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光纤记录实验原理及实验步骤详细记录
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
一、光纤记录工作原理 人类的大脑拥有约900亿个神经元，神经元之间通过突触相互连接形成了复杂的神经网络，并由此产生各种复杂的功能。大脑能够合成和释放上百种神经递质，神经信号通过突触释放的神经递质从而在神经元之间进行传递（图1）。 图1 当神经兴奋传导到突触末端时，会刺激突触上钙离子通道打开促使钙离子大量内流，胞内钙离子浓度瞬时上升，驱动突触小泡将神经递质释放到突触间隙中，释放出的神经递质随即与突触后膜上的受体结合，将递质信号传递给下一个神经元，从而进行信息的逐级传递（图2）。这些神经元以复杂的通路投射到多个脑区，产生了学习认知、情感、控制、动机、奖励等丰富的功能。光纤记录系统则可以通过检测钙离子和神经递质的荧光变化程度来表征群体神经元的活动情况。 图2 那么光纤记录是如何检测神经活动的呢？ 以钙离子荧光信号检测为例，光纤记录系统的技术原理是借助钙离子浓度变化与神经元活动之间的严格对应关系，利用特殊的荧光染料或者蛋白质荧光探针，将神经元中钙离子的浓度通过荧光强度表现出来，并被光纤记录系统捕捉，从而达到检测神经元活动的目的。 在神经系统中，静息状态时神经元胞内钙离子浓度为50-100nM，而在神经元兴奋时胞内钙离子浓度能上升10-100倍，因此我们可以通过注射钙离子基因编码指示剂（Calcium indicator，如GCaMPs、RCaMPs等）来标记钙离子。钙离子指示剂带有荧光蛋白（如GFP、RFP等）及其变异体的蛋白质，可与钙调蛋白（CaM）和肌球蛋白轻链激酶M13域结合（图3左）。当神经活动增强时钙离子通道打开，大量钙离子内流并与CaM结合，导致M13和CaM结构域相互作用，引发cpEGFP结构重排，从而增强绿色荧光信号（图3 右）。 因此我们可以通过检测钙信号的变化来表征神经元的活动，进而研究神经元活动与动物行为的相关性，探究复杂行为背后的调控机制。 图3 (Marisela Morales, et al. Neuron, 2020) 图4：VTA-VGluT2神经元编码先天逃避反应
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小鼠繁育过程中无法生育繁殖的原因及繁育建议
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
在春意萌动的二月份，爱情一直是人类永恒不变的话题。春暖花开之际同样也是动物的繁殖季节，那么今天的《小鼠铲屎官养成记》，我们就来聊一聊小鼠不生有哪些原因？ 生不出来--空有一颗想生的心 周龄：一般小鼠最适配种周龄6-8周。一般不超过3月龄。通常认为超过3月龄配种，会影响繁育能力。 生殖系统问题：例如雌鼠双阴道（一般可以考虑淘汰，如果一定要用，小剪刀剪一下）（见图1）、阴道闭锁（直接淘汰）（见图2）。 图1. 雌鼠阴道隔(双阴道)（图源：赛业生物） 图2. 雌鼠阴道闭锁（图源：赛业生物） 遗传（胚胎致死性）：胚胎发育到一定阶段后死亡。这点在基因工程小鼠上要特别注意。当繁殖数据特别差的时候，可以去查文献，相关基因有没有胚胎致死性。 营养状况：肥胖和低体重的雌鼠，都不能有效哺乳幼仔。肥胖雄鼠不能进行正常的爬跨和交配，精子质量不好。 病原体因素：当小鼠感染某些病原体时，也会影响到繁育性能。例如肺支原体感染也可能影响繁殖，例如不育，新生小仔体重轻，胎溶，幼仔或胎儿死亡。 配繁调整：如果繁殖对配种3周时，雌鼠未怀孕，要及时调整繁殖对。如果调整之后，雌鼠还没怀孕，淘汰雌鼠。 雄鼠有问题：生殖器异常（很大概率会影响繁育）（见图3），雄鼠因身体原因无法完成交配行为（例如关节炎病变，导致雄鼠没有能力交配）。 图3. 雄鼠生殖器被咬伤（图源：赛业生物） 已生育但未成活--生了又好像没生 母性差：生仔后，母鼠不护理幼仔，导致幼仔出生后死亡。这种情况，通常是由于母鼠母性比较差，可以考虑淘汰。 弱胎：出生时就已经死亡，或出生后幼仔死亡。有时可见胚胎没有完全发育好。 食仔：小鼠对于活力不强或患病幼仔，有食仔特性。食仔现象可以严重到在笼盒内找不到残余的幼仔尸体（我见过最严重的，只剩下一小节尾巴，几个小爪子）。如果小鼠配种时周龄偏小，自身营养状况不良，也会主动食仔。 环境因素--天不遂鼠愿 季节交替：深秋和冬天常常表现出季
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心肌损伤罪魁-外泌体IR引起心脏EVs改变的过程详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
外泌体是由活细胞分泌的直径约为30-150nm的小囊泡，具有典型的脂质双分子层结构。近年来，越来越多的证据显示外泌体可以作为细胞间信息传递的媒介发挥作用。云序客户同济大学东方医院的周晓慧、范慧敏团队在Journal of Extracellular Vesicles杂志上发表的“Myocardial ischemia-reperfusion induced cardiac extracellular vesicles harbour proinflammatory features and aggravate heart injury”文章，通过云序生物提供的外泌体miRNA测序，揭示了缺血再灌注（IR）中存在的IR-EVs-miR-155-5p-M1型极化轴，可导致局部和全身炎症，并提出GW4869抑制EVs可能是一种有前途的IR损伤**策略。 发表期刊：Journal of Extracellular Vesicles 发表时间：2021年2月23日 样本类型：小鼠缺血—再灌注（IR）心脏外泌体 研究方法：外泌体miRNA测序、RT-qPCR 文章链接：Myocardial ischemia-reperfusion induced cardiac extracellular vesicles harbour proinflammatory features and aggravate heart injury 研究思路 研究背景 急性心肌梗死是一个发病率和死亡率较高的全球性问题。快速恢复冠状动脉血流是减少心肌梗死和改善心功能的最有效策略。然而，再灌注会导致不可逆的心肌损伤，被称为心肌缺血-再灌注（IR）损伤。目前，IR损伤的机制尚不明确，仍缺乏有效的**方法。炎症是维持体内平衡的基本生物学过程，但过度的炎症反应会导致组织损伤。巨噬细胞是心肌梗死触发的炎症级联反应的重要效应因子和调节因子，其中M1型巨噬细胞是促炎类型，在促炎细胞细胞因子的吞噬和分泌中起重要作用。细胞外囊泡（EVs）是一种具有双层脂膜的细胞来源的纳米级囊泡，越来越多的证据证实了EVs作为细胞间通信载体的重要作用。最近的研究揭示了EVs在炎症调节中的功能，并证实了EVs通过调节巨噬细胞的极化参与各种疾病的发展，然而IR诱导的EVs作用仍然有待披露。大量研究表明非编码RNA在心血管疾病中发挥重要作用，特别是miRNA。心脏IR-EVs
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超全鞘内给药置管方法的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
鞘内给药通过将药物直接注入脑脊液，绕过血脑屏障进入中枢神经系统，是研究脊髓水平药物作用机制的常用给药方式，广泛用于损伤、疼痛、中枢神经系统疾病以及癌症**等研究领域。通过鞘内置管，可以使药物根据需求有选择性地注入脊髓，如接入缓释泵进行持续输注（参考文章缓释泵使用小贴士），或者注射器等多次注射。常用的鞘内给药置管方法包括经延髓池(cisterna magna)鞘内置管和腰椎脊髓鞘内置管。 一、小脑延髓池置管 1、实验仪器耗材 脑立体定位仪、体视手术显微镜、吸入式麻醉机、加热垫、手术器械、缝合线、70%酒精、组织粘合剂、32G鞘内PU导管（带结节用于锚定组织）等。 2、实验步骤 麻醉 小鼠置于诱导盒内给予4%的异氟烷麻醉。 确认老鼠在失去反应能力后，用电动剃须刀将动物颈部到头部的的皮肤脱毛。 将耳杆正确插入小鼠耳道进行定位仪固定，嘴部置于口部麻醉面罩上以持续麻醉(2%异氟烷)，加热垫(37℃)维持体温。 70%乙醇擦拭剃毛部位皮肤进行消毒，可涂抹眼药膏保护小鼠眼睛。 暴露寰枕膜 用手术刀沿颈部中线（枕骨嵴处）做一个2-3厘米长的纵向皮肤切口。 继续沿皮肤切口向下切开枕骨上方肌肉，用手术挂钩将肌肉从枕骨拉至两侧固定，暴露寰枕膜。 显微镜视野下用剪刀小心地在寰枕膜开一个缝，暴露脑干。此时脑脊液会从由此切口渗出。注意寰枕膜切口要尽可能浅，避免损伤脑干。 寰枕膜解剖图[1] 置管 移动定位仪面罩，调整小鼠头部，使头部朝下与身体成90度角。 将导管修剪到所需长度，显微镜视野下轻轻将导管插入延髓池。保持导管角度与脑干的背侧表面平行，向尾部方向缓慢推进到脊柱内所需位置。 采用组织粘合剂将导管结节固定在颅骨上，取出手术挂钩缝合两边肌肉进一步稳固结节，确保鞘内导管长期稳定。 小脑延髓池（cisterna magna）置管[1] 可选操作：缓释泵鞘内给药 选择缓释泵鞘内给药方式需预先进行缓释泵灌充、鞘内导管连接、泵体孵育等准备操作参考（参考文章缓
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荧光显微镜在AML创新疗法中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
急性髓性白血病 (AML) 是一种起始于骨髓的血液系统恶性肿瘤，也是成年人中常见的急性白血病。鉴于这种疾病的预后普遍较差，5 年生存率仅为 27.4%，因此迫切需要创新疗法来**AML。CD19 嵌合抗原受体 (CAR) T 细胞疗法已经在B细胞恶性肿瘤中显示出令人印象深刻的临床**活性，国内的CAR T**产品也于近日正式获批。CAR-T 细胞同样被认为是** AML 的一种具潜力的免疫学**方法。在过去的几年里，该领域取得了一系列进展， 然而，在急性髓系白血病患者中尚未取得类似的疗效。目前已有的临床试验显示，CAR-T细胞未能有效根除患者骨髓中的AML细胞，患者的**效果与骨髓中的浸润的CAR-T细胞呈相关性。 近日，中国科学技术大学生命科学与医学部魏海明教授课题组在揭示CAR-T**AML疗效不佳的潜在原因上取得重要进展，相关研究于10月7日正式以“Rapamycin pretreatment rescues the bone marrow AML cell elimination capacity of CAR-T cells”为题发表在Clinical Cancer Research，该研究揭示了CAR-T细胞**AML疗效不佳的潜在原因之一，并展示了一种简单的预处理方法---雷帕霉素预处理，即可有效增强CAR T清除骨髓AML细胞的能力。 研究人员使用明美倒置荧光显微镜MF50和明美成像分析软件构建了显微成像分析系统，通过免疫组织化学 (IHC) 染色观察靶向EpCAM的CAR-T在不同情况下对AML细胞的清除效果，发现雷帕霉素预处理能有效提升**效果。 倒置荧光显微镜 MF52-N （MF50升级款，效果更优） 应用范围：细胞组织，透明液态组织 观察方式：荧光、明场、相差 标准配置物镜：4X、10X、10XPH、20XPH、40X 内置式0.75X接口，可兼容1.2英寸以下所有相机类型 常搭配相机：MSX2、MS23、MS60、MS23-H 倒置荧光显微镜 MF52-N是本研究使用的MF50的升级版，光路设计经过改进，成像质量更高，外观经过升级更加紧凑，荧光模块也经过数显升级，给更准确地记录使用的荧光通道和光强。 科研级
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三代全长16S/18S/ITS扩增子测序的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
三代微生物多样性是基于PacBio SequelⅡ测序平台，利用单分子实时测序的方法，对原核生物16S的全部V1-V9可变区域或真核生物的18S高变区域或ITS区域进行全长扩增，不仅能提高物种鉴定的分辨率，还能提高样本中微生物组成鉴定的精确度，从而更全面的反应微生物的群落结构。 一、PacBio测序原理 利用与二代测序相同的边合成边测序的原理，以SMRT芯片为载体；模板与特殊聚合酶结合后，4种不同荧光标记的脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）通过布朗运动随机进入检测区与聚合酶结合，按DNA模板序列延伸；通过检测单个DNA分子的合成所产生的信号来进行测序，也可通过检测相邻两个碱基的测序时间，来检测一些碱基修饰情况。 图1. PacBio测序原理[1] 二、产品优势 于二代测序只能获取1~2个高变区短读长序列而言，三代测序能一次性测到所有高变区，同时也可以避免不同引物带来的偏好性，从而提高微生物群落的分类学分辨率。 1.更长读长，更高准确率[2] 图2. 测序长度和准确度 2.更高的物种鉴定分辨率和精确度[3] 图3. 物种鉴定结果 3.更准确的还原微生物群落[4] 图4. 微生物群落分布 三、技术路线 图5. 技术流程图 四、案例分享 文章标题：三代全长微生物多样性研究母婴微生物群[5] 研究小结：早期微生物与成年后疾病的发生发展有一定的关系，研究发现子宫、胎便、羊水和胎盘都有微生物存在，那么婴儿胎便微生物来源与母体不同来源的样本的关系如何呢？本文以39对母婴的产妇样本（羊水、粪便、阴道分泌物和唾液）和婴儿胎便样品为研究对象，基于PacBio三代全长测序技术进行16S rRNA检测。检测发现不同类型样本间α多样性和β多样性存在特异性；同时除发现不同类型样本各自的一些优势菌（其中羊水和阴道分泌物的优势菌为Lactobacillus和Curvibacter，胎便的优势菌为Bacillus 和Escherichia/Shigella，产妇粪便的优势菌为Bacteroides和Faecalibacterium，产妇唾液的优势菌为Streptococcus和Prevotella）外，还发现了他们间共
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细胞复苏技术知识分享
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
各位老师在进行细胞培养时，肯定会遇到以下问题： ● 细胞越长越多 ● 买的细胞比较贵重 ● 节假日无法照看细胞 ● 实验不顺畅需要重新进行实验 这时，我们就需要适当的保存一些细胞，也就是冻存细胞。 细胞冻存是细胞保存的主要方法之一。 利用冻存技术将细胞置于-196℃液氮中低温保存，可以使细胞暂时脱离生长状态而将其细胞特性保存起来，这样在需要的时候再复苏细胞用于实验。而且适度地保存一定量的细胞，可以防止因正在培养的细胞被污染或其他意外事件而使细胞丢种，起到了细胞保种的作用。 在不加任何保护剂的条件下直接冻存细胞时，细胞内和外环境中的水都会形成冰晶，能导致细胞内发生机械损伤、电解质升高、渗透压改变、脱水、pH改变、蛋白变性等，能引起细胞死亡。 如向培养液加入保护剂，可使冰点降低。在缓慢的冻结条件下，能使细胞内水份在冻结前透出细胞。贮存在－130℃以下的低温中能减少冰晶的形成。细胞复苏时速度要快，使之迅速通过细胞最易受损的－5～0℃，细胞仍能生长，活力受损不大。目前常用的保护剂为二甲亚砜（DMSO）和甘油，它们对细胞无毒性，分子量小，溶解度大，易穿透细胞。 放假前我们已经教过大家如何进行细胞冻存，让大家安心过个好年，那么接下来 您的细胞准备好“开工”了吗？ 细胞冻存复苏遵循的原则是：慢冻快融慢冻大家可参考之前的文章： 知识分享 | 您的细胞准备好休眠了吗？ 今天我们来聊聊，细胞复苏时需要注意的那些事儿。细胞复苏的原则：快速融化必须将冻存在-196℃液氮中的细胞快速融化至37℃，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细胞形成再结晶，对细胞造成损害。 01、实验前准备 1. 将水浴锅提前预热至37℃ 2. 细胞实验室进行常规消毒，用75％酒精擦拭紫外线照射40min的超净工作台台面，保证无菌。 3. 在超净工作台中按次序摆放好消过毒的离心管、吸管、培养瓶等即将使用的耗材及试剂。 0
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间充质干细胞（MSC）成软骨诱导分化的操作讲解
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
在大多数干细胞实验研究中，诱导分化成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞已经成为鉴定其分化潜能的金标准。 前面我们已经分享了成骨诱导分化、成脂诱导分化的操作，本期来到三系分化的最后一站——成软骨诱导分化操作讲解！ 成软骨诱导分化 软骨的破坏、缺失是骨关节炎（Osteoarthritis，OA）在内的多种骨科疾病的重要病理改变。由于软骨特殊的解剖及组织特性，如缺乏血管和淋巴管的分布，使得其自我修复能力异常不足，因此通过人工方法修复软骨破坏具有重要临床意义。 近年来，随着间充质干细胞（MSC）的发现和研究深入，其来源广泛、良好的增殖能力、多分化潜能、与各种3D支架材料具有良好的生物相容性等优良特性，使得其在软骨修复应用中具有令人期待的应用潜力。 MSC成软骨分化的过程： MSC首先收回其突起，聚集成团，这个团中间的细胞经分裂分化转变成一种大而圆的细胞，即成软骨细胞；成软骨细胞产生基质和纤维（主要为II型胶原蛋白），当基质的量增加到一定程度时，成软骨细胞被分隔在陷窝内，分化为成熟的软骨细胞。 体外诱导成软骨分化的鉴定 主要是形态学观察、阿利辛蓝染色，以及检测成软骨的标志物——II型胶原蛋白来进行，包括通过免疫组化、Western Blot检测II型胶原蛋白的表达，以及RT-PCR检测II型胶原蛋白的mRNA的表达等不同的角度进行鉴定；而阿利辛蓝则主要检测成软骨细胞内酸性粘多糖。 OriCell® 间充质干细胞成软骨诱导分化阿利辛蓝染色效果 大鼠骨髓间充质干细胞 人骨髓间充质干细胞 小鼠脂肪间充质干细胞 实操走起 所需材料 ● OriCell® 间充质干细胞成软骨诱导分化试剂盒（套装内含基础培养基、成软骨诱导添加物、阿利辛蓝染色液） ● 4%多聚甲醛溶液或10%福尔马林溶液 实验操作步骤 1. 将3~4×105个待诱导细胞转移到15mL离心管中，20℃，250×g离心4min。 2. 吸去上清。加入0.5 mL成软骨诱导分化预混液，重悬上一步离心所得沉淀，20℃，150×g 离心 5min。 3. 重复步骤2
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细胞传代出现抱团生长的原因及相对应解决方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
经常会听到小伙伴们问： 细胞传代时候会大量抱团，不是单个细胞，是什么原因?是消化过度了还是消化不完全? 细胞消化不成单个细胞，出现抱团现象，怎么处理？ 细胞抱团生长，这种状态正常吗？ 细胞成团生长且生长缓慢？该怎么办？ 我们做细胞实验的时候经常会碰到细胞抱团的现象，有些时候细胞抱团对我们下一步实验没什么影响，但是当影响实验的时候就简直抓狂。当检测细胞克隆形成率、铺单克隆以及电转等，这时候细胞要是抱团了，得到的结果基本上都是不可靠的，那么细胞为什么会抱团呢？又该如何避免？接下来就一次性给小伙伴们讲清楚吧！ 细胞抱团的原因可能有： 1、消化时间控制不当 有些小伙伴们不管什么细胞都消化3分钟左右，然后用手拍打培养瓶使细胞成片脱落，但有些细胞消化不完全，细胞和细胞之间的连接没有分开，这个时候就拍打下来很容易造成细胞聚团； 也不可消化过度，圆形的细胞容易聚堆，想要通过后面的步骤吹打分开是很难的！ 正确做法：培养前充分了解细胞的特性，可向购买细胞的厂家咨询，也可在网上查询确定细胞的最佳消化时间。 2、传代时操作不当 传代时细胞吹打不均匀，没有将细胞团吹散； 吹打太用力造成细胞死亡，细胞死亡释放的DNA与其他细胞形成黏性的细胞团； 细胞离心速度多大或者离心时间过长； 细胞长的太满才进行传代操作。 正确做法： 消化前加入适量缓冲液对细胞进行清洗，清除死亡的细胞团和部分堆叠杂质； 消化后吹打时上下左右吹打约10次左右，注意控制力度； 确定细胞正确的离心条件，严格按条件执行； 细胞汇合度在80%~90%即可传代。 3、细胞状态不好 细胞状态不好以及发生老化也可能造成细胞抱团。 正确做法：及时换液或者传代，检查培养体系是否适合细胞。 4、细胞接种不当 细胞转移至培养瓶/皿时细胞分布不均匀，或者细胞接种密度过高。 正确做法： 细胞转移至培养瓶后可按倒8字形状摇匀（即∞）； 但对于像96
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光谱检测原理解析-如何设定特定探针发射光的光谱检测范围
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
为了拆分多色成像的发射光谱，首先由分束器或色散元件将不同颜色的光引入到不同的方向[1]，带通滤片则能够最大限度地减少串色，并抑制所有残留的激发光，最终到达传感器。在过去，常使用的滤片是普通的玻璃带通滤片。如今，一项革命性的设计诞生了，那就是在多波段组件（探测器）中使用光度计滑块。该设计可以极为有效地探测发射光，同时提供完全可调谐性，与此同时带来的好处是使光谱扫描成为了可能。使用白激光作为光源时，可调谐光谱检测器是唯一与可调谐光源光谱自由度匹配的设备。其他的光谱检测设备使用一系列检测元件，其波段是固定的，但它们不可调谐，灵敏度较低。 玻滤光片 在以前，荧光显微镜总是使用玻璃滤光片作为屏障滤光片。极早期的荧光显微镜是透射系统，即它们在透射光下进行操作。后来该技术完全被反射光束路径（落射光）取代，入射光系统可以更好的进行激发和发射分离。由于荧光强度仅为照明的约10-4到10-10倍[2]，所以这是一个至关重要的要求。屏障滤光片必须完成两个任务：首先，尽量阻挡杂散光（由于样品或光学组件中的反射，残留激发光到达探测光路）。其次，如果样品含有多种荧光物质（减少串色），屏障滤光片可以进一步缩小收集的光谱带宽以增强通道信号的特异性。 玻璃滤光片可能由有色玻璃材料制成，有多种不同颜色。然而，有色玻璃的性能取决于其使用的化合物，除了混合各种化学品来接近所需的透射性质外，没有其他方法来设计光谱特性。在设计上更灵活的滤光片基于多层涂层（沉积在透明玻璃上）。这种涂层或多或少为设计可见光谱内的任何带通提供了选择。可以用更复杂的涂层作为多通滤片，具有三个或四个透射波段，中间有反射部分，允许多重激发和检测。 尽管多层涂层技术非常先进，但此类设备的局限性在于其不可调性。为了用于多种染料之间的组合，系统必须配备一组此类滤光片，根据实验需求，这些滤片必须通过手动或电动操作插入光路。这使得基于滤片的系统的灵活性变差，实验效率低
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吞噬细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞的区别与功能
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
免疫细胞是生物体内所存在的一种重要细胞，它们的主要作用是参与对抗异物或清除死细胞。常见的免疫细胞可以分为以下几种：吞噬细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞三大类。它们的区别与功能分别是什么？ 吞噬细胞和吞噬作用 当身体被传染性病原体（例如某些微生物）破坏时，它们会遇到免疫系统的各个部分。一般来说，吞噬细胞是一个广义的术语，指的是任何可进行吞噬作用的细胞。 吞噬作用。在吞噬作用中，吞噬细胞吞噬大的原核细胞，如细菌，或真核细胞，如酵母细胞或死细胞 (>0.5 µm) 以杀死它们，或将小颗粒从循环中去除。虽然在低等真核生物中吞噬作用主要用于获取营养，但在高等真核生物中，吞噬细胞主要参与杀死入侵的病原体，从而形成免疫系统的一部分。 巨噬细胞 巨噬细胞是一种白细胞，是一种吞噬细胞。它们是清道夫，不断移动以清除死细胞和病原微生物等异物；这主要是通过产生一氧化氮等化合物而发生的。巨噬细胞是单核细胞，免疫细胞它们不专门针对特定抗原起作用，因此被认为是先天免疫系统的一部分。先天免疫是指免疫系统中最先被激活的部分，从而形成抵御病原体的第一道防线。 它们来源于单核细胞，而单核细胞又来源于骨髓中的造血干细胞。它们可以是固定的巨噬细胞，也可以是游走的巨噬细胞；固定巨噬细胞位于更容易受到病原体入侵的区域，例如肺或肠。流动的巨噬细胞在血流和淋巴结中四处移动以检测入侵者。因此，它们常存在于血液和淋巴系统中 。巨噬细胞产生炎症分子，如细胞因子，这可以激活其他免疫反应。此外，巨噬细胞可以在先天免疫系统和适应性免疫系统之间架起一座桥梁。巨噬细胞能够“处理和呈递”特定 抗原给 T 细胞，而 T 细胞是适应性免疫系统的关键细胞。 中性粒细胞 中性粒细胞是由粒细胞所产生一种白细胞，也是人体中数量较多的一种免疫细胞，中性粒细胞也被称为“原型吞噬细胞”它可以通过巨噬细胞产生的细胞因子来组合。因此，中性粒细胞也是先天免疫系统的一部分。中
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如何通过CRISPR激活和干扰筛选解码人类原代T细胞的刺激反应？
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
在自身免疫、免疫缺陷和癌症中，受刺激的 T 细胞中细胞因子产生的调节可能会被破坏。刺激依赖性细胞因子调节剂的系统发现需要功能丧失和功能获得研究，这在人类原代细胞中一直具有挑战性。通过报告人类原代 T 细胞中的全基因组 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和干扰 (CRISPRi) 筛选，以识别控制白介素-2 (IL-2) 和干扰素-γ (IFN-γ) 产生的基因网络。 CRISPR 激活与干扰筛选技术概述 《科学》杂志中关于CRISPR 激活、筛选有新进展，CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选是测试基因功能得失的强大工具，但它们的使用在很大程度上仅限于永生化细胞系。Smite等人报告了一种优化方法，使他们能够对人类原代 T 细胞进行全基因组 CRISPRa 和 CRISPRi 筛选。然后，这种方法被用来检查调节关键**相关细胞因子产生的基因。然后将合并的 CRISPRa 扰动与单细胞 RNA 测序 (CRISPRa Perturb-seq) 相结合，使他们能够探究细胞因子产生的调节剂如何控制 T 细胞活化并编程为不同的活化后状态. 人类 T 细胞对抗原刺激的反应，包括细胞因子的产生，对健康的免疫功能至关重要，并且可能在自身免疫、免疫缺陷和癌症中失调。系统地了解调节 T 细胞激活与功能获得和功能丧失基因扰动的调节剂将提供对疾病途径的更多见解，并为设计下一代免疫疗法提供更多机会。 CRISPR 激活与干扰筛选的基本原理 尽管 CRISPR 激活 (CRISPRa) 和 CRISPR 干扰 (CRISPRi) 筛选是在永生化细胞系中进行功能获得和功能丧失研究的强大工具，但在原代细胞类型中大规模部署它们一直具有挑战性。在这里，研究团队在原代人类 T 细胞中开发了一个 CRISPRa 和 CRISPRi 发现平台，并对响应刺激的细胞因子产生的功能调节剂进行了全基因组筛选。由于 T 细胞中内源白介素-2 (IL-2) 产生或 CD8 中干扰素-γ (IFN-γ) 产生的水平，通过荧光激活细胞分选到高和低箱中分离 CRISPRa 扰动细胞池+ T 细胞。命中包括近端 T 细胞受体 (TCR) 信号通路基因，表明这些成分的过表达
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关于新建制药工厂常见问题的解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
设计符合性没有系统性审核！ 设备到场了确认活动才开始计划！ URS → 风险评估 → 确认无法追溯！ 没有良好的GEP无法引用FAT/SAT测试！ 验证活动细节描述缺乏，执行不了！ 混淆测试与确认，导致更高的成本！ 回想这些“新建厂房雷区“是不是心有余悸？ 今天，德恩整理了8条关于新建工厂的常见问答知识，希望对小伙伴们在新建工厂需求方面有所帮助！ Q1：我司准备新建一个制药工厂，目标是中美双报。请问GMP的相关工作在什么时间介入是及时且有效的，以便不会影响后续市场？ 德恩A：小编的一句话建议当然是越早越好！如需要第三方协助尽量在厂房设计阶段的前期就确认好合作服务商。 我们都知道GMP的核心就是防止药品生产中的混批、混杂、污染和交叉污染。因此，在厂房设计方面需要综合考量很多因素，包含从厂址选择和厂区总体布局，以及生产区、包装区、储存区、质量控制区、辅助区、人流和物流等区域，通过质量法规风险和技术风险的评估，设计和实施GMP相关规范条款【1-2】。 举例美国FDA在厂房设计和建造以及无菌厂房设计安排方面，就有规定： 美国FDA CFR 211 Subpart C-Buildings and Facilities 中Sec.211.42 design and construction features写明【3】： 任何用于药品生产、加工、包装或贮存的厂房或建筑物，大小适宜，结构与位置使其易于清洁、保养且适合操作。 厂房或建筑物有足够空间来有条理地安装设备和放置材料，避免不同类的成份、药品容器、密封件、标签、中间体或药品等相互混放，防止污染。通过厂房的上述物料其流向在设计时要防止污染。 美国FDA Sterile Drug Products Produced by Aseptic Processing IV. BUILDINGS AND FACILITIES中E. Design部分中对于无菌厂房的设计安排。摘取几点内容： 设计无菌操作过程是为了减少无菌药品在生产操作过程中暴露受污染的危险。减少无菌成分的暴露时间，提供最大可能的环境控制，优化生产流程，设计设备以防止低质量的空气进入100级（ISO 5）的洁
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空气微生物检测：法规要求及有效解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
空气中的微生物主要来自人类的生活和生产过程。它们附着于尘埃或液滴上，随载体悬浮于空气中。微生物可使空气成为传播呼吸道传染病的媒介，因此需要对空气中微生物的种类和数量进行检测。 在中国疾控中心所编写的《新型冠状病毒感染的肺炎公众防护指南》中，指出新型冠状病毒传播途径有：①飞沫传播、②气溶胶传播（空气传播）③接触传播。 气溶胶传播，也可叫做空气传播。气溶胶是指悬浮在气体介质中的固态或者液态颗粒所组成的气态分散系统，其粒径大概多为0.01-10μm。空气中的病毒、细菌和真菌都属于气溶胶（气载微生物）。 世界卫生组织报告曾指出，病毒或细菌可以通过气溶胶经长距离传播而在短期内导致大面积感染。在这类生物气溶胶中，细菌占了绝大部分。 我国空气微生物方面的相关标准最早从1996年开始颁布，根据应用环境的不同，对检测方法和微生物限量均有明确规定，这也为空气卫生的评价提供了法律基础。 《GB/T 18204.3-2013 公共场所卫生检验方法 第3部分：空气微生物》中规定了公共场所空气中细菌总数、真菌总数、β-溶血性链球菌和嗜肺军团菌的现场采样与实验室培养方法。 《WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范》 《GB 37488 -2019 公共场所卫生指标及限值要求》 《CB 50333-2013 医院洁净手术部建筑技术规范》 在空气微生物检测中，自然沉降法和撞击法是最主要的方法。 自然沉降法是根据重力作用而使空气细菌粒子沉降于琼脂培养基，是检测空气细菌数目的最为简单经济的手段，多用于对静止条件下的空气细菌进行采样监测，但是该方法检测到的细菌粒径一般均大于8µm，而小于5µm的细菌微粒由于沉降速度较为缓慢，易悬浮于空气中，因此较难被检测出来。 撞击法是利用抽气动力作用而采集微生物粒子使其撞击在培养基表面，该方法利用抽气泵抽气原理，通过稳定的气流量吸入空气中细菌粒子并产生高速气流，可以有效采集漂浮于空气中的细菌颗粒，具有敏
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脂质体的制备工艺及市场上常用的制备方法介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
前面几篇已对脂质体的文献查阅，处方辅料等做了大量的描述，本篇对脂质体的制备工艺做专门的介绍。药物包封率、无菌性、药物保留性、制备方法和可否规模化生产，脂质体稳定性和成本及有效性都取决于脂质体中载药方法的选择。脂质体制备工艺的区别在于脂质从有机溶剂中干燥或分离然后再分散在水性介质中的方式。脂质体的主要制备工艺可分为主动载药法和被动载药法两种。被动载药法包括薄膜分散法、逆向蒸发法、二次乳化法、溶剂注入法、冷冻干燥法、熔融法去污剂除去法等。主动载药法包括PH值梯度法、硫酸铵梯度法、醋酸钙梯度法、离子载体法等。 1. 官方发布的指南文章对脂质体工艺要求 1.1国外有2015年 FDA Liposome Drug Products脂质体药物制药工业指南草案。 建议附上详细的工艺流程图和各操作点工艺监控参数变化范围及过程控制的描述。这些变化范围应基于药学开发的研究结果。 1.2国内在 2020-11-30 颁布了盐酸多柔比星脂质体注射液仿制药研究技术指导原则（试行）。 采用硫酸铵梯度法制备的主要步骤包括：1）空白脂质体的制备，2）硫酸铵梯度的形成，3）活性药物的装载。活性药物的装载是多柔比星在脂质体内外相的硫酸铵浓度梯度驱动下扩散到空白脂质体内完成的。应提供详细的生产工艺开发研究资料和工艺验证资料（包括无菌工艺验证资料）。建议制定合理的生产过程控制策略，如关键步骤的生产时限、关键中间体的质量控制标准和保持时限等。应特别关注生产工艺和批量对产品质量可控性的影响，注册批和商业批的生产工艺及批量原则上应保持一致。 1.3中国药审中心：2005年10月20日细胞毒类抗肿瘤药脂质体制剂专题会会议纪要 。 目前报道的制备方法(如高压乳匀过滤法、注入法、旋转成膜水化法)均有工艺放大的可行性，但在研究的初期，就需关注工业化大生产需配套的仪器设备以及关键工艺环节的研究。根据目前的研究经验，对于旋转成膜水化后的产品，一般都不是很均匀，都需要经过匀质化处理（如超声，高压乳
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