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大规模动物细胞培养技术简介（二）
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
近年来，我国的生物技术飞速发展，细胞培养已经形成规模化，产业化生产，大规模细胞培养可分为分批式、流加式、半连续式、连续式和灌注式、细胞工厂5种技术形式。 连续式培养 连续式培养是一种常见的悬浮培养模式，采用机械搅拌式生物反应器系统。 该模式是将细胞接种于一定体积的培养基后，为了防止衰退期的出现，在细胞达到最大密度之前，以一定速度向生物反应器连续添加新鲜培养基；同时，含有细胞的培养物以相同的速度连续从反应器流出，以保持培养体积的恒定。 理论上讲，该过程可无限延续下去。连续培养的优点是反应器的培养状态可以达到恒定，细胞在稳定状态下生长。稳定状态可有效地延长分批培养中的对数生长期。 在稳定状态下细胞所处的环境条件如营养物质浓度、产物浓度、pH值可保持恒定，细胞浓度以及细胞生长速率可维持不变。细胞很少受到培养环境变化带来的生理影响，特别是生物反应器的主要营养物质葡萄糖和谷氨酰胺维持在一个较低的水平，从而使它们的利用效率提高，有害产物积累有所减少。 然而，在高的稀释率下，虽然死细胞和细胞碎片及时清除，细胞活性高，最终细胞密度得到提高，可是产物却不断在稀释，因而产物浓度并不提高；尤其是细胞和产物不断地稀释，营养物质利用率、细胞增长速率和产物生产速率低下。 连续式培养的不足： 由于是开放式操作，加上培养周期较长，容易造成污染，在长周期的连续培养中，细胞的生长特性以及分泌产物容易变异； 对设备、仪器的控制技术要求较高，多数采用搅拌式生物反应器，也可采用管式反应器。 连续式培养的特点： 细胞维持持续指数增长； 产物体积不断增长； 可控制衰退期与下降期。 灌注式培养 灌注式培养，也称灌流式培养，是连续式培养常见的方式。 灌注式培养是把细胞和培养基一起加入反应器后，在细胞增长和产物形成过程中，不断地将部分条件培养基取出，同时又连续不断地灌注新的培养基。它与半连续式操作的不同之处在于取出
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常见用于悬浮培养的细胞培养基配比方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
培养基是生物细胞进行体外培养的重要营养基质。动物细胞在生物反应器中进行细胞培养时主要采用悬浮培养方式，用于悬浮培养的培养基主要有以下几种： 一、平衡盐溶液：平衡盐溶液简称BSS,它在细胞培养过程中主要为细胞提供微量的无机盐，起调节培养基的PH、维持渗透压平衡等作用。常用来作为洗涤液或配置稀释培养基使用。实验中常用的平衡盐溶液有NaCl溶液，Hanks，Earle’s平衡盐，PBS缓冲液等。 一般情况下，配制细胞消化液或者洗涤细胞时会采用Hanks或PBS，因为这两种溶液中几乎不含钙、镁离子，可以减少细胞的粘附性。在密闭的培养器内进行细胞培养时，多数则采用Hanks’溶液。 几种常用的平衡盐溶液配置方案（g/L） 名称 无Ca2+Mg2+PBS 含Ca2+Mg2+PBS Earle’s Hanks’ D-Hanks’ ＮaCl 8.00 8.00 6.80 8.00 8.00 KCl 0.20 0.20 0.40 0.40 0.40 CaCl2 - - 0.20 0.14 - MgCl26H2O - 0.1 - - - MgSO47H2O - - 0.20 0.20 - Na2HPO4 1.15 1.15 - 0.048 0.048 NaH2PO42H2O - - 0.14 - - KH2PO4 0.20 0.20 - 0.06 0.06 NaHCO3 - - 2.20 0.35 0.35 葡萄糖 - - 1.00 1.00 - 酚红 - 0.01 0.01 0.01 二、动物体液、动物组织提取液这类培养基主要包含血清、淋巴液、水解蛋白等。其中血清和水解乳蛋白是实验中使用较多的培养基添加剂，同时也是细胞培养基中的主要营养成分，常使用的血清主要有胎牛血清和新生牛血清。虽然血清的营养成分较高，但是由于其内部成分较为复杂，容易导致下游产物的分离、纯化工序繁琐。所以市场上逐渐出现合成型培养基，比如MEM、DMEM、PRMI1640等. 三、合成细胞培养基合成细胞培养基是根据血液及细胞组成成分的研究，确定营养配比，将细胞生长所需要的微生物、氨基酸、微量元素及平衡盐溶液等安一定比例配比所研发出的营养组合型培养基。此类培养基广泛适用于培养瓶、摇瓶细胞培养器和生物反应器等实验设备中。常用合成型细胞培养基配方可参考下表： 合成细胞培养基的配比表（mg/L）
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细胞冻存时需要注意的事项和技巧
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
Master Cell Cryopreservation 掌握细胞冻存 做实验的时候为什么要进行细胞冻存呢？ 细胞冻存有哪些好处呢？ 01 节省实验室空间、时间、经费 02 若实验失败，还有重来的机会 03 确保重复实验的一致性 04 确保未来实验的连贯性 但是，经常会有用户反映，细胞冻存与复苏遇到了问题，看来看似简单的一步其实并不简单。 那么如何做好细胞冻存呢？今天跟随我们一起来了解一下细胞冻存时需要注意的事项和技巧吧。 细胞冻存的基本原理 细胞代谢过程需要各种蛋白酶的参与，而这些蛋白酶在环境温度低于-70℃时会集体罢工，低温贮藏的目的是通过超低温使代谢活动近乎停止。细胞因此进入休眠状态，使细胞“不会老”，可以长期保存。 因为冻融过程对所有细胞和组织都是有一定伤害的，因此，需要开发出有效的技术来防止细胞死亡和损伤。 Ultralow storage temperatures suspend all molecular processes and prevents free radical generation that negatively effects cryopreserved cultures(Baust J., 2007; Baust, Corwin, Van Buskirk, & Baust, 2015). 这时，低温保护剂就发挥出它的作用了。 低温保护剂可保护细胞不受细胞内冰冻影响，目前多采用DMSO、甘油、乙二醇和丙二醇等渗透型低温保护剂。它们的作用机制包括：自由进入细胞，取代水，使冰点下降，充当盐的二次溶剂，提高细胞膜对水的通透性。如下图所示： 但是，部分低温保护剂在缓慢冷冻过程中虽然会保护细胞，但它们也会引起细胞毒性，尤其是在室温下。因此，在标准的自制冻存液中，会含有血清，血清是用来降低细胞毒性的，但血清也不是完美的。 那么有无动物源成分替换物吗？ 甲基纤维素已被认为是细胞冷冻保存的保护剂，可作为胎牛血清的合适替代物。 1. 化学成分明确 2. 保护性 甲基纤维素结构图 Mizrahi A, Moore GE, Appl Microbiol. 1970 Jun; 19(6):906-10 Merchant DJ, Hellman KB, Schneider H, Muirhead EE. 尽管大多数研究和医学
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常用的细胞凋亡检测方法【大盘点】
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
细胞凋亡 人体内的细胞注定是要死亡的，有些死亡是生理性的，有些死亡则是病理性的，有关细胞死亡过程的研究，已成为生物学、医学研究的一个热点。已知的细胞死亡方式起码有两种，即细胞坏死与细胞凋亡(apoptosis)。细胞坏死是早已被认识到的一种细胞死亡方式，而细胞凋亡则是逐渐被认识的一种细胞死亡方式。 此图片来源于网络 细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程，这些基因在种属之间非常保守，如Bcl-2家族、caspase家族、癌基因如C-myc、抑癌基因P53等。而凋亡过程的紊乱可能与许多疾病的发生有直接或间接的关系。如肿瘤、自身免疫性疾病等，能够诱发细胞凋亡的因素很多，如射线、药物等。 检测方法 细胞发生凋亡时，不同区域内（如细胞膜、细胞浆、线粒体、细胞核等）会发生不同的生理生化改变。因此，针对不同区域的细胞凋亡检测要采用不同的方法。 1）Annexin V 凋亡检测 原理：Annexin Ⅴ是一种分子量为35-36kD的Ca依赖性磷脂结合蛋白，正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine, PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V作为一种磷脂结合蛋白，与PS有高度亲和力，它通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V是检测细胞早期凋亡的灵敏指标。该方法通常结合流式细胞术一起使用。 2）线粒体膜电位分析（JC-1） JC-1是一种广泛用于检测线粒体膜电位的理想荧光探针。可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位，线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。 原理：在线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体的基质（matrix）中，形成聚合物（J-aggre
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体外培养细胞缺氧模型的方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
人的生存离不开氧气。如果你感觉很长一段时间里整天无精打采、昏昏欲睡，在排除睡眠不足的因素外，那么你有可能是血液中缺氧了。血液除了能在身体内流动，携带能量、废物等，最主要的功能就是携带氧气，这是它的基本功能之一。如果血液缺氧，严重时就会导致器官病变，最常见的就是心梗、脑梗等。近年来，低氧(Hypoxic)于生物机体及细胞的生理作用及其分子机制研究越来越受到医学科研学者的关注。 低氧培养的适用研究领域 近30年来与“低氧诱导”相关的文章统计(此项数据来源于Pubmed数据库) 细胞是生物体结构和功能的基本单位，细胞缺氧是缺血缺氧性疾病发病机制的关键环节，所以建立细胞缺(低)氧模型是从细胞水平及分子水平动态研究该类疾病的重要方法。目前，已经建立了许多细胞缺氧模型，为缺血缺氧性疾病的研究打下了坚实的基础。 下面，介绍一下体外培养细胞缺氧模型的方法。 正常情况下，细胞体外培养需5%CO2与95%空气环境，然而，降低培养环境的氧分压或使细胞用氧障碍可以造成缺氧状态，目前常用的缺氧方法有物理性缺氧法和化学性缺氧法。 物理性缺氧法 通过降低培养环境的氧分压造成细胞缺氧性损伤，类似于体内发生的低张性缺氧。 缺氧培养系统 化学性缺氧法 在培养基中加入化学物质，造成细胞用氧障碍或使培养基内的氧气耗尽，如在培养基内加人cyanide、连二亚硫酸钠等。化学缺氧模型制备简单，但由于添加的物质可能会改变培养基的化学成分，且添加剂本身对细胞有损伤作用，增加了实验的混杂因素，需慎重选用。Cyanide中的氰离子(CN- )可迅速与细胞内氧化型细胞色素氧化酶的三价铁结合形成氰化高铁细胞色素氧化酶，使之不能还原，电子传递中断，造成细胞用氧障碍；Cyanide还阻断线粒体氧化磷酸化，抑制细胞色素C氧化酶，呼吸链中断，引起组织性缺氧。连二亚硫酸钠又称保险粉，为氧结合剂，可在短时间内结合液体培养基内的氧气，造成细胞低张性缺氧。还有用其他化学物质如氧化钴制作缺氧
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细胞死亡机制之铁死亡介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
铁死亡是 2012 年新发现的一种细胞死亡机制，目前已经成为科研领域的研究热点。铁死亡是依赖铁离子及活性氧诱导脂质过氧化导致的调节性细胞坏死，其在形态学、生物学及基因水平上均明显不同于凋亡、坏死、自噬等其他形式的程序性性细胞死亡。铁死亡在形态学上主要表现为细胞线粒体变小，膜密度增高，嵴减少。在铁死亡发生过程中，细胞形态及细胞核形态没有明显变化。 铁死亡机制 铁死亡受细胞内信号通路的严密调控，包括氨基酸代谢，脂质代谢及铁离子代谢等。胱氨酸经胱氨酸运输蛋白 system Xc- 进入细胞后，被用来合成谷胱甘肽。谷胱甘肽是谷胱甘肽过氧化物酶 GPX4 的辅因子，GPX4 是一种抗氧化酶，可以在谷胱甘肽的作用下，中和脂质过氧化物，保护膜的流动性。当 system Xc- 活性被抑制或 GPX4 活性被抑制时，会造成脂质过氧化，并导致活性氧 ROS 的积累，在铁离子的作用下，细胞会发生铁死亡。 目前研究发现，一些其他的信号通路及生命进程也会影响铁死亡的敏感性，如 CoQ10 作为细胞膜上的抗氧化剂，是一种内源性的铁死亡的抑制剂；NADPH 及硒的丰度也会影响铁死亡的敏感性；p53 及 Nrf2 转录因子对铁死亡也有一定的调控作用。 铁死亡与疾病 生命机体的正常生理进程是否有铁死亡的参与还不清楚，但很多疾病均报道与铁死亡有关，包括肿瘤、神经退行性疾病、局部缺血再灌注损伤、肾衰竭等。 研究发现，某些癌细胞对铁死亡相对比较敏感，一些化合物可以通过增加铁富集和 ROS 压力诱导铁死亡的发生，特异性杀死癌细胞。另外铁死亡在肿瘤免疫**中也具有重要的作用，抑制肿瘤细胞的铁死亡通路后，会降低肿瘤细胞对免疫**的敏感性。综上说明，铁死亡在肿瘤**中或可发挥重要作用。 铁死亡作为一种新的细胞死亡方式，其生理功能仍有待进一步研究，铁死亡如何更好的应用到疾病**中，也是目前研究的重点。为方便科研研究，MCE 铁死亡化合物库，主要包含一些常用的铁死亡诱导剂及抑制剂，化合物主要靶向 GPX4，system X
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亚微米光学光热红外技术O-PTIR的优势和具体案例
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
拉曼光谱技术 近年来，拉曼光谱和成像技术, 得益于其相对于红外光谱技术优异的空间分辨率等优势，在研究样品的分子振动方向得到了广泛的应用，尤其是生物样品，因为水中的拉曼光谱背景信号更弱。相干拉曼散射显微技术（Coherent Raman scattering microscopy）近些年也得到了大力的发展，其基于相干反斯托克斯拉曼散射（coherent anti-Stokes Raman scattering）或受激拉曼散射（stimulated Raman scattering），大大改善拉曼的成像速度。例如，蛋白质和脂肪在皮肤内的分布情况，可以通过两者在C-H伸缩振动区特征的拉曼谱带进行视频级的高速成像来获得。 然而拉曼光谱和成像技术也存在着自身的一些不足： （1）较低的拉曼散射截面，尤其是在指纹区，相对于红外技术弱5-10倍； （2）会受到荧光的干扰，由于拉曼信号偏弱，一些样品的荧光信号又宽又强，会一定程度上覆盖拉曼信号； 光学光热红外技术 基于光学-光热红外技术(O-PTIR)的亚微米分辨率红外拉曼同步测量系统mIRage，使用宽可调谐的脉冲红外激光源激发样品，在样品中产生调制光热效应。通过光热效应提取并计算红外吸收, 通过检测反射探头光束强度的变化作为红外波数调谐的函数，从而提供红外吸收光谱。这种短波长脉冲探测光束(通常是532 nm)决定了红外测试空间分辨率，而不是传统FTIR/QCL显微镜中依赖的红外波长。由于其独特的系统架构，短波长探测光束同样也能作为一个拉曼激光源，当集成拉曼光谱仪，mIRage系统可以提供同一地点，同一时间，同一空间分辨率的亚微米红外+拉曼显微镜的检测结果。 mIRage光谱的显著优势： 1. 和拉曼光谱一致的亚微米空间分辨率，比传统FTIR/QCL显微镜提高30倍，达到500 nm； 2. 非接触式测量，非破坏性，反射(远场)模式测量，无须复杂的样品制备； 3. 高质量光谱(测试可兼容粒子形状/尺寸和表面粗糙度)，没有色散/散射伪影问题； 4. 可直接在商业数据库中匹配搜索 5. 可实现红外和拉曼光谱成像同步测量 单
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对禾谷镰刀菌枯萎病复合体弱致病成员作用的新见解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
对镰刀菌枯萎病复合体弱致病成员作用的新见解 植物病害通常是由一组病原体相互竞争以在感染生态位中站稳脚跟引起的。然而之前的研究通常仅限于其宿主上的单一病原体。在欧洲小麦赤霉病 (FHB) 是由多种镰刀菌属物种引起的，包括禾谷镰刀菌和梨孢镰刀菌。本文结合接种的时间序列，通过多光谱成像、转录和真菌毒素分析进行监测，以研究物种和小麦之间的时间相互作用。结果表明，与禾谷镰刀菌单次接种相比，禾谷镰刀菌和梨孢镰刀菌的共接种抑制了症状的发展，但没有改变真菌毒素的积累。相比之下，梨孢镰刀菌的预接种减少了 FHB 症状和霉菌毒素与单一禾谷镰刀菌感染相比的水平。有趣的是，梨孢镰刀菌在双重感染中表现出增加的增长，表明这种弱病原体利用了它与禾谷镰刀菌的共存。定量逆转录 PCR 显示梨孢镰刀菌诱导小麦中的LOX和ICS基因表达。我们假设梨孢镰刀菌对水杨酸和茉莉酸相关防御的早期诱导阻碍了随后的禾谷镰刀菌感染。这项研究首次报道了植物的防御机制，涉及两种疾病复合体与其宿主之间的三方相互作用。 图1.田间样品中同一小穗上单独存在或与其他镰刀菌种组合存在的梨孢镰刀菌 通过分析散布在比利时佛兰德斯七个地点17 年的调查数据，本文评估了梨孢镰刀菌和禾谷镰刀菌的共存情况。总共评估了 7000 多个小麦穗和 40 多个栽培品种是否存在 FHB 成员。该分析表明只存在梨孢镰刀菌症状的仅有30.0%的案例，梨孢镰刀菌伴有禾谷镰刀菌的案例占比31.2%，伴有禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌的梨孢镰刀菌案例占比15.4%(图1a,b)。 这项多年的多地点分析表明，在田间条件下禾谷镰刀菌、黄色镰刀菌的梨孢镰刀菌的显著共存。由于燕麦镰刀菌的发生率较低，没有进一步关注与该物种的相互作用。 图2. 梨孢镰刀菌2,516在离体叶片试验中对禾谷镰刀菌PH-1感染的影响 梨孢镰刀菌预接种的FV/FM值显著高于单一禾谷镰刀菌接种（图 2a、b）。此外，缺乏症状与校正的(c) GFP信号降低一致，反映了禾谷镰刀菌的存在减少（图
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不同细胞策略决定拟南芥天然种质对轻度干旱的敏感性研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
不同的细胞策略决定了10种拟南芥天然种质对轻度干旱的敏感性 拟南芥种质的全球分布施加了不同类型的进化压力，这有助于这些种质对环境胁迫的各种反应。干旱胁迫反应已经得到很好的研究，特别是在哥伦比亚的一种常见拟南芥种质。然而，对干旱胁迫的反应是复杂的，我们对这些反应中哪些有助于植物对轻度干旱的耐受性的理解是非常有限。本文研究了自然种质在早期叶片发育过程中在生理和分子水平上对轻度干旱的反应机制。记录了自然种质之间轻度耐旱性的差异，并使用干旱敏感种质ICE163和耐旱种质Yeg-1的转录组测序来深入了解这种耐受性的潜在机制。这表明ICE163优先诱导茉莉酸和花青素相关途径，这有利于生物胁迫防御，而Yeg-1更明显地激活脱落酸信号，即经典的非生物胁迫反应。还研究了相关的生理特征，包括脯氨酸、花青素和ROS的含量、气孔关闭和细胞叶参数，并将其与转录反应相关联。结论是这些过程中的大多数构成了一般干旱响应机制，在耐旱和敏感的种质中受到类似的调控。然而，在轻度干旱下关闭气孔和维持细胞扩张的能力似乎是在轻度干旱下促进叶片更好生长的主要因素。 图1.不同拟南芥种质在轻度干旱下表现出不同的叶片生长减少 为了探索拟南芥的遗传多样性如何影响对轻度干旱胁迫的反应，我们在自动称重、成像和浇水机（WIWAM）上筛选了来自不同来源的15份自然材料（图1A）。当第三片真叶（L3）开始出现时，在层积（DAS）后6天开始对一半植株进行轻度干旱（MD）处理。另一半的植物保持在充分浇水（WW）的条件下作为对照。在22 DAS收获植株，并测量成熟L3的面积。在WW条件下，各材料的平均叶面积（LA）已经有所不同（图1），但除EY15-2外，所有材料在MD条件下的LA相对显著减少（图1B）。值得注意的是，LA的减少程度因加入量的不同而有很大差异，从14%到61%不等（图1B，补充表S2）。在WW条件下，对MD的敏感性并不取决于叶片的大小，因为WW条件下的LA与MD的相对减少之间没有相关性。我们鉴定了干旱敏感材料
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后PD-1时代联合**的9个策略
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
1. 联合化疗 化疗诱导的癌细胞死亡，促进肿瘤抗原的释放和抗原的呈递，激活免疫效应细胞。 肿瘤缩小不仅可能给免疫**更多的工作时间，而且还可以降低耐药克隆产生的可能性。 *延申阅读：免疫原性细胞死亡（immunogenic cell death，ICD） 成功案例 免疫检查点抑制剂联合标准化疗已成功用于非小细胞肺癌（KEYNOTE-189，IMpower130）、小细胞肺癌（KEYNOTE-407，IMpower133）和三阴性乳腺癌（KEYNOTE-355，IMpassion13）。 联合ADC药物也在探索中... 在原位HER2阳性模型中，T细胞清除降低了T-DM1**小鼠的总生存率，这表明免疫反应对T-DM1的疗效很重要。虽然联合使用PD-1和CTLA-4抗体在该模型中无效，但它们与T-DM1的联合使用却非常有效。基于这些数据，一些ADC正在探索结合免疫**。 2. 联合靶向** 过去五年中，PD-1/PD-L1抗体和靶向**进行了多种联合**的尝试。 一个基本的目标是，联合用药应该比连续给药更有效，但是需要考虑到联合用药通常比单一疗法会导致更多的副作用。 成功案例 肾细胞癌 pembrolizumab联合axitinib(VEGF受体酪氨酸激酶抑制剂、辉瑞)**肾细胞癌（KEYNOTE-426） axitinib与avelumab(Bavencio，阿维鲁单抗,辉瑞默克）联合用于**晚期肾细胞癌（JAVELIN Renal 101） 两种联合**都比sunitinib更有效，这导致了监管机构的批准。 axitinib是高选择性的VEGF抑制剂，获得了成功。但是低选择性的sunitinib、 pazopanib，联用会引起巨大的毒性。 黑色素瘤 在黑色素瘤**研究中，人们对将已批准的靶向药物如BRAF抑制剂dabrafenib和MEK抑制剂trametinib，或BRAF抑制剂vemurafenib和MEK抑制剂cobimetinib与抗PD-1和抗PD-L1**相结合有相当大的兴趣。 2020年6月，IMspire150试验报道，与vemurafenib和cobimetinib相比，vemurafenib、cobimetinib和atezolizumab联合使用显著延长了中位PFS（15·1个月对10·6个月)，反应持续时间增加(21.0个月对12·6个月）。 不成功的案例 值得注意的是，一项3期研究表
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单细胞转录组技术构建肝细胞癌的免疫抑制谱
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
人肝细胞癌是一种高死亡率的原发性肝癌，也是全球范围最常见的恶性肿瘤之一。遗传、表观遗传改变和病毒感染是肝癌的主要诱发因素。由于复发和转移率高，肝细胞癌的死亡率较高。为了研究人肝细胞癌的免疫抑制机制，本文作者使用单细胞转录组测序技术，分析细胞间相互作用，剖析肿瘤的细胞异质性。 文章详情 文章题目：Single-cell RNA sequencing shows the immunosuppressive landscape and tumor heterogeneity of HBV-associated hepatocellular carcinoma. 中文题目：单细胞转录组揭示HBV相关肝细胞癌的免疫抑制谱和肿瘤异质性 发表时间：2021.06 期刊名称：Nature Communications 影响因子：14.911 实验平台：10x Genomics Chromium scRNA-seq DOI：10.1038/s41467-021-24010-1 研究背景 人肝细胞癌（HCC）由复杂的肿瘤微环境 (TME) 组成，由细胞（肿瘤浸润免疫细胞和基质细胞）、化学成分（趋化因子）和物理成分（细胞外基质）组成。这些相互作用以支持 HCC 的发展并影响**反应。对HCC的传统研究主要针对大块肿瘤组织，缺少TME中单个细胞的精确信息，而单细胞测序则成为研究癌症的重要平台。关于HCC，使用单细胞测序研究的案例还很少，而且这些案例在揭示整体多方面状态和交互作用方面存在限制性。研究者近期对源自患者的HCC肿瘤异种抑制模型进行研究，确定了与干细胞相关的肿瘤细胞亚群。由于该模型的免疫受损背景和非人类物种的限制，本文对一组乙型肝炎病毒（HBV）相关的HCC临床样品进行单细胞转录组研究，从而更好的概括人HCC中实际发生的生物学过程。 研究内容 // HBV相关的HCC患者的单细胞转录组图谱 研究者对8个人HCC患者的肿瘤组织解离并分选去除死细胞，随后进行单细胞转录组测序获得了34个细胞亚群。结果表明，恶性细胞与非恶性细胞聚集成不同的细胞亚群，来自不同病例的恶性细胞（肿瘤细胞）分布在不同的细胞簇中，而来自多个病例的非恶性细胞聚集在一起，说明肿瘤间异质性水平相
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Vero细胞的微载体生物反应器接种培养实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
Vero细胞近年来作为新时代制药产业的热门细胞，成为转基因、蛋白、抗体类制药企业普遍使用使用的载体工具。使用细胞生物反应器进行Vero细胞的规模化增殖的接种工艺如下： 一、实验前准备： 细胞∶Vero 细胞（ATCC级别的 ）、DMEM培养基(Hyclone)、新生牛血清、抗生素、除菌滤膜、CT-3微载体、2L实验室生物反应器，5L搏旅细胞培养生物反应器、摇瓶、细胞培养瓶、水浴锅。 二、接种实验方法 1.微载体的预处理和灭菌： 接种实验前的微载体需要用无钙、镁离子的PBS磷酸盐缓冲液进行吸胀、洗涤，之后进行高压灭菌处理，工艺控制参数为：吸胀质量浓度不超过50 g·L-1，灭菌温度121 ℃，20 min。 2.转瓶接种操作： 将培养瓶内的 Vero 细胞接种于500ML的转瓶内，CT-3 微载体浓度为 3g/L，并加入适量的混合牛血清的DMEM培养基，此时接种密度以2.0×10°cells/mL为宜。 在微载体细胞生长过程中，可适当补加微载体 2g/L，使微载体浓度达到 5g/L即可接种在5L细胞培养生物反应器中作为种子细胞进行培养。 3.规模扩培接种操作 当细胞生长到达指定密度时，将细胞及新的微载体一起转入大容积的微载体培养养反应器中，进行细胞培养。此过程的工艺参数为：温控： 37士0.1℃，溶解氧为 50%空气饱和度，搅拌器的转速维持在20～32 r/min即可。当细胞密度达 1.1×10'cells/mL时，即可进入下游环节进行产品生产。 介于国外生物反应器成本高昂，售后服务不便，型号固定、货期长等因素，我国自主研发设备生产的生物反应器目前已广泛应用于制药生产、新药开发、蛋白研发、转基因产品等环节，一些国内生物反应器专业生产商甚至可根据客户要求的尺寸进行定制化操作,比如搏旅除生产固定型号规格外，还可以根据客户要求定制不同级别、规格的生物反应器、发酵罐主要用于微生物培养、种子制备、浮细胞培养、贴壁细胞培养、微载体培养等，实现了厂商直供，一罐多用，满足不同的用户需求。
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中度干旱胁迫下生长反应随时间变化的拟南芥全基因关联图谱
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
Genome-wide association mapping of time-dependent growth responses to moderate drought stress in Arabidopsis 中度干旱胁迫下生长反应随时间变化的拟南芥的全基因关联图谱 大面积的可耕地经常面临不规则降雨，导致部分生长季节的可用水量有限，这就需要对植物的耐旱性进行研究。在324份拟南芥自然材料中，观察了中度干旱胁迫下生物量积累的自然变异。干旱胁迫下的改良表现与早花和缺乏春化需求相关，表明开花时间和干旱反应的调控网络重叠，或这些性状对自然选择的相关反应。此外，植株大小与相对含水量（RWC）呈负相关，与绝对含水量（WC）无关，表明可溶性化合物的作用显著。控制和干旱条件下的生长随时间而确定，并通过指数函数建模。通过对植物大小时间数据和模型参数的全基因组关联（GWA）作图，检测到六个与干旱密切相关的时间依赖性数量性状位点（QTL）。如果在单个时间点确定植株大小，大多数QTL将无法识别。对早期报道的干旱时基因表达变化的分析使我们能够确定每个QTL最可能的候选基因。 图1. 莲座鲜重（FW）（a）、相对含水量（RWC）（b）和指数模型参数的频率分布 中度干旱胁迫下的生长减少导致实验期间对照植物和干旱处理植物之间的植物大小差异增加。在干旱处理开始两天后（第16 天），与对照相比，干旱导致的生长减少导致植株明显变小。最后，在中等干旱胁迫下生物量平均减少 35%。然而，在对照和干旱条件下的种质中观察到植物大小的很大差异（图 1a）。这些差异在很大程度上是由基因型决定的，因为在两种条件下，花环的PLA和FW都具有中等至高度的遗传力。 为了研究干旱条件下植物性能的自然变化是否与植物水分状况有关，在第24天测定每株植物最大叶片的RWC和WC。这两个参数代表水分状况的不同方面。 WC表示叶子中水的实际百分比，低 WC 表示叶子开始枯萎，代谢过程停止，从而阻止进一步的生长。另一方面，RWC 将实际 WC 与完全再水化叶子的 WC 进行比较。含有较少水或较多可溶性
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通过拟南芥和玉米转基因品系的功能分析研究干旱胁迫与生长参数的关系
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
保守的聚（ADP-核糖基）化(PAR)途径由三个遗传成分组成，它们是调节植物在胁迫下的能量稳态的潜在目标，目的是提高作物的产量稳定性并帮助确保粮食供应。我们通过在拟南芥和玉米 (Zea mays) 中使用转基因方法研究了PAR途径组分ADP-核糖/NADH 焦磷酸水解酶 (AtNUDX7) 在产量和轻度干旱胁迫中的作用。拟南芥AtNUDX7 cDNA分别通过花椰菜花叶病毒35S启动子和强启动子Brachypodium distachyon pBdEF1a在拟南芥和玉米中过表达。AtNUDX7在拟南芥中的过度表达改善了通过一种新的自动化方法测量的种子参数，加速了开花并降低了花序高度。这种有益特性的组合表明，拟南芥中的 AtNUDX7 过表达可能会通过在聚（ADP-核糖基）化能量稳态途径中提供 ATP 源来增强 ADP-核糖再循环步骤并维持能量水平。在自动化平台上分析了 AtNUDX7 基因高、中和低过表达水平的拟南芥和玉米品系，并在轻度干旱胁迫条件下确定了几个生长参数的抑制作用。数据显示，拟南芥AtNUDX7基因在拟南芥和玉米中不同水平的组成性过表达并没有提高对轻度干旱胁迫的耐受性，但下调AtNUDX7的表达确实提高了耐性，但在正常条件下以牺牲一般生长为代价。 AtNUDX7 基因 (AT4G12720) 的全长 cDNA 在组成型花椰菜花叶病毒35S启动子控制下使用植物网关表达载体pK2GW7在拟南芥哥伦比亚 (Col-0) 种质中过表达，其携带新霉素磷酸转移酶 II (nptII) 选择标记基因（图1A）。花浸转化后，在含卡那霉素的培养基上以高密度平板选择 T0 转基因拟南芥植物，随后鉴定出具有单基因座纯合 T-DNA 插入的 T3 品系。p35S::AtNUDX7 系和 Col-0 对照植物的两周大T3幼苗用于定量 (q) PCR 表达分析。与 Col-0 对照相比，在 10 个独立的转基因 p35S::AtNUDX7 系中观察到 AtNUDX7 的高、中和低过表达水平，范围在 2 倍到 50 倍之间（图1B）。我们将其命名为 Atnudx7-1 (SALK-046441) 的功能丧失突变株系，在 Col-0 背景中在 AtNUDX7 基因的外显子 1 中插入了 T-DNA，验证了其 T-DNA 插入位置，
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通过拟南芥的自然变异揭示其性状结构以研究叶片生长对轻度干旱的反应
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
水分供应减少会对植物生长和作物产量产生负面影响。然而，对于在非致死性干旱条件下如何调节生长缺乏明确的理解。基因组学、表型组学和转录组学的最新进展允许深入分析自然变异。在这项研究中，我们在世界范围内收集的拟南芥材料中对轻度干旱的叶片生长反应进行了详细筛选。通过对不同的叶片生长表型进行全基因组关联作图和对发育中的幼叶转录组进行表征，研究了轻度干旱条件下生长反应的遗传结构。虽然没有发现与轻度干旱中的生长相关的主要效应位点，但转录组分析进一步深入了解了特定组织中对轻度干旱的转录反应的自然变异。共表达分析表明，在不同的遗传背景下，存在共同变化的基因簇，其中包括在渗透胁迫的生长反应中具有重要调节功能的基因簇。研究发现，基于283个基因的表达谱，可以高精度地推断出不同材料叶片中轻度干旱胁迫反应的发生。对表达数据的全基因组关联研究表明，在对环境干扰的转录反应中，反式调节似乎比顺式调节更重要。 图1.98个拟南芥种质中叶片生长相关表型的分布 使用自动表型分析平台WIWAMxy，通过测量预计的莲座面积 (PRA) 来确定总体生长反应。通过具体量化第三片出现的叶子的不同生长相关表型，可以获得关于生长反应的更详细视图（图1）。成熟时，在对照条件下莲座和第三叶面积在最小和最大种质之间显示出几乎4倍的差异（图1A和1B）。由轻度干旱胁迫引起的叶片和莲座面积的减少在不同种质之间存在很大差异（图1A 和1B）。成熟时的莲座和第三叶面积在对照和轻度干旱条件中相关性良好。平均而言在轻度干旱下种植的植物的莲座面积比在对照条件下种植的小62%；第三叶面积的平均减少量相似。轻度干旱胁迫下的相对减少与对照条件下的相应大小的相关性对于莲座面积不显著，但对于第三叶面积显著。这表明大型植物不一定对轻度干旱胁迫更敏感。一般来说，在控制条件下较大的材料在轻度干旱胁迫下仍然较大。花环面积之间的显著正相关表明了这一点和在对照和轻度干旱胁迫条件下成熟时第三叶面
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