储存和运输 液氮或-80°C保存；足量干冰运输，避免反复冻融 检测平台 UHPLC-QQQ-MS (Exion LC -Sciex QTRAP® 6500+) 常规项目周期 实验检测：50个自然日 数据分析：5个自然日 应用方向 维生素预防、诊断疾病应用的研究 生物化学、食品科学、临床医学、保健等领域的研究
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如何分析定量PCR实验中的Ct值与Cq 值？
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
在进行定量PCR实验时，实验数据中的C t值是至关重要的。今天将带您了解 Ct值在 qPCR 中的关键作用、及其计算方式和分析统计方法。 C t值多重名称 在我们深入解释什么是 Ct 值之前，我们想花点时间强调一下，多年来该值已被赋予多个名称，包括： C t – 阈值循环 C p – 交叉点 TOP——起飞点 C q – 量化周期 这些值都是一样的，只是名称不同。为了规范qPCR的命名法，一般标准实验中会使用Cq值。 什么是 C q值？ 定量PCR实验通常用于量化目标序列的绝对量或比较样本之间目标序列的相对量。该技术通过放大过程中发出的目标特异性荧光信号实时监测目标的扩增。 尽管实时荧光定量PCR中， 荧光染料和探针 应该是序列特异性的，但在大多数实时 PCR 实验中会出现大量的背景荧光。通过阈值线和 C t值可以轻松分析背景中的荧光信号，了解 PCR的循环周期。其实，所谓的阈值线是检测水平或反应达到高于背景水平的荧光强度的点。在进行 PCR 之前，您（或您的 PCR 仪中的软件）设置了一个阈值水平。这实际上是图表中的一条线，代表高于背景荧光的水平，它也在指数阶段开始时与反应曲线相交（图 1）。 C q值是您的样品反应曲线与阈值线相交处的 PCR 循环数。该值表明从您的样本中检测到真实信号需要多少个周期。实时 PCR 运行将具有每个样品的反应曲线，因此会有许多 C q 值。您的 PCR 仪软件会计算 每个样品的 Cq值并绘制图表。 (实时 PCR 扩增曲线上的阈值水平和 C q 值) C q 值与样本中目标核酸的数量成反比，并与样本中的目标拷贝数相关。较低的 C q值（通常低于 29 个循环）表示大量的目标序列。较高的 C q 值（超过 38 个循环）意味着较低的目标核酸量。高 C q值也可能表明目标或 PCR 设置存在问题，如本文后面的陷阱部分所述。 您的 PCR 仪器将在每个循环中收集荧光数据。大约 15 个循环后，您将对背景荧光水平有一个很好的了解 ——这将显示为一条从零循环点开始的直线。阈值水平将刚好高于此水平，但在您的样品开始进
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文献解读：通过AAV调控相关基因表达缓解全身性代谢紊乱
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
基于AAV载体的基因**在近年来备受关注，今天给大家分享的文章证实了通过AAV调控相关基因表达，可缓解全身性代谢紊乱，从而提高胰岛素敏感性，为人类肥胖相关代谢性疾病提供了新的**策略。 近年来研究表明胰岛素抵抗与代谢紊乱相关，为探讨PPA1对全身性胰岛素敏感性的影响，研究人员首先构建了PPA1基因敲除小鼠，通过高脂喂养后出现脂肪细胞功能损伤和全身代谢紊乱，并表现出多组织的胰岛素抵抗。进而通过AAV递送使PPA1基因敲除小鼠体内过表达PPA1，发现全身性代谢紊乱和胰岛素抵抗等疾病表型得到了显著改善，进一步研究证实了，PPA1可作为PPARγ靶基因，起到维持脂肪细胞线粒体功能并达到调节全身胰岛素敏感性的作用。 构建PPA1基因敲除小鼠模型并观察到胰岛素敏感性下降 通过构建PPA1基因敲除小鼠（实验组），给予正常饲料喂养，发现实验组小鼠相比于野生型（对照组）小鼠在体重、血糖水平以及葡萄糖耐量试验等方面无显著差异，但通过葡萄糖钳夹技术（检测胰岛素抵抗的“金标准”）检测，我们发现实验组小鼠的胰岛素敏感性降低，随着小鼠年龄的增长，其胰岛素抵抗不断升高，且相比于对照组小鼠的空腹血糖显著升高，表明AAP1可能在维持全身性胰岛素敏感性上发挥重要作用。 图1. PPA1基因缺陷可引起小鼠胰岛素敏感性下降。 PPA1的缺乏加剧高脂喂养导致的小鼠脂肪代谢紊乱和胰岛素抵抗 通过高脂喂养，我们发现在相同能量摄入的条件下，实验组小鼠的体重相比对照组增加程度更大，空腹血糖水平也更高，其中实验组小鼠的耗氧量、CO2产生量和呼吸交换率RER均显著下降，这表明能量消耗减少是PPA1基因敲除小鼠肥胖的原因之一。在实验组小鼠的肌肉、肝脏和脂肪组织中均发现胰岛素信号传导通路受到了显著抑制，从而表现出更低的胰岛素敏感性。进而通过检测小鼠身体成分，发现小鼠出现严重的非脂肪组织的脂质沉积，即皮下脂肪组织和内脏组织的脂肪沉积减少，但在肝脏中的沉积及外周血中血清总胆固醇（TC）、甘油三酯（TG）水平
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四个层面剖析细胞抱团的原因与解决方法一览
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
您是否总是遇到细胞抱团的现象？ 您是否总是因为搞不清楚细胞抱团原因而困惑？ 您是否总是因为难以将抱团细胞拯救回来而抓狂？ 伙伴们，我来拯救你们的细胞了，今天我给大家从四个层面剖析细胞抱团的真实原因，快来围观吧！ Ⅰ # 细胞本身生长特性有抱团倾向 # 有些细胞本身有抱团生长的特性，给大家看5种喜欢抱团的细胞类型： 细胞类型①：NCI-H716 人结直肠腺癌细胞 形态：淋巴母细胞样 生长特性：悬浮生长 图源网络，仅供参考学习使用 细胞喜欢在悬浮液中呈葡萄状聚集，抱团细胞粒粒饱满 细胞类型②：Caco-2人结直肠腺癌细胞 形态：上皮样 生长特性：贴壁生长 图源网络，仅供参考学习使用 此细胞喜欢贴壁成片分布，呈融合状，细胞个头大小不匀 细胞类型③：CaLu-3 人肺癌细胞 形态：上皮样 生长特性：贴壁生长 图源网络，仅供参考学习使用 此细胞也是喜欢聚集分布，呈片状，片状之间有空白 细胞类型④：SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞 形态：上皮样 生长特性：贴壁和悬浮生长 图源网络，仅供参考学习使用 此细胞贴壁居多，有轻微的抱团倾向 细胞类型⑤：BT-474人乳腺癌细胞 形态：上皮样 生长特性：贴壁、片状生长 图源网络，仅供参考学习使用 此细胞也是喜欢片状生长 看了这么多喜欢抱团的细胞类型，也会有喜欢分散生长的细胞类型吧，来给大家展示2种细胞类型： 细胞类型①：MSC（人源脂肪来源） 形态：成纤维样 生长特性：贴壁生长 图源客户，仅供参考学习使用 此细胞成纤维样，均匀分布，平铺皿底，不留空隙 细胞类型②：HEF小儿包皮成纤维细胞（人源脂肪来源） 形态：成纤维样 生长特性：贴壁生长 图源客户，仅供参考学习使用 此细胞也是喜欢分散生长，均匀分布 看了这些细胞形态，不知您是否和我有一个共鸣：大多数上皮样或神经母细胞瘤样的细胞更喜欢抱团生长，而大多数成纤维样细胞更喜欢分散、均匀生长。 又有
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病毒克星：Marchf2基因与Marchf2基因敲除小鼠的介绍应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
今天和大家见面的是Marchf2基因敲除小鼠。 Marchf2基因 Marchf2是膜结合E3泛素连接酶家族的成员。MARCH能将泛素添加到底物蛋白特定的氨基酸（如赖氨酸）上，从而使目标蛋白具有通过囊泡运输的能力。Marchf2能减少多种表面糖蛋白的累积，并能调控早期核内体向高尔基体的运输[1]。 Marchf2可介导TFRC和CD86的泛素化，并促进内吞作用以及通过多泡体分选到溶酶体的过程。编码的E3-泛素连接酶以硫酯的形式接受来自E2-泛素结合酶的泛素，然后将泛素转移到目标底物上。除此之外，该蛋白可能通过与STX6的相互作用参与细胞内的囊泡转运[2]。 图1. MARCHf2蛋白结构预测模型[3]。 与Marchf2相关的疾病包括锁骨下动脉窃血综合征和肺曲菌球病。该基因的一个重要同源基因是Marchf3[4]。 Marchf2基因敲除小鼠 Marchf2基因敲除纯合小鼠对细菌或病毒感染具有更高的的抵抗力，接种细菌或病毒后其载量更少，敲除小鼠的细胞因子产生增加，但脂多糖诱导后致死率增加[5]。 研究人员为了评估Marchf2在先天免疫反应中的作用，使用CRISPR/Cas9系统在C57BL/6背景的小鼠上敲除Marchf2基因，产生了Marchf2-/-小鼠，并验证了Marchf2的基因敲除。 Marchf2敲除小鼠没有表现出形态学的异常。研究人员为了进一步研究Marchf2在体内病毒感染中的作用，将VSV-GFP通过静脉注射到Marchf2+/+和Marchf2-/-小鼠中进行攻毒实验（图 2A）。结果Marchf2敲除小鼠的血清中病毒的载量要比Marchf2+/+小鼠的血清中的少。 此外，研究人员在研究血清中细胞因子的含量时发现，Marchf2敲除小鼠血清中的IFN-β、IL-6、IL-12和TNF-α的浓度高于Marchf2+/+小鼠（图2B）。此外，研究人员还向小鼠注射了病毒RNA模拟配体poly(I:C)，并检测了血清中细胞因子的表达水平（图2C），结果显示，使用配体进行刺激后，Marchf2敲除小鼠的血清中许多细胞因子表达水平高于Marchf2+/+小鼠血清中细胞因子的表达水平。以上这些结果表明Marchf2参与体内抗病毒的免疫反应。 研究人员为了进
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影响qPCR最终效果的六个要素分析与解决方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团（探针或染料），利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应过程，最后通过Cq或Ct值和标准曲线对起始模板进行绝对定量或相对定量分析。而评估荧光定量PCR反应效果好坏，可以从以下几个方面来评估： 1.扩增效率及相关系数 良好的PCR扩增是指数级的，理论上以100%的效率进行，但实际上并不是所有的PCR反应都表现出相同的高效率，所以需要验证实际的扩增效率E。当计算评估PCR扩增效率时，至少需要做3次平行重复，并至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度，得到线性方程Cq= -klgX0+b、扩增效率E=10(-1/k)-1。并且E在0.9-1.1之间，即扩增效率在90-110%，被认为此扩增接近理想情况；相关系数R2值大于0.98时，说明两个数值之间相关的可信度很好，可用来计算。 ▲ 图1. 5个梯度稀释液的扩增曲线及标准曲线。 图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统 2.精确度（Precision） 指多个复孔Cq值之间的接近程度，且重复孔之间的标准偏差不大于0.2，说明实验的重复性较好。 ▲ 图2. 96孔重复的扩增曲线，Cq Mean=19.1，CV=0.002 图源：Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统 3. 重现性（Reproducibility） 指不同批次之间或不同实验室之间的结果变化，通常通过SD或者CV来评估。 ▲ 图3. 4台独立的Azure Cielo™实时荧光定量PCR系统同时检测GAPDH，Cq Mean=20.11，SD= 0.002 4. 灵敏度（Sensitivity） 通常灵敏度表示为检测限(limit of detection, LOD)，可通过梯度稀释样品来确定最低检测限。分析灵敏度是指一个样本可通过实验精确测量的最小拷贝数。 5. 准确度（Accuracy） 指测量值与真实值的接近程度。针对低拷贝样本，由于受采样概率的影响，可能会导致结果不准确。为了更可靠地检测低拷贝，可以增大平行实验的重复数，来统计显著性。 ▲ 图4. 低拷贝样本采样概率符合泊松分布 图源：网络，侵删 6. 特异性（Specificity） 指qPCR实验中只可以检测
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关于4D蛋白质组学技术和其应用方式问题解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
开发高灵敏度和高可靠性的质谱技术一直是人们追求的目标。针对精准医疗的切实需求，布鲁克打造的基于先进质谱技术的4D多组学解决方案让蛋白质组学研究迈入了崭新的时代。 关于4D蛋白质组学，你了解多少呢？4D蛋白质组学技术有哪些应用方式呢？4D-Shotgun（也被称为DDA）、4D-Label free、4D-DIA、4D-PRM又具体指什么呢？且听SBC小编在本系列文章一一道来。 篇章一 4D-Shotgun：蛋白全谱分析，可用于IP/pull down之后的蛋白成分鉴定，对表达蛋白种类进行定性分析。 Q1：什么是4D-Shotgun？ A： 1999年，Yates研究组提出“鸟枪法”(shotgun)，他们把这种思路称为多维蛋白质鉴定技术，即Mud PIT(multidi-mensional protein identification technology)。该方法首先将蛋白质混合物酶解成肽段的混合物，然后对肽混合物进行多维毛细管液相色谱分离，利用质谱进行分析确定该肽段的氨基酸序列，最后计算机根据设定好的运算法则根据肽段的信息在理论蛋白质数据库中检索出这些蛋白质，从而确定该混合物中的蛋白质成分。而4D-shotgun就是在质谱分析这一步将传统的3D分离技术升级到了4D，增加了除保留时间（retention time）、质荷比（m/z）、离子强度（intensity）外的第四个维度-离子淌度（mobility），通过四维对齐的方式显著减少了missing value，并提高定量的准确性。可以说timsTOF Pro平台创新性的4D技术让传统鸟枪法换发新的光彩。 Q2：什么是IP? A: IP（免疫沉淀）是利用抗原抗体特异性反应纯化富集目的蛋白的一种方法。抗体与细胞裂解液或表达上清中相应的蛋白结合后，再与蛋白A/G或二抗偶联的琼脂糖珠子孵育，通过离心得到珠子-蛋白A/G或二抗-抗体-目的蛋白复合物，沉淀通过洗涤后，重悬于电泳上样缓冲液，煮沸5min，在高温及还原剂的作用下，抗原与抗体解离，离心收集上清，上清包括抗体、目的蛋白和少量杂蛋白。 Q3：什么是pull down? A: pull down是利用重组技术将探针蛋白与GST（谷胱甘肽巯基转移酶）融合，融
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肾透明细胞癌致瘤机制：KDM5C基因缺失致使糖原代谢重编和抑制铁死亡
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
文章标题：Deficiency of the X-inactivation escaping gene KDM5C in clear cell renal cell carcinoma promotes tumorigenicity by reprogramming glycogen metabolism and inhibiting ferroptosis 发表期刊：Theranostics 发表时间：2021.08.04 影响因子：11.556 合作客户：武汉大学 百趣提供的服务：PPP、EMP靶标代谢流 研究背景 肾透明细胞癌 (ccRCC) 是最常见的肾癌形式，病症表现为富含脂质和糖原的细胞质沉积物增加。研究表明，ccRCC中诸多基因位点发生突变，其中VHL基因和染色质修饰基因KDM5C。尽管已证明VHL缺失可导致糖原累积，X染色体上KDM5C基因失活逃逸导致男性为主要患者，但其潜在机制仍不清楚。 此外，ccRCC患者存活率较低可能与磷酸戊糖途径(PPP)的上调有关，因此糖原代谢可以作为**靶点，但是，ccRCC中糖原累积和相关致癌功能的遗传因素尚不完全清楚。 本文利用全外显子组与RNA测序评估KDM5C在ccRCC中的功能，结合靶标代谢流研究KDM5C如何影响细胞内代谢通量。同时还对小鼠进行KDM5C基因敲除收集更多的体内证据，揭示了组蛋白修饰基因失活突变重编程糖原代谢的机制，并有助于解决人类癌症中男性占主导地位的长期难题。 研究内容 具有最高糖原水平的 ccRCC 细胞系存在着 KDM5C 基因移码突变 对ccRCC 6个细胞系进行高碘酸-希夫 (PAS) 染色和糖原定量测定发现，相比于其他同样缺乏 VHL基因的癌细胞系，RCC4表现出最高的糖原水平（图1 A、B）。此外，外显子测序结果表明RCC4细胞中KDM5C和VHL出现移码和错义突变，WB结果发现RCC4细胞中不存在KDM5C和VHL蛋白（图1 C、D），由此表明癌细胞中的高糖原水平可能与KDM5C突变有关。 为了验证KDM5C的恢复是否会降低RCC4细胞中的糖原水平，构建了野生型KDM5C或其酶失活突变体H514A的RCC4细胞系，PAS染色结果和糖原定量测定结果表明KDM5C能有效降低糖原水平（图1 E、F），KDM5C突变促进ccRCC中糖原的形成。 鉴于KDM5C是X失活逃逸基因，作者分析不同性
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Vac8/ARMC3在PtdIns3P激酶复合体锚定在自噬起始位点的作用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
8月23日，四川大学卢克锋、许文明团队在Developmental Cell上发表了一篇题为“Autophagic elimination of ribosomes during spermiogenesis provides energy for flagellar motility”的新研究，揭示了Vac8/ARMC3在PtdIns3P激酶复合体锚定在自噬起始位点的作用，以及其在生殖组织特异性自噬中的重要生理功能。 研究背景 自噬是一种进化上保守的真核生物中的降解机制。对于简单的真核生物如单细胞酵母，自噬最基本的功能是在营养饥饿时被激活，进而降解胞内物质来实现物质再循环从而度过该阶段。对于复杂的多细胞真核生物，例如哺乳动物，自噬具有抵抗营养饥饿之外的其他重要功能。 精子从精原细胞历经减数分裂成为圆形精子细胞，然后经历一系列的形态变化和功能转变，形成伸长的成熟精子。在精子的发生过程中，有一个重要变化就是精子中的多余细胞器和细胞质的去除。自噬的功能之一就是在营养缺乏或者受到刺激时将细胞中多余的蛋白质或者细胞器等降解回收以供细胞重新利用。 该研究表明在多细胞生物中，在某些情况下，特别是当细胞突然需要增加新陈代谢时，自噬被激活以降解胞内物质从而满足细胞自主方式的物质和能量需求。 技术路线 构建ARMC3敲除小鼠 Vac8/ARMC3 在生殖组织特异性自噬中的功能分析 机制研究 技术方法 转录组学、质谱、免疫共沉淀、QPCR、免疫荧光染色等。 研究结果 1// 如同其酵母同源Vac8在自噬中发挥作用，ARMC3在小鼠睾丸中也有着类似的自噬功能 首先，研究人员利用ARMC3+/+和ARMC3-/-两种老鼠（ARMC3-/-，由赛业生物提供），在小鼠睾丸组织中验证了ARMC3仍然与酵母同源Vac8的互作蛋白PIK3C3-C1进行互作，ARMC3的敲除也会导致小鼠睾丸组织中自噬的阻断。另外自噬的底物p62在ARMC3-/-睾丸组织的精子延长阶段累积，并且电镜观察到ARMC3-/-小鼠精子自噬体形成缺陷。 图1：A. ARMC3-/-小鼠睾丸蛋白互作验证；B-C. ARMC3-/-小鼠睾丸检测自噬情况；D.在ARMC3-/-小鼠睾丸切片观察自噬底物p6
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