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细胞计数与存活测试实验介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
实验材料 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain 取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及0.05 gram preservative methyl paraben (Sigma H-3647) 溶于100 ml Ca /Mg free saline 血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) 计数器(counter) 低倍倒立显微镜 粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) 实验步骤 1 取50ml 细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等体积混合均匀于1.5ml 小离心管中。 2 取少许混合液(约15ml) 自血球计数盘chamber 上方凹槽加入，盖上盖玻片，于100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosin bluish)。 3 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘104 ，即为每ml 中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。 4 大格*细胞总数x 2 x 104 / 4= 细胞数/ml*每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 4 若不用血球计数盘，可用Coulter counter 作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。 5 范例：T75 monolayer culture 制成10ml 细胞悬浮液，取0.1 ml 溶液与0.1ml trypan blue 混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。 活细胞数/方格：55 ,62, 49, 59 死细胞数/方格：5, 3, 4, 6 细胞总数= 243 平均细胞数/方格= 60.75 稀释倍数= 2 细胞数/ml：60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：225/243﹦92.6 %
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细胞伤口愈合实验步骤介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
实验试剂 DMEM培养基 胎牛血清 PBS BD24孔细胞培养板 Raininpipettips,1ml 戊二醛 乙醇 结晶紫 实验设备 细胞培养仪：37°Cand5%CO2 实验材料 人MDA-MB-231cell 实验步骤 1. 细胞在含有10%FBS的DMEM培养基中生长。 2. 细胞以一定密度接种到24孔细胞培养板中，生长24小时后，单层细胞融合度应达到70-80%。 3. 不要更换培养基。用新的1ml枪头轻轻的在单层培养细胞间划痕，划痕横穿过孔，枪头尽量与板孔的底部垂直，不要倾斜。这样产生的gap的距离才与枪头末端的外直径相等。Gap的距离可以选用不同型号的枪头调节。划痕在同一方向成一条直线。 4. 在垂直与第一条划痕的方向制作另一条划痕，每孔划痕成十字交叉型。 5. 划痕后，用培养基轻轻的清洗板孔2次，以去除脱落细胞。 6. 每孔添加新鲜培养基。 7. (培养基中含有某些成分，如抑制/促进细胞迁移和/或增殖的化学物质)。 8. 细胞生长48小时(或根据时间需要)。 9. 1xPBS清洗细胞两次，然后使用3.7%多聚甲醛固定30分钟。 10. 0.1%的结晶紫(2%乙醇溶解)染色30分钟。 11. 染色的单层细胞选取不同的视野，显微镜拍照。gap的距离可通过Photoshop或ImagJ软件测量.为了降低实验结果的可变性，建议每孔选择多个视野观察，每组做多个重复。
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麻醉大鼠动脉血压的测定（直接测定法）实验步骤及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
实验试剂 1. 20%氨基甲酸乙酯（Urethane）注射液或者1.5%戊巴比妥钠（Phentobarbital Sodium）注射液 2. 1%普鲁卡因注射液 3. 0.3%肝素生理盐水注射液 实验设备 1. 常用实验器械一套 2. 家兔或者大鼠实验台一个 3. 用于家兔或者大鼠的聚乙烯医用塑料导管（家兔用导管外径为2mm，内径为1.5mm；大鼠用导管外径为1mm，内径为0.8mm） 4. 压力换能器及其多通道生理信号采集记录仪器 实验材料 家兔，体重为2kg左右；大鼠，体重为200～250g左右。 实验步骤 1. 颈总动脉测量动脉血压 取体重为200～250g左右的大白鼠，用20%氨基甲酸乙酯注射液0.5ml/100g或者1.5%戊巴比妥钠注射液0.2ml/100g，腹腔注射麻醉，待动物被麻醉后，将其固定在实验台上，颈总动脉分离分离出一侧的颈总动脉约2cm。插管前将导管和压力换能器内充满0.3%肝素生理盐水注射液，排走气泡，并且准备好记录仪器。然后先将颈总动脉远心端结扎，近心端用动脉夹夹住，在远心端结扎处的动脉壁上用眼科剪刀以45°角度剪口，将准备好的颈总动脉插管向近心端插入约1cm，用近心端的穿线结扎动脉血管和导管，松开动脉夹将导管再送入约1cm左右，即可看到动脉的血压波形，再用远心端的结扎线结扎固定插管，等动物稳定5min左右，就可以开始实验内容了。 2. 股动脉测量动脉血压 取体重为200～250g左右的大白鼠，用20%氨基甲酸乙酯注射液0.5ml/100g或者1.5%戊巴比妥钠注射液0.2ml/100g，腹腔注射麻醉，待动物被麻醉后，分离出约1cm左右。同样插管前将动脉插管和压力换能器内充满0.3%肝素生理盐水注射液，排走气泡，并且准备好记录仪器。然后先将股动脉远心端结扎，近心端用动脉夹夹住，或者用近心端的穿线轻轻提起血管，阻断血流。在远心端结扎处的动脉壁上用眼科剪刀以45°角度剪口，将准备好的动脉插管向近心端插入约0.5cm，松开动脉夹，或者松开近心端的提线，将插管再送入约1cm左右，用近心端的穿线结扎动脉血管和插管，即可看到股动脉的血压波形，再用远心端的
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活细胞质量测定综述
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
细胞质量、体积和生长速率是细胞生长发育和内稳态维持的重要生物物理参数。从1952年开始，人类就开始了活细胞质量测定的研究，但直到21世纪，随着电脑科学和精密制造工业的发展，使得精确测定细胞质量成为可能，同时也出现了多种活细胞质量测定的仪器。 细胞质量、体积和生长速率影响细胞的大小，而细胞大小的调控在细胞的生长发育中普遍存在，但具体的调控机制知之甚少。细胞大小定量测定有利于对细胞周期中细胞大小和细胞生长调控的理解。 细胞大小一般通过细胞体积和细胞质量来判断，但细胞体积极易受到渗透压力、胞内水分含量的影响，这些因素都会导致细胞形状和体积的改变；同时对于一些贴壁生长的细胞来说，进行精确的细胞大小测定是很困难的。因此，通过细胞体积改变来反应细胞大小的变化不具有广泛的可操作性。相比之下，细胞质量作为细胞内生物合成和生物降解过程的直接反映，是细胞大小的最精确的指示剂。例如，细胞凋亡或死亡、药物**对胞内合成代谢和降解通路的影响等。 活细胞质量测定的方法主要包括：微电子机械系统共振器（MEMSR）、定量相位断层扫描仪（QPT）、数字全息显微镜（DHM）、定量相位显微镜（QPM）。 微电子机械系统共振器 测量共振频率，作为细胞质量的函数，能够高精度的测量细胞质量和细胞生长速率。但环境因素会极大影响共振频率测量，导致分辨率较低；测量稳定性较差；只能测定悬浮生长的细胞，不能测量贴壁生长的细胞。总之，微电子机械系统共振器适合于对少量的悬浮单细胞进行高灵敏度和高精确度的质量和体积测定。 定量相位断层扫描仪 定量相位断层扫描仪通过对细胞进行三维立体扫描，获得光线通过细胞时在三维空间上的相位转换，从而测定细胞质量。特别适用于测量细胞特定厚度范围内的参数以及测量重叠细胞团中单个细胞的质量。但是由于定量相位扫描仪基于复杂的数据获取、数据处理以及复杂的光路，应用受到局限。 数字全息显微镜 通过图像来记录全部的相位和强度信息，然后
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浅析影响胎牛血清质量的几大因素
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
市场上的胎牛血清种类繁多，鱼龙混杂，很多科研工作者，特别是刚接触细胞培养的人，难以分辨血清质量的优劣。本人根据十多年来血清生产销售的经验，总结如下： 一、外观 拿到血清，最先接触的是血清外观，对于缺少细胞培养经验的人来说，外观的判断尤为重要 1、颜色 根据血红蛋白含量的不同，胎牛血清可表现出黄色或红色，我国的细胞培养用血清标准是不高于20mg/dl，实际上，血红蛋白含量的高低对血清并无直接影响，这个指标的意义在于能体现出采血过程的严谨规范程度，良好的操作能降低血清的溶血。 国产血清的采血点很分散，大多是由屠户采血后马上离心收集，所以很少会有溶血，表现出明亮的蜡黄色，当然，国产血清也很少有标准意义上的胎牛血清。 进口胎牛血清或多或少总有点溶血，因为真正的胎牛血清凝血功能差，红细胞容易破裂。 总的来说，国产的血清呈现出蜡黄。进口的血清，质量**的呈现出谈黄、微红色，如Gibco 16000，差点的呈现出橘红色或鲜红色。当然，热灭活血清或保存不当的血清，由于血红蛋白的破坏氧化，会呈现出暗红，甚至咖啡色。 2、沉淀 很多血清客户，会发现进口血清有沉淀，从而怀疑血清的质量问题，这是没有根据的。 血清中的沉淀是由纤维蛋白的凝聚产生，对血清质量没有任何影响，沉淀的产生原因很多，和厂家的加工生产方式密切相关。 国产的血清，大多来自北方，由于价格低廉，保存环境都不好，从采血、冷冻、运输到生产会经过多次冻融，每次冻融过程，就会析出部分纤维蛋白沉淀，这样，血清成品过滤后看起来反而更加的“干净”，很少有沉淀产生。 进口的胎牛血清，过滤分装前很少会反复冻融，生产后的成品也是清澈的，但随着时间的推移，血清中的大量纤维蛋白会析出形成沉淀。当然，进口的新生牛血清，一般牛龄都在2周左右，血清中的各种蛋白含量明显偏高，生产后血清可能会浑浊，甚至有大量沉淀。 当然，购买回来的血清都是冰冻状态，使用时需要融化，融化过程**在温度较低的状态
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影响电泳迁移率的因素介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
由电泳迁移率的公式可以看出，影响电泳分离的因素很多，下面简单讨论一些主要的影响因素： 1. 待分离生物大分子的性质 待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。 2. 缓冲液的性质 缓冲液的 pH 值会影响待分离生物大分子的解离程度，从而对其带电性质产生影响，溶液 pH 值距离其等电点愈远，其所带净电荷量就越大，电泳的速度也就越大，尤其对于蛋白质等两性分子，缓冲液 pH 还会影响到其电泳方向，当缓冲液 pH 大于蛋白质分子的等电点，蛋白质分子带负电荷，其电泳的方向是指向正极。为了保持电泳过程中待分离生物大分子的电荷以及缓冲液 pH 值的稳定性，缓冲液通常要保持一定的离子强度，一般在 0.02 － 0.2 ，离子强度过低，则缓冲能力差，但如果离子强度过高，会在待分离分子周围形成较强的带相反电荷的离子扩散层（即离子氛），由于离子氛与待分离分子的移动方向相反，它们之间产生了静电引力，因而引起电泳速度降低。另外缓冲液的粘度也会对电泳速度产生影响。 3. 电场强度 电场强度（ V/cm ）是每厘米的电位降，也称电位梯度。电场强度越大，电泳速度越快。但增大电场强度会引起通过介质的电流强度增大，而造成电泳过程产生的热量增大。电流在介质中所做的功（ W ）为：W=I2.R.t 上式中： I 为电流强度， R 为电阻， t 为电泳时间。 电流所作的功绝大部分都转换为热，因而引起介质温度升高，这会造成很多影响： ①样品和缓冲离子扩散速度增加，引起样品分离带的加宽；②产生对流，引起待分离物的混合；③如果样品对热敏感，会引起蛋白变性；④引起介质粘度降低、电阻下降等等。电泳中产生的热通常是由中心向外周散发的，所以介质中心温度一般要高于外周，尤其是管状电泳，由此引起中央部分介质相对于外周部分粘度下降，摩擦系数减小，电泳迁移速度增大，由于中央部分的电泳速度比边缘快，所以电泳分
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琼脂糖凝胶电泳技术介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
一、凝胶制备 1.微波炉溶解琼脂糖时，胶液沸腾冲溢出三角锥瓶微波炉加热时胶液可能发生剧烈沸腾， 1）总液体量不宜超过三角锥瓶的 50% 容量， 2）2% 以上胶液设置中火加热 3）胶液剧烈沸腾时，停止加热，移开三角锥瓶，请戴上防热手套，小心摇动三角锥瓶，然后再次加热，胶液沸腾直至胶液清澈，保证琼脂糖完全溶解。 2.琼脂糖电泳图像背景模糊不清 琼脂糖没有完全溶解会造成电泳图像背景模糊不清。 完全溶解的琼脂糖胶液清澈，三角锥瓶内壁应没有粘附琼脂糖颗粒。 3.加热后水分蒸发，如需要应加入热的蒸馏水，补足到原来的重量，摇匀。 二、 电泳 1.DNA 条带模糊，拖尾 1） DNA 降解。避免核酸酶污染。 2）DNA 上样量过多。减少凝胶中 DNA 上样量。 3） 电泳缓冲液陈旧: 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低， pH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。建议经常更换电泳缓冲液。 4）电泳条件不合适。电泳时电压不应超过 20V/cm ，温度＜30 ℃ ,巨大 DNA 链，温度应＜15 ℃，核查所用电泳缓冲液是否有足够的缓冲能力。 5）DNA 样含盐过高。泳前通过乙醇沉淀去除过多的盐。 6）有蛋白污染。电泳前抽提去除蛋白。 7）DNA 变性。电泳前勿加热，用 20mM NaCl 缓冲液稀释 DNA 。 2.DNA 条带淡弱或无 DNA 带 1）DNA 的上样量不够：增加 DNA 的上样量。 2）DNA 降解：避免 DNA 的核酸酶污染。 3）DNA 走出凝胶：缩短电泳时间，降低电压，增强凝胶浓度。 4）分子大小相近的 DNA 带不易分辨。增加电泳时间，使用正确的凝胶浓度。 5）DNA 变性：电泳前请勿高温加热 DNA 链，用 20mM NaCl Buffer稀释DNA 。 6）DNA 链巨大，常规凝胶电泳不合适。在脉冲凝胶电泳上分析。 3.DNA MARKER 条带扭曲 1）配制凝胶的缓冲液和电泳缓冲液不是同时配制的。使用同时配制的缓冲液。电泳时缓冲液高过液面1 － 2mm 即可。 2）电泳时电压过高。可以在电泳前 15
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透析袋原理、使用方法及注意事项介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
1. 透析袋原理 技术指标：MWCO（截留分子量），单位：Diatoms 。 透析时，小于MWCO的分子在透析膜二边溶液浓度差产生的扩散压作用下渗过透析膜，其速度与浓度梯度、膜面积及温度成正比。欲快速透析可采用直径较小的透析袋以增加膜面积。常用温度：4℃，升温、更换袋外透析液或用磁力搅拌器，均能提高透析速度。 2. 透析袋用途 透析即用半透膜（透析袋）将大分子蛋白质分离出来。在生物大分子制备过程中除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质和浓缩样品，透析法最简便。 3. 透析袋使用方法: ① 把透析袋剪成适当长度（10cm左右）的小段。 ② 取适量透析袋处理液（Fast-Tre Solution）稀释100倍，将透析袋放于其中煮沸10分钟。 ③ 取出用蒸馏水彻底清洗透析袋。 ④ 暂不使用的话需要将透析袋完全浸泡到稀释100倍后的透析袋储存液（Long-Sav Solution）中，存放于4度。从此时起取用透析袋是必须戴手套。 ⑤ 浸泡在透析袋储存液中的透析袋取出使用前，须将透析袋内装满水然后排出，将之清洗干净，冲洗三次即可。 实验要求不高的可以用简易处理方法：在沸水中煮10min即可使用 ⑥使用时，一端用下沉透析袋夹子夹紧，灌满水后，用手指适当加压，检查不漏，方可装入样品。通常要留三分之一至一半的空间，以防透析过程中，袋外的水和缓冲液过量进入袋内将袋涨破。装完样品后，用上浮夹子夹紧袋口，可在袋内放一玻璃珠，以使透析袋处于悬浮状态，即可进行透析。为了加快透析速度，除多次更换透析液外，还可使用磁力搅拌器。透析的容器要大一些，可以使用大烧杯、大量筒和塑料桶。 4. 透析袋相关配件 5.透析袋使用中注意事项及技巧 透析袋用之前一定要处理； 1）除盐透析时将高盐的样本加入透析袋中，夹紧，用你选择的保存液进行透析，一般在2-8度透析过夜，中间要更换一到两次透析液，另外透析液体积尽量大些。 先把透析液放进容器中（容器的直径小于透析袋长度），再将夹好的透析袋竖直放进去，这样透析
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细胞冻存技术介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
细胞冻存技术 实验室低温保存设备包括：液氮保存箱、液氮罐、-140℃/-150℃深冷低温保存箱、-86℃超低温冰箱、程控降温仪、低温冰箱（-20℃、-30℃、-40℃）、药品保存箱、疫苗保存箱、血库冰箱、层析柜、防爆冰箱、防火冰箱等。 检验冰箱可靠性和制冷能力的方法：1、常规冰箱放置温度计；2、超低温冰箱放置加热器、大量样品或反复开门 1. 冻存保护剂 很多化合物都可以作为冻存保护剂，它们既可以单独使用也可以联合使用，例如糖、血清和去污剂。虽然冻存没有绝对的准则，但是大家普遍认为二甲基亚砜（DMSO）和甘油是保护活细胞和组织使用最广泛且最有效的冻存保护剂。其他冻存保护剂可根据情况使用，可单独使用也可联合使用，包括：聚乙烯乙二醇（polyethylene glycol），丙烯乙二醇（propylene glycol），甘油（glycerine），聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrolidone），山梨醇（sorbitol），右旋糖苷（dextran），海藻糖（trehalose）。 冻存组织和整个器官的需求，促进了冻存方法的发展，新方法也提高了冻存细胞和有机体的复苏。这些方法包括改变冻存保护剂的浓度和加入添加剂，避免冻存过程引发的细胞调亡或 程序性死亡。多年来人们一直认为，是冻存过程中产生的细胞内物理变化或损坏，造成冻存后细胞的死亡。而最近有研究发现，一些更为精细的胞内活动可能导致了细胞死亡，而这些活动可在一定程度上受控于适当的冻存添加剂。 冻存过程中，冻存保护剂有多种功能。例如，DMSO 可以降低冰点，促进细胞在胞内冰晶形成之前脱水更加完全。普遍认为，当冻存保护剂可有效穿透细胞，延迟胞内冰晶形成，降低溶液效应时，冻存保护的效果最佳。另外，需要根据冻存的细胞类型来选择冻存保护剂。对绝大多数细胞来说，甘油是更好的选择，因为它的毒性比DMSO 小。但是，DMSO 具有更好的渗透性， 通常作为较大型较复杂的细胞冻存，如原生生物。在添加到细胞悬液之前，冻存保护剂应该用新鲜培养基稀释到适宜浓度，这能最小化潜在的化学
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电转化仪高效转染mRNA进入小鼠受精卵形成稳定突变体
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
摘要 随着小鼠基因组序列测序完成，许多研究都围绕着功能基因参与的生物学过程，特别是发育和疾病研究领域。那么稳定遗传修饰的模型动物对于阐明基因的作用十分重要，然而，传统的方法，包括在胚胎干细胞中的同源重组或是构建小鼠嵌合体，既耗时又耗力。然而新的基因组编辑方法明显的优化这个过程。在有效的基因组编辑方法中CRISPR/Cas 9系统是构建携带修饰基因组最简单的方法。 虽然，CRISPR/Cas9系统简化了形成突变体的过程，但是将DNAs/RNAs微注射入受精卵需要特殊的技术，得到大量的突变体也十分耗时间（注射数以百计的受精卵）。那么，为了简化这个过程，我们尝试用电转化仪将RNA导入受精卵。 电转也被用于过小鼠受精卵，但是过程涉及去除卵透明带，或是用酸台氏液薄化处理，这些对细胞是非常有毒性的，而且只有短小的RNAs（短于1kb）可以被导入。 近期，一只大鼠突变体成功构建，借助于在保持卵透明带完好的前提下转染Cas9mRNA和gRNA入大鼠受精卵。然而基因组编辑的效率很低（低于9%），而且需要大量的Cas9（1000-2000ng/ul）。 方法与结果 为了优化电转条件，我们使用BEX CUY21 EDIT II电转化仪，以及铂金块电极，1mm间隔（图1abc）。放在体视显微镜下，并连接电转化仪。每次加入5ulRNA，可以电转40-50个胚胎。 为了提高基因组编辑效率，分别借助mCherry mRNA和无肢基因Fgf10，优化参数，得到电转受精卵存活并发育成两细胞阶段的比率是94-95%，比微注射方法34-35%要高很多。 当我们使用400ng/ul的Cas9 mRNA和200ng/ul gRNA进行转染，87%的胚胎表现出缺失前、后腿，是图2c（type I）；10%的突变体是肢体残缺（type II）;只有3%的胚胎表现为正常（type III）。对I型突变体进行测序，发现Fgf10基因等位基因全部被打断。 随后，我们检测了不同浓度的Cas9mRNA和gRNA对于基因编辑的效率。200ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，73%的胚胎无肢；100ng/ul Cas9 mRNA和50ng/ul的gRNA，32%展示肢体残缺（图2bc
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波前传感器的技术革命 -----四波剪切干涉技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
波前传感器的技术革命 -----四波剪切干涉技术 文：陈昌营，上海昊量光电设备有限公司技术工程师 摘 要： 波前传感器(波前分析仪)是自适应光学系统最重要的组成部件之一，决定了自适应光学系统最终的调制结果。同时波前探测器在激光、天文、显微、眼科等复杂自适应光学系统的波前像差检测，虹膜定位像差引导，大口径高精度光学元器件检测，平行光管/望远镜系统的检测与装调，红外、近红外探测，激光光束性能、波前像差、M^2、强度的检测，高精密光学元器件表面质量的检测等领域发挥着越来越重要的作用。法国PHASICS公司研发团队，突破传统技术的壁垒，成功研发出了世界上分辨率最高的四波剪切干涉技术波前探测器。本文简单介绍了波前传感器的原理和典型应用，以及四波剪切干涉技术原理，比较了剪切干涉技术的波前分析仪与传统哈特曼传感器的特点。 引 言： （Wave Front Sensor），按照其技术发展的历史可以分为三个阶段：第一阶段，1900年德国科学家哈特曼采用挖孔的光阑技术制作完成了世界上第一个可以用于检测波前的传感器。第二阶段，1971年R.K.Shack采用为透镜阵列研发成功了精度更高的夏克-哈特曼波前分析仪。2000年法国Phasics研发团队采用四波剪切干涉技术成功研发了基于技术（4-Wave Lateral Shearing Interferometry），该波前探测器具有高分辨率（400X300）、高动态范围（500 um）、消色差、高灵敏度、高相对精度（2nm RMS）、无需校正、体积小、操作简便等特点。上海昊量光电设备有限公司代理的法国phasics波前相差仪可以实时测量成像系统瞳面波前误差，然后将这些测量数据转换成自适光学系统的控制信号，并对成像系统的光学特性进行实时控制，实时校正入射光束波前变形，从而补偿又大气湍流引起的波前畸变，使物镜得到接近衍射极限的目标像。 四波剪切干涉技术原理： 剪切干涉技术基本原理是将待检测的激光波前分成两束，其中的一束相对于另一束横向产生一些错位，两束错位的光波各自保持完整的待测
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冷冻饮品中大肠埃希氏菌O157的检测
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
夏天到了，全国各地又进入了“烧烤模式”。4 月 23 日，广州入夏；5 月 14 日，北京入夏；5 月 29 日，上海入夏。下图为中国气象网 8 月 3 日发布的一张高温区域图，红色代表的高温区域占据相当大的比例。 在炎炎夏日中，美味而且清凉的冷饮，可以让大家忘却酷暑炎热。市场上各种品牌的冰淇淋、冰棒、汽水、果汁等产品琳琅满目，极大地丰富了人民的物质生活。但是冷饮的保存需要注意，通常都需要 4℃ 冷藏保存，部分冰品还需要 -20℃ 低温保存。这些冷饮一旦融化后再复冻，里面就有可能会有细菌繁殖。 中国国家标准《GB 2759.1-2003 冷冻饮品卫生标准》对微生物含量做出了具体要求，下表为具体信息： 项目 菌落总数 （cfu/mL） 大肠菌群 （MPN/100mL） 致病菌 含乳蛋白冷冻饮品 ≤ 25000 ≤ 450 不得检出 含豆类冷冻饮品 ≤ 20000 ≤ 450 不得检出 含淀粉或果类冷冻饮品 ≤ 3000 ≤ 100 不得检出 食用冰块 ≤ 100 ≤ 6 不得检出 大肠埃希氏菌（E. coli）通常被称为大肠杆菌，这些细菌常寄居在人和动物的消化道，并随粪便排出体外，广泛分布在水和土壤中。大多数肠道杆菌属于正常菌群，当机体免疫力降低或侵入肠道外组织时，成为条件致病菌而引起疾病。肠出血性大肠杆菌（EHEC）是能引起人的出血性腹泻和肠炎的一群大肠埃希氏菌。以 O157:H7 血清型为代表菌株。根据相关标准，大肠埃希氏菌 O157 在冷冻饮品中不得检出。 根据相应标准，RephiLe 特别推荐下面的冷冻饮品中大肠埃希氏菌 O157 检测解决方案。检测方案按照国际标准在固体培养基表面分离得到的典型菌落，该菌落能产品吲哚反应以及使 O157 血清产生凝集： 一、仪器 干热灭菌箱和湿
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质粒DNA的大量提取、纯化及棉花的遗传转化
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
实验试剂 1. STE [0.1 mol/L NaCI、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 1 mmol/LEDTA (pH 8.0)] 2. 溶液I [50 mmol/L蔗糖、25 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0), 10 mmol/L EDTA (pH8.0)] 3. 溶液II (0.4 mol/L NaOH和2%SDS等量混匀) 4. 溶液III (3 mol/L Kac, pH 4.8) 5. 异丙醇 6. 4 mol/L LiCI 7. RNase 8. 苯酚、酚-氯仿、氯仿 9. 乙醇 实验设备 1. 摇床 2. 制冰机 3. 高速离心机 4. 水浴锅 5. 超净工作台 6. 玻璃毛细管 7. 微量注射器 实验材料 棉花，转化农杆菌菌株 实验步骤 1. 37℃, 250 rpm摇菌500 ml。 2. 5000 × g离心5 min以收集菌体，用50 ml STE洗涤菌体一次。 3. 加入溶液I 20 ml悬浮菌体。 4. 加溶液II40 ml，轻轻将离心管颠倒几次，置冰浴20 min。 5. 加预冷的溶液III30 ml，将离心管颠倒几次，置冰浴10 min以上。 6. 10000 × g离心15 mm，取上清液加入0.6倍体积的的异丙醇，充分混匀后室温放置10 min以上。 7. 10000 × g离心10 min，弃上清。待沉淀干燥后用350ul水溶解，加350 ul 4 mol/L LiCI，混匀后室温放置10 min以上。 8. 10000 × g离心5 min，取上清液加入RNase至终浓度为100 ug/ml，37℃保温2h。 9. 用苯酚、酚-氯仿、氯仿各抽提一次。上清加0.1倍体积的3 mol/L NaAc (pH5.2)及2倍体积的无水乙醇。 10. 离心收集DNA沉淀，70%乙醇洗涤一次。干燥后溶于TE中备用。 11. 棉花的遗传转化:大量的质粒，用无菌水稀释成2 mg/ml的DNA溶液进行子房注射。注射在超净工作台上进行，注射针是玻璃毛细管，顶端直径约为0.1mm。将毛细管另一端紧紧套入10-20ul的微量注射器针头，吸取被注射的DNA样品6-12ul。注射时，将针头对准子房伸出的花丝部分进行。每个子房约注射0.2ulDNA。
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小鼠心脏组织蛋白样品的蛋白质组学分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
实验步骤 1. 蛋白质双向电泳 1) 第一向固相pH梯度等电聚焦电泳 a. 上样：第一向等电聚焦采用胶内加样的方法进行。精确吸取一定量的蛋白样品(银染样品的蛋白上样量为140 ug计，考染样品为1.3 mg)加入重泡涨液(8 mol/L尿素，2%CHAPS，痕量滨酚蓝，20 mmol/L DTT，0.5 % IPG buffer)，使终体积达到350ul。混匀后均匀加在IPG胶条holder的正、负极之间。将预制IPG胶条(pH 3 -10 NL)除去保护膜，胶面向下，覆于holder中的样品之上；慢慢下压胶条，并前后移动，避免生成气泡。在胶条上方均匀封以1 ml覆盖油，盖上盖子。 b. 等电聚焦：将装有样品和IPG胶条的strip holder置一向电泳仪(IPGphorTM Isoelectric Focusing System)上进行等电聚焦。等电聚焦参数：0V电压下泡涨3h，30V电压下泡涨10 h，500 V电压下电泳0.5 h，2000V电压下电泳0.5 h，5000 V电压下电泳0.5 h，8000 V电压下电压20 h。 c. 胶条的平衡：第一向电泳结束后，取出IPG胶条平衡两次，每次15 min。平衡缓冲液(50 mol/L Tris buffer pH 8.8，6 mol/L尿素，30甘油，0.8 g澳酚蓝，20 mmol/L DTT，含2 % (w/v) SDS)可减少电内渗，有利于蛋白质从第一向转移到第二向。在第二步平衡中用100mmol/L碘乙酞胺代替DTT以除去第一步平衡时的DTT。平衡后的IPG胶条沿边缘用滤纸吸去多余的平衡液。 2) 第二向垂直SDS-PAGE 根据IPG conversion Kit的体积，配制大小为200 mmX200 mmX 1mm，浓度为12.5%T，3.3%C的均匀胶。将平衡好的IPG胶条移至凝胶上方，用0.5%琼脂糖电泳缓冲液封闭。电泳的缓冲液系统为Tris-Glycine-SDS系统(500 ml，SX，7.5 g Tris，2.5 g SDS，36 g Glycine)。一向胶条和二向胶接触面避免气泡产生；封胶温度不能过高，封胶时不要引入气泡。 电泳参数设置：14-15℃恒温下，以每胶条计 20 mA恒流电泳40 min 30 mA恒流电泳至澳酚蓝电泳到底部。 2. 染色 1) 银染法：将二向电泳完成后的SDS-PAGE转移至固定液(40%无水乙醇，10%冰醋酸)中，固定30 min；弃固定
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小鼠角质细胞的分离和培养
作者：德尔塔 日期：2022-04-25
实验试剂 HBSS： NaCl 8g/L KCl 400mg/L KH2PO4 60mg/L 无水Na2PO4 47.86mg/L 无水葡萄糖 1000mg/L NaHCO3 350mg/L 实验材料 妊娠期BALB/c小鼠 实验步骤 1. 将1~2天龄新生裸鼠窒息后，置于培养皿中，用1%碘聚乙烯吡咯烷酮液洗净裸鼠，流水彻底冲洗，然后用70%乙醇洗两次。小鼠应立即使用，若待处理的小鼠数量较多，可置冰上30min。 2. 去除小鼠的四肢和尾巴。 3. 将小鼠从尾巴至鼻子的皮肤作一简单切口，用大鼠牙齿镊轻轻将整个身体的皮肤剥下，用一把镊子夹住身体，另一把镊子拉开皮肤。 4. 将剥下的皮肤组织置于放在冰上的无菌培养皿表面，直至所有的皮肤收集完毕。 5. 用2把大鼠牙齿钳夹住皮肤组织，在含2.5%胰蛋白酶的HBSS无菌培养皿中漂洗皮肤组织（真皮组织在下），然后置4oC过夜。表皮不应淹没在胰蛋白酶液中。 6. 从胰蛋白酶处理液中取出组织，将表皮面朝下置于干燥的无菌细胞培养皿表面。表皮易于贴附于塑料上，真皮组织用组织钳扯去，鼠龄与此有影响，天龄越大，去其表皮越困难。 7. 用剪刀小心地将表皮残留物剪碎，置于含“常规”培养液（MEM含10%FCS，100IU/ml青霉素，100ug/ml链霉素，2~4mmol/L L-谷氨酰胺；每5只小鼠皮肤用10ml）的无菌烧瓶中，磁力搅拌器37oC剧烈搅拌45min。 8. 用4层无菌Nitex纱布（16um孔，Martin提供）过滤液体。当其他细胞通过时角质层细胞留在纱布的表面。 9. 用培养瓶将细胞洗下，培养基的用量约为一块皮肤10ml，将细胞接种于塑料细胞培养瓶中或玻璃盖玻片上，37oC培养4~12h。 10. 4~12h后观察培养皿表面的细胞群。 11. 将细胞转移至低钙培养液，角质细胞将开始繁殖。这种转移防止细胞的分层。低钙液由MEM（无钙）和10%螯合的FCS（同样含有正常水平的青霉素、链霉素）组成。螯合的血清按下法准备：每50ml血清需20g树脂，Chelex 100（Bio-Rad）。将树脂置于水中，40g/L，pH约为7.4，放置滤纸于漏斗上，过滤树脂。加入树脂于FCS中，搅拌60min。接着过滤使血清变得清亮，再用0.45ug
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