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《Nature》重磅：蛋白质组发现明星分子KRAS为胰腺癌“充电”新机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：蛋白质组，SILAC，KRAS，癌症 来自德州大学的Giulio Draetta教授及其同事发现胰腺癌细胞表面的一种名为syndecan-1(SDC1)的蛋白质可以响应胞内KRAS的信号，并促进巨噬细胞的破坏作用。这项研究发表于最新的《Nature》杂志。 Letter | Published: 27 March 2019 Syndecan 1 is a critical mediator of macropinocytosis in pancreatic cancer 原文链接：https://www.nature.com/articles/s41586-019-1062-1 肿瘤细胞有恶性无限增殖能力，而这种能力需要大量的能量来支持。很显然，常规的能量代谢频率并不能满足贪婪的肿瘤细胞，它需要借助巨噬破坏其他正常细胞才能满足其自身的能量供应。这种调控巨噬获得能量的机制尚不明确，是目前研究热点之一。 胰腺导管腺癌（PDAC）是一种恶性程度很高，诊断和**都很困难的消化道恶性肿瘤。90%胰腺导管癌中存在Kras突变。这种突变会通过尚不明确的机制激活肿瘤微环境的巨噬细胞，并促进巨噬细胞的胞吞作用。 为了准确地找到胰腺导管腺癌的代谢，Giulio Draetta团队发起了挑战。他们构建了Kras开放和关闭状态下的模型，并通过蛋白组学技术，广泛筛选与研究KRAS相关的细胞表面蛋白，以期寻找**胰腺癌的新靶点。 探索攻略 实验材料：PDAC小鼠模型细胞-- Kras OFF vs Kras ON 1、定量蛋白组分析Kras信号传导带来的变化 为了探讨Kras信号传导带来的细胞表面蛋白表达变化，研究团队利用SILAC定量蛋白质组技术比较了Kras OFF与Kras ON差异。此次分析共获得221个差异表达的蛋白，其中196个蛋白上调，25个下调。 2、生信分析讨论功能与通路 IPA（Ingenuity pathway analysis）分析显示，许多上调表达蛋白参与PDAC被激活的生物过程，包括轴突导向信号通路，这个结果支持了KRAS*是PDAC分子重编程的主要驱动因素的观点。 3、锁定关注蛋白 研究人员选择了在人源PDAC细胞系中同样存在的110个蛋白，以及37个在细胞表面高表达的基因，构建了一个shRNA文库，并以此构建小鼠
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客户文献 | 首篇梅毒患者血清的非靶代谢组学研究发表！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：非靶代谢，诊断标志物，梅毒血清，中科新生命 梅毒是世界范围内一种常见的性传播疾病，致病病原体是梅毒螺旋体，2017年，中国疾控中心报告梅毒新发病例47.5860万例，死亡45人，在所有乙类传染病中排名第三位。 今天小编要为各位老师解读一篇APT客户厦门大学附属中山医院杨天赐课题组最近发表的文献，是首篇对梅毒患者进行代谢组学研究的文章，并筛选到了可以用于梅毒诊断的标志物，其中中科新生命提供非靶向代谢组学检测。 梅毒的诊断和发病机制仍是临床研究的难点。目前梅毒的诊断主要依赖血清学检测(包括非密螺旋体和密螺旋体抗体检测)，血清学检查的假阴性结果以及该方法的局限性可能阻碍梅毒的及时诊断和**，科学家们仍在寻找更敏感、更特异的梅毒诊断标志物。 在本研究首次利用非靶代谢组学方法寻找梅毒患者血清中代谢诊断标志物。 Analysis of Serum Metabolite Profiles in Syphilis Patients by Untargeted Metabolomics 2019 IF=4.287 原文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/jdv.15530 研究材料：血清样本，20例梅毒患者，20例健康人 研究结果： 01、质控评价 代谢的个体化差异大，生物学重复数多，且不做混样，因此对仪器稳定性的要求高。通过QC样本的质控评价可以对仪器的稳定性进行评价，从而判断数据质量的好坏。 通过PCA分析，可以看到图中所有的QC样本（蓝色的点）都紧密地聚集在一起，表明实验过程中仪器稳定性良好，数据可靠。 02、血清代谢组学结果 基于UPLC-Q-TOF/MS技术，总鉴定到2890个特征峰，通过PLS-DA、层次聚类热图分析表明，梅毒患者和健康组在代谢水平上有着明显得分离趋势。 03、筛选潜在生物标志物 满足VIP>1，P
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接二连三，看大牛如何做有望实现临床转化的大队列研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
代谢组学技术的兴起加快了生物标志物的筛选工作，每年都有大量的文献发表。很遗憾的是绝大数文章的研究队列小规模较小，只是属于前瞻性的研究，离真正走入临床应用还有很长一段距离。 小编注意到国内在肝癌、冠心病、结直肠癌等领域已经有了多篇大规模的报道，其中中国药科大学临床代谢组学中心主任齐炼文教授一直走的是大队列研究路线。投入大量时间、金钱的背后动机，无外乎是希望实现科研到临床应用的转化。小编今天想跟给位老师介绍齐炼文教授团队接二连三发表的几篇大队列研究。 2016年，中国药科大学临床代谢组学中心主任齐炼文教授等人在国际心血管领域顶级期刊Journal of the American College of Cardiology发表文章《Comprehensive Metabolomic Characterization of Coronary ArteryDiseases》。原文链接：http://www.cnki.com.cn/Article/CJFDTotal-ZJJJ201604042.htm 研究团队利用UPLC-Q/TOF-MS对2324份血浆临床样本进行了非靶向代谢组学分析，鉴定到89个与冠心病发生发展表型特征密切相关的差异代谢物，其中包括磷脂相关代谢通路抑制、氨基酸代谢增强、酰基肉碱类代谢通路激活、胆汁酸代谢减弱等多种代谢紊乱特征。 进一步从差异代谢物库中筛选出12组灵敏度高（>85%）、专属性强（>85%）的代谢标志物群，绘制了冠心病及其在不同临床阶段（冠脉硬化症、稳定型心绞痛、不稳定型心绞痛、心肌梗死）的血浆代谢组学特征谱。ROC分析显示，12组代谢标志物群诊断能力良好。 在16年文章的基础上，2017年齐炼文教授等人在心血管领域顶级期刊Circulation上发表文章《Functional Metabolomics Characterizes a Key Role for N-Acetyl-neuraminic Acid in Coronary Artery Diseases》。原文链接：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29212895 在16年研究的基础上，研究人员发现36种代谢物与冠心病的发生发展密切相关，随后通过靶向代谢进一步证实N-乙酰神经氨酸(Neu5Ac) 在血浆中的水平与冠心病事件呈显著
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蛋白质组学最新成果——胰腺癌**靶点和诊断标志物的突破性发现
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：肿瘤微环境，磷酸化蛋白质组，分泌蛋白质组，IP-MS，PRM，ELISA 胰腺癌是全球范围内死亡率最高的一种癌症，其发生率高、生存期短的特点而被称为“癌王”。胰腺癌是一种恶性程度极高的消化系统恶性肿瘤，其发病隐匿，早期诊断困难、进展快，发现时已经进入中晚期且大多已经转移，再加上对化疗药物很强的耐药性和对放射疗法不敏感导致**效果非常差，总体5年生存率徘徊在5％左右。因此，开发有效的靶向药物和能用于早期检测的高灵敏度的生物标志物成为业内科学家不懈努力的研究方向。 长期以来，多数研究都关注着肿瘤细胞本身的特性。经典理论认为肿瘤是肿瘤细胞异常增殖形成的新生物。这一理论强调了肿瘤细胞本身的作用，而忽略了基质微环境与肿瘤细胞之间的相互作用及其对肿瘤的影响，早在100多年以前，Stephen Paget提出了著名的“种子与土壤”的概念，肿瘤微环境就像是一个小的生态环境，由于其特殊的理化性质及内含各种生长因子、细胞趋化因子以及蛋白水解酶等成分，与肿瘤细胞生长增殖、侵袭、粘附、血管生成以及抗放射化疗，促使恶性肿瘤产生有紧密联系。因此，2011年著名肿瘤学者Hanahan和Weinberg教授发在《CELL》发表综述，指出肿瘤微环境与肿瘤之间存在密切的联系，且把肿瘤微环境作为癌症的十大重要特征之一，暗示微环境具有潜在的肿瘤**和诊断的开发潜力。 无独有偶，4月17日南方科技大学田瑞军教授与美国Salk研究所Tony Hunter院士合作在国际顶级学术期刊《Nature》上发表了题为Targeting LIF-mediated paracrine interaction for pancreatic cancer therapy and monitoring的研究成果，报道了针对胰腺癌功能蛋白质组学研究最新工作，研究者发现胰腺星状细胞（PSCs）和胰腺癌细胞间的关键通讯因子---白血病抑制因子（Leukemia inhibitory factor, LIF），分析其调控胰腺癌发生发展机制，验证其作为胰腺癌**靶点和临床诊断生物标志物的可行性。 研究者利用开发的肿瘤微环境细胞间信号转导的整合蛋白
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Nature重磅：首次新发现肿瘤脂代谢的可塑性
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关键词：脂代谢，脂质组，肿瘤，生物标志物 大多数肿瘤具有异常活化的脂质代谢能力，使其能够合成，延长和去饱和脂肪酸，以支持细胞增殖。不饱和脂肪酸的合成需要硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD），并且在之前的研究中发现SCD基因在前列腺癌、肝癌、肾癌、乳腺癌等中有过量表达。然而近期发表在《Nature》上的一篇研究却表明肝癌、肺癌细胞不受SCD抑制影响，还存在可替代途径。 Evidence for an alternative fatty acid desaturation pathway increasing cancer plasticity 原文链接： https://www.nature.com/articles/s41586-019-0904-1 研究结果： 01、不同癌细胞对SCD的依赖程度不一样 研究人员采用SCD抑制剂对肝细胞癌(HUH7)、肺癌(A549和H460)、前列腺癌(DU145) 和乳腺癌(MDA-MB-468和T47D) 细胞系进行处理后，却观察到这些不同的细胞系对SCD抑制剂具有不同程度的敏感性，推测部分SCD非依赖型的癌细胞（肝癌、肺癌）可能存在替代性脂肪酸去饱和途径。 02、SCD抑制引起脂肪酸sapienate大量合成 研究人员推断这种替代途径会合成不常见的单不饱和脂肪酸，因此对C12~C18的饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸进行过了检测，观察到SCD抑制剂处理后，SCD非依赖型的癌细胞中脂肪酸sapienate(cis-6-C16:1)含量上升。 03、SCD抑制引起脂肪酸sapienate大量合成 Sapienate是人体皮脂的主要成分，是皮脂细胞代谢的特异性标志物。皮脂腺细胞通过棕榈酸产生sapienate，SCD抑制剂处理后，SCD非依赖性或部分依赖的肝癌、肺癌细胞中sapienate与棕榈酸的比率更高，表明合成sapienate的去饱和酶活性升高。在肝癌异种移植模型、二乙基亚硝胺、基因诱导的肝癌小鼠模型中，同样也发现了SCD抑制剂处理后合成sapienate的去饱和酶活性升高。 04、癌细胞利用FADS2来合成sapienate FADS2为皮脂细胞合成sapienate的去饱和酶。癌细胞是否也是利用FADS2来合成sapienate呢？研究人员发现SCD非依赖性或部分依赖的肝癌、肺癌细胞中FADS2基因表
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细菌鞭毛染色的方法及注意事项！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细菌鞭毛染色的方法及注意事项！ 目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tar and feather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。 1. 碱性复红法和副品红法 1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。 2. 结晶紫法，又称Ryu法 1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想. 3. 维多利亚蓝B法 1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7m
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微生物接种、分离纯化和培养技术！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
关于微生物接种、分离纯化和培养技术！ （一）接种 将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法 在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３） 图３－３ 接种和分离工具 1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀 常用的接种方法有以下几种： １）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。 ３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某细菌具有鞭毛而能运动，则在穿刺线周围能够生长。 ４）浇混接种 该法是将待接的微生物先放入培养皿中，然后再倒入冷却至45°C左右的固体培养基，迅速轻轻摇匀，这样菌液就达到稀释的目的。待平板凝固之后，置合适温度下培养，就可长出单个的微生物菌落。 ５）涂布接种 与浇混接种略有不同，就是先倒好平板，让其凝固，然后再将菌液倒入平板上面，迅速用涂布棒在表面作来回左右的涂布，让菌液均匀分布，就可长出单个的微生物的菌落。 ６）液体接种 从固体培养基中将菌洗下，倒入液体培养基中，或者从液体培养物中，用移液管将菌液接至液体培养基中
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利用Handy PEA和氧电极阐明干燥发菜补水后光合活性恢复的机理
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
欢迎点击「汉莎科技集团」↑关注我们！ 发菜（拉丁学名：Nostoc flagelliformeBorn. et Flah.），中文学名：发状念珠藻，是蓝藻门念珠藻目的一种藻类，广泛分布于世界各地（如中国、俄罗斯、索马里、美国等）的沙漠和贫瘠土壤中，因其色黑而细长，如人的头发而得名，可以食用。 发菜是一种能固氮的光合原核生物。它的丝状体中主要有两种细胞：一种是营养细胞，呈绿色，进行光合作用——吸收、释放、合成有机物质；另一种是异形细胞，体积较大，细胞壁较厚，颜色较淡，主要进行固氮作用——把空气中的氮气还原成氨，合成氨基酸。 由于发菜能用无机碳和无机氮合成有机碳和有机氮，对改良荒漠土壤，繁衍其他生物有重要意义。发菜被誉为“开发荒漠的先锋”。 发菜能在干燥状态下存活好几年，而且补水照光后其光合活性即可恢复。然而光质对恢复其光合活性的影响及潜在机制仍未解决。 近期华中师范大学邱宝胜课题组利用英国Hansatech公司制造的Handy PEA植物效率分析仪和Chlorolab-2氧电极测定了不同光质和光强对发菜补水后光合活性恢复过程中OJIP曲线、光合放氧速率和电子传递活性的变化，并结合膜分离和免疫印迹分析等技术深入探讨了不同光质和光强对发菜补水后光合活性恢复的影响机理。 图1 发菜补水过程中不同光质和光强对Fv / Fm的影响 该研究发现将野外收集的发菜暴露于≥2的不同光质的光强下，PSⅡ的恢复速度如下：红＞绿＞蓝≈紫。进一步降低光强，发现弱红光在发菜再水化的过程中促进PSⅡ的恢复。 OJIP曲线和放氧速率表明放氧复合体是弱红光促进PSⅡ恢复的关键位点。受损的D1蛋白在脱水过程中存储在类囊体膜上，再水化过程中其降解并重新合成。弱红光诱导PsbO与类囊体膜相互作用。 图2 发菜补水过程中红光和蓝光对电子传递活性的影响 因此，弱红光在发菜再水化过程放氧复合体的激活和PSⅡ的功能恢复中起着重要的作用。在发菜的干旱栖息地，微弱的红光可以刺激休眠的发菜在
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《Cell Stem Cell》巧用单细胞测序解析生发过程的深层次调控机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
单细胞转录组测序是这两年来非常流行的高通量组学研究工具，然而，是不是所有的研究都适合用该方法？是不是所有的问题都可以通过该方法来解释？这是一个值得探讨的问题。从现有的研究报道来说，单细胞转录组学研究很好地解决了细胞图谱，发育过程等重要的生物学问题。但是在相对比较传统的研究方向，是否也能利用单细胞转录组测序方法来使研究更加深入和出色？ 本期小编通过对近期发表在《Cell Stem Cell》上的文献的重点内容解析，来领略下生发机制研究中，单细胞转录组学的巧妙运用，如何为解释内在的生发关键时期的调控通路提供了直接证据。 研究背景 哺乳动物毛发生命周期是由毛囊（HF）经历了由生长期（anagen）,退化期（catagen）和休止期（telogen）为代表的三个重要精细调控阶段。来自毛囊干细胞（HFSCs）的角质细胞接受到如Wnt或者Shh等通路的激活信号后，会在生长期促进细胞增殖；在休止期接受到如BMPs等抑制信号时，会促进细胞静止过程。 JAK-STAT通路调控休止期静止的潜在上游调控信号被认为是一些细胞因子家族的因子。制瘤素（OSM）显示出抑制plucking诱导的生长期，而IL-6可以诱导毛囊从生长期进去退化期。OSM和IL-6属于gp130-dependent家族的一类细胞因子，可诱导LIF，CT-1，CNTF的产生。在本研究中，研究人员发现OSM抑制JAK-STAT通路诱导的毛发生长过程，可能是作为一种内源的抑素维持休止期。通过进一步的单细胞测序和验证，发现OSM是由一类TREM2+的巨噬细胞在休止期早期产生来影响毛发生长周期的过程。 图1 研究主要结果展示 研究主体 为研究OSM在毛发生长过程中的调控作用，本研究先进行了一系列的传统分子生物学实验，得到以下几个结论： 1. OSM通过OMSR-JAK-STAT信号通路维持毛囊处于休止期； 2. OSMRβ和其共受体gp130在早期和中期休止期时，在HFSCs细胞凸起与胚芽中，共定位激 活pSTAT5； 3. OSMRb信号通路的干扰缩短了第二个休止期周期； 4. 在休止期中期干扰OMSRβ和STAT5表达促进HFSC
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常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
常用分子生物学和细胞生物学实验技术介绍！ 核酸分子杂交技术 由于核酸分子杂交的高度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学中最常用的基本技术，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切图谱的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突变的检测等。其基本原理是具有一定同源性的原条核酸单链在一定的条件下（适宜的温室度及离子强度等）可按碱基互补原成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针（probe）,待测核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因组DNA和细胞总RNA。核酸探针是指用放射性核素、生物素或其他活性物质标记的，能与特定的核酸序列发生特异性互补的已知DNA或RNA片段。根据其来源和性质可分为cDNA探针、基因组探针、寡核苷酸探针、RNA探针等。 固相杂交 固相杂交（solid-phase hybridization）是将变性的DNA固定于固体基质（硝酸纤维素膜或尼龙滤膜）上，再与探针进行杂交，故也称为膜上印迹杂交。 斑步杂交（dot hybridization） 是道先将被测的DNA或RNA变性后固定在滤膜上然后加入过量的标记好的DNA或RNA探针进行杂交。该法的特点是操作简单，事先不用限制性内切酶消化或凝胶电永分离核酸样品，可在同一张膜上同时进行多个样品的检测；根据斑点杂并的结果，可以推算出杂交阳性的拷贝数。该法的缺点是不能鉴定所测基因的相对分子质量，而且特异性较差，有一定比例的假阳性。 印迹杂交（blotting hybridization） Southern印迹杂交：凝胶电离经限制性内切酶消化的DNA片段，将凝胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至硝基纤维素膜或其他固相支持物上，经干烤固定，再与相对应结构的已标记的探针进行那时交反应，用放射性自显影或酶反应显色，检测特定大小分子的含量。可进行克隆基因的酶切图谱分析、基因组基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性长度多态性分析（RELP）等。 Northern印迹杂交:由Southerm印杂交法演变而来，其被测样品是RNA。经甲醛或聚乙二醛变性及电泳分离
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GENE-π数字PCR技术应用教程
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
GENE-π数字PCR技术学堂开学啦！ 数字 PCR( digital PCR ，dPCR ) 下一代DNA/RNA扩增技术。原理是将一个PCR 反应体系分配到大量微小的反应单元中，在每个微反应器中包含或不包含 1 个或多个拷贝的目标核酸分子 (DNA 模板) ，进行“单分子模板”PCR 扩增。扩增结束后，通过阳性反应单元( 通过终点荧光信号判断) 的数目和统计学方法计算原始样本中目标基因的拷贝数。无需依赖于对照样品和标准曲线就可以进行精确的绝对定量检测。 作为灵敏度最高的技术,数字PCR已证明了它在绝对量化等应用中的可靠性,包括稀有突变检测(如液体活检中肿瘤导致的突变),基因表达和microRNA定量检测,拷贝数变异(CNV)的精确识别以及下一代测序文库定量等。 从科学研究到生物技术,制药领域到工业生产，数字PCR正在迅速成为所有实验室的主流技术。 如何使用GENE-π平台？ Gene-π作为数字PCR学习交流平台，由法国Stilla Technologies公司开发，为您全方位解读数字PCR技术，可以实现从新手到专家的进阶，适用于所有对数字PCR技术感兴趣的科学家。该平台为用户提供最新的数字PCR技术信息，使用户能够学习数字PCR技术的基本知识。详细信息可登陆网站或扫描二维码查看。 要了解数字PCR，您可以选择感兴趣的应用教程，其中包含从实验设计到数据分析的详细工作流程。平台主要分为五大模块，包含： Tutorials，How to，Statistical tools，Training，Community，包含从实验设计到数据分析的详细工作流程，您还可以通过搜索导航工具直接搜索特定的项目（"dPCR的DNA准备"，"荧光溢出"等），或点击我们的"HOW TO" 选择您需要的部分（设计、分析、报告）。 联系我们： 北京深蓝云生物科技有限公司 地址：北京市北京经济技术开发区经海四路25号院2号楼2单元2层201室 电话：010-57256059 邮箱：info@cycloudbio.com 官网：www.cycloudbio.com
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Science | 抗逆突破！泛素化介导叶绿体蛋白降解新途径
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
为了应对全球气候变化带来的频繁逆境胁迫，全面而清晰地了解植物面对胁迫反应的不同调控机制具有重要的意义。在植物抗逆研究中，研究发现非生物胁迫会抑制植物的光合作用，影响叶绿体的稳定性并诱导叶绿体的降解，叶绿体降解进而会引发植物早衰，最终影响作物产量。 叶绿体是为植物提供能量来源的重要细胞器。植物叶绿体内部蛋白的周转通过原核生物类型的蛋白酶（proteases）调节，而外膜蛋白则由叶绿体中的E3连接酶SP1介导的泛素-蛋白酶体系统降解，用于响应发育和环境的信号，然而目前为止对于其中的机制尚不清楚。 2019年2月22日，Science 杂志发表了英国牛津大学植物系Paul Jarvis教授团队研究成果“Ubiquitin-dependent chloroplast-associated protein degradation in plants”，他们发现了一个新的负责降解外膜蛋白的叶绿体蛋白降解系统- CHLORAD (chloroplast-associated protein degradation)。 Ubiquitin-dependent chloroplast-associated protein degradation in plants Science. 2019 Feb 22;363(6429). IF=41.058 论文链接： https://science.sciencemag.org/content/363/6429/eaav4467 研究人员利用正向遗传学筛选和蛋白组学分析发现了两个重要组分（SP2和CDC48），它们协同工作并负责对底物的逆向转运，以便底物被胞质中的蛋白酶体降解。具体而言（图1），SP1 E3连接酶指导靶标蛋白的泛素化（Ub）。SP2和CDC48蛋白质中间体靶向逆向转运至胞质溶胶，分别为该过程提供导管和驱动力。释放到胞质溶胶后，靶标蛋白被26S蛋白酶体降解（26SP）。 图1. 泛素化依赖的叶绿体相关蛋白质降解示意图 这是首次报道的系统性地从叶绿体输出个体蛋白的生化途径，而且不同于以往报道的蛋白转运过程（由胞质向叶绿体的蛋白转运），它是逆向进行的。 此外，该项研究人员还发现，通过操控CHLORAD途径可以改变植物对逆境的耐受性，表明CHLORAD参与调控植物逆境反应。因此，该研究结果可为提升作物抗逆性能提供新的
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Western blotting之样品制备注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
无论你是处理细胞还是组织样本，蛋白提取都是一个很艰难的过程。要么使用物理方法将细胞破碎或者使用化学试剂处理细胞进行裂解。如果第一步提取就搞砸的话，那么长时间小心翼翼培养的细胞就会完全浪费。这里有一些建议可以帮助你进行样品的抽提。 头号公敌：蛋白酶 无论您选择哪种提取方法，蛋白酶都将是一个主要的关注点。当你需要的时候，蛋白酶是很有用的，但是如果你不需要，它们会在短时间内降解目标蛋白。在细胞被胰蛋白酶消化后，在裂解前彻底清洗去除所有的胰蛋白酶。同样的道理也适用于组织，在溶解前要彻底清洗，以清除残留的血液，其中也含有蛋白酶。清洗之后细胞是干净的，准备裂解，要添加蛋白酶抑制剂到裂解缓冲液中。使用蛋白酶抑制剂，并保持样本在冰上，以防止蛋白降解。如果研究的是磷酸化蛋白，也可以添加磷酸酶抑制剂。 物理vs.化学方法破碎细胞 物理裂解方法包括超声、均质、反复冻融和机械破碎(研磨、切碎和碾压)。当不想把化学和酶引入到提取系统中，物理裂解是理想的。然而，专业设备的要求往往会使过程不一致，难以扩大规模，成本过高。由于物理方法有关的压力和温度很高，因此还必须小心避免蛋白变性和聚集。在整个过程中，把所有的东西都预先冷却，并保持样品的低温状态。 如果您无法使用物理方法裂解细胞，请不要担心。有很多抽提试剂可以帮助提取蛋白。试剂裂解法因其操作简便、蛋白提取量高、稳定性好、价格低廉等优点而日益受到人们的欢迎。试剂裂解法的主要缺点是一些盐和去垢剂等干扰下游分析。如果进行蛋白功能研究，在选择缓冲液和去垢剂时需要谨慎。 Apexbio蛋白的抽提试剂 去垢剂的选择 如果抽提的样品量大，添加SDS和其他离子去垢剂到你的缓冲液将是你**的选择。对于Western blotting，使用含有SDS的缓冲液是理想的，例如1X RIPA，因为它在溶解细胞蛋白方面非常有效。如果蛋白需要在其天然构象中正常发挥作用，**使用温和的提取方法，使用非离子去垢剂，如NP-40或Triton X
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蛋白质含量测定的操作方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
衡量食品的营养成分时，要测定蛋白质含量，但由于蛋白质组成及其性质的复杂性，在食品分析中，通常用食品的总氮量表示，蛋白质是食品含氮物质的主要形式，每一蛋白质都有其恒定的含氮量，用实验方法求得某样品中的含氮量后，通过一定的换算系数。即可计算该样品的蛋白质含量。 一般食品蛋白质含氮量为l0％如肉、蛋、豌豆、玉米等，其换算系数为6.25，小麦取5.70，大米5.95、乳制品6.38、大豆5.17，动物胶5.55。 一、目的与要求： 掌握微量凯氏法测定蛋白质总氮量的原理及操作技术。包括样品的消化，蒸馏吸收及滴定与含氮量的计算。 二、原理： 凯氏定氮法：食品经加硫酸消化使蛋白质分解，其中氮素与硫酸化合成硫酸铵。然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸液吸收后，再用盐酸或硫酸滴定根据盐酸消耗量，再乘以一定的数值即为蛋白含量，其化学反应式如下。 (1) 2NH2(CH2)2COOH+13H2S04 (NH4)2S04+6C02+12S02+ 16H2 (2)(NH4)2SO4+2NAOH-----2NH2+2H2O+NA2SO4 (3)2NH3+4H3BO3----(NH4)2B4O7+5H2O (4)(NH4)2B407+H2S04+5H20-(NH4)9SO4+4H2BO2 三、试剂与仪器： 1、硫酸钾 2、硫酸铜 3、硫酸 4、2％硼酸溶液 5、40％氢氧化钠溶液 6、混合指示剂：把溶解于95％乙醇的0.l％溴甲酚绿溶液10毫升和溶于95％乙醇的0.l％甲基红溶液2毫升混合而成． 7、0.OINHCL标准溶液或0．01N硫酸标准溶液． 8、凯氏微量定氮仪一套。 9、定氮瓶100m1或50ml一只。 10、三角瓶150ml 3只。 11、量筒50ml、lOml、lOOml。 12、吸量管10ml只。 13、酸式滴定管1支。 14、容量瓶100毫升1只。 15、小漏斗1只。 四、操作方法： 1、 样品处理：精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，3g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭
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水分的测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
水分测定方法有许多种，我们在选择时要根据食品的性质来选择。常采用的水份测定方法如下： 1、热干燥法： ① 常压干燥法（此法用的广泛）； ② 真空干燥法（有的样品加热分解时用）； ③ 红外线干燥法； ④ 真空器干燥法（干燥剂法）； 2、蒸馏法 3、卡尔费休法 4、水分活度AW的测定 下面我们分别讲述测定水分的方法。 一、常压干燥法 1、特点与原理 ⑴ 特点：此法应用最广泛，操作以及设备都简单，而且有相当高的精确度。 ⑵ 原理：食品中水分一般指在大气压下，100℃左右加热所失去的物质。但实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总量，而不完全是水。 2、干燥法必须符合下列条件（对食品而言）： ⑴ 水分是唯一挥发成分 这就是说在加热时只有水分挥发。例如，样品中含酒精、香精油、芳香脂都不能用干燥法，这些都有挥发成分。 ⑵ 水分挥发要完全 对于一些糖和果胶、明胶所形成冻胶中的结合水。它们结合的很牢固，不宜排除，有时样品被烘焦以后，样品中结合水都不能除掉。因此，采用常压干燥的水分，并不是食品中总的水分含量。 ⑶ 食品中其它成分由于受热而引起的化学变化可以忽略不计。 例：还原糖+氨基化合物 △→ 变色（美拉德反应）+H2O↑ 还有 H2C4H4O6（酒石酸）+ 2NaHCO3 → NaC4H4O6（酒石酸钠）+2H2O+2CO2 发酵糖（NaHCO3+KHC4H4O6） △ →H2O+CO2+ NaKC4H4O6 高糖高脂肪食品不适应 只看符合上面三点就可采用烘箱干燥法。烘箱干燥法一般是在100～105℃下进行干燥。 我们讲的上面三点，应该是具体的具体分析，对于一个分析工作人员，或者是一个技术员，虽然干燥法必须符合三点要求，那么我们在只有烘箱的情况下，而且蓑红样品不见得符合以上讲的三点，难道就不测水分吗？ 例如，啤酒厂要经常测啤酒花的水分，啤酒花中含有一部分易挥发的芳香油。这一点不符合我们的第一点要求，如果用烘箱法烘，挥发物与水分同时失去，造成分析误差。此外，啤酒花中的α—酸在烘干过程中，部分发生氧化等化学反应，这又造成分析上的误
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