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Seahorse XF实时ATP速率测定-细胞能量代谢服务
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
实验背景 细胞三磷酸腺苷(ATP)的产生速率是一种描述细胞代谢的信息含量很高的测量，因为ATP是细胞内普遍存在的主要能量货币。细胞的代谢调控使细胞根据ATP需求的变化调整ATP产生的变化来维持总的细胞内的ATP水平。 安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定被设计用来测量活细胞总的ATP产生速率。更重要的是，这个实验能够区分哺乳动物细胞内两条主要的产生ATP的代谢途径线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）和糖酵解ATP的产生。 Seahorse XF实时ATP速率测定利用代谢的调节剂（寡霉素（Oligomycin），鱼藤酮（Rote）及（）的混合物，见图1），当连续加药后，可以计算线粒体和糖酵解的ATP产生速率。配合Seahorse XFe24，XF96或XFe96分析仪，SeahorseXF实时ATP速率测定通过提供细胞ATP产生速率的实时测量和细胞能量平衡的定量表型为细胞生物能量学提供了一个新的动态和定量的视角。 图1. 安捷伦Seahorse XF实时ATP速率测定方案-OCR和ECAR测量的动力学曲线。 首先测量基础OCR和ECAR。加入寡霉素导致线粒体ATP合成受到抑制从而引起OCR减少，使mitoATP产生速率得以量化。ECAR数据结合检测液的缓冲系数可以计算总的质子流出速率（PER）。用鱼藤酮和A完全抑制线粒体呼吸能够计算线粒体相关的酸化，结合PER数据能够计算glycoATP产生速率。 哺乳动物细胞中，糖酵解和氧化磷酸化（OXOHOS）途径提供大部分的细胞ATP。氧化磷酸化消耗O2，驱动氧气消耗速率（OCR），这两条途径都能导致检测液酸化。葡萄糖通过糖酵解转换成乳酸，每分子乳酸伴随着一个H+流出，而TCA循环使ETC/氧化磷酸化产生CO2，也会导致检测液酸化。这些反应的总和是细胞外酸化（ECAR）变化的主要驱动因素。 词汇表 · glycoATP产生速率(glycoATPProduction Rate)：糖酵解途径中葡萄糖转变成乳酸相关的ATP产生速率(以pmol ATP/min来表示)。 · mitoATP产生速率(mitoATPProduction Rate)：线粒体氧化磷酸化相关的ATP产生速率(以pmol ATP/min来表示)。 · 总的ATP产
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如何使用厌氧指示剂判断厌氧环境？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
使用厌氧指示剂判断厌氧环境，厌氧产气袋（厌氧产气包）配套厌氧培养罐（厌氧培养盒）或者密封培养袋使用，密封好即可。那么如何判断内部是否为厌氧条件呢？日本三菱MGC配套的有一款厌氧指示剂，这个指示剂是通过颜色变化辅助检测内部是否为厌氧环境，在有氧条件下指示剂呈现深紫色，无氧条件下指示剂呈现浅粉色。通过这个变色过程就可以帮我们判断内部是否厌氧。当然还有另一种方法，就是使用氧气浓度计，这个小仪器虽然测量比较快速，但是相对价格比较高，大概几千块钱一件，这个就根据大家的实际情况去选择了。 变色范围： 无氧状态（O2＜0.1%）：浅紫色到粉红色； 有氧状态（O2＞0.5%）：淡蓝色到深蓝色。 通过颜色的变化可以检查氧气的存在。 使用方法： 剪开外包装后直接使用，氧气指示剂的里层包装薄膜上有小孔，氧气从小孔进出而引起颜色变化，使用时不需要将药片从薄膜中取出。 注意事项： 尽管指示剂的颜色变化是可逆的，但其变化的敏感性随着氧气、二氧化碳、热、光等因素的影响而降低。重复使用时颜色会有所不同，并终失效。 储藏方法： 氧气指示剂需要在无氧条件下冷藏保存（2~8℃）。 厌氧指示剂作用示意图： 通过以上介绍使用厌氧指示剂判断厌氧环境，这个问题相信大家会有所了解，创凌生物期待与大家进一步沟通与交流！
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细胞培养常见问题及解答（二）
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
接上一期，本期我们继续分享细胞培养常见的问题吧~ 12. 附着性细胞继代时所使用的trypsin-EDTA 浓度？应如何处理？ 一般使用的trypsin-EDTA 浓度为0.05% trypsin-0.53 mM EDTA Na4。 第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于-20 ℃，避免反复冷冻解冻造成trypsin 的活性降低，并可减少污染的机会。 13. 欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？ 回收动物细胞，其离心速率一般为300xg (约1 000 rpm)，5-10 分钟，过高的转速，将造成细胞死亡。 14. 细胞冷冻培养基的成份为何？ 动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90-95% 原来细胞生长用的新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO 稀释时会放出大量热能，故不可将DMSO 直接加入细胞液中，必须使用前先行配制完成。 15. DMSO 的等级和无菌过滤的方式为何？ 冷冻保存使用的DMSO 等级，必须为Tissue culture grade之DMSO (如Sigma D2650)，其本身即为无菌状况，第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于4℃，避免反复冷冻解冻造成DMSO 的裂解而释出有害物质，并可减少污染的机会。若要过滤DMSO，则须使用耐DMSO 的Nylon 材质滤膜。 16. 冷冻保存细胞的方法？ 冷冻保存方法一：冷冻管置于4℃ 30~60 分钟→ (-20℃ 30 分钟*) → -80℃16~18 小时(或隔夜) → 液氮槽vaporphase 长期储存。 冷冻保存方法二：冷冻管置于已设定程序的可程序降温机中每分钟降1-3 ℃至-80℃以下，再放入液氮槽vapor phase长期储存。*-20℃不可超过1 小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤，接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微 降低一些。 17. 细胞欲冷冻保存时， 细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？ 冷冻管内细胞数目一般为1x106 cells/ml vial，融合瘤细胞则以5x106 cells/ml vial 为宜。 18.培养基中是否须添加抗生素？ 除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，
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解答流式细胞凋亡检测疑难
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1、Q：rh Annexin V R-PE 20 tests是BD公司用于凋亡流式检测的试剂盒，产品显示种属为人，请问能否用于大鼠细胞的检测？ A：可以。因为Annexin V是与PS亲和，而PS在不同种属间应该没差异。在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸（PS）只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V是一种分子量为35~36kD的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。将Annexin V进行荧光素（FITC）标记，以标记了的Annexin V作为荧光探针，利用荧光显微镜或流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。 2、Q：用流式作细胞凋亡为什么跟tunel差别那么大啊？？tunel测出来的细胞凋亡率大概有30%而作流式测出来的凋亡率只有2%（阴性对照0.5%）差别好大啊，用的是beckman公司的Annexin V /PI双染试剂盒，实验步骤如下： （1）胰酶消化贴壁细胞，加培养基中止，离心1000转5min （2）吸去上清，PBS0.5ml 重悬细胞（因为要送到别处作流式，期间路程约1h，户外温度约37度） （3）然后加入Annexin V /PI各5微升，避光20min，上机。 请问这是什么原因导致的？ A：我也用这两种方法做过凋亡，是存在两种方法测的凋亡率差别有点大，但还没有大到你这样的程度。双染测的是凋亡的早期事件PS外翻。TUNEL测的是凋亡最晚期的事件DNA的片段化。而且TUNEL在检测过程中，把操作损伤细胞和坏死细胞当作了凋亡细胞，而且如果TUNEL是肉眼计数的话，也会有判断上的误差，所以，往往TUNEL作出来的凋亡率高一点。但如果凋亡率达到30%，ladder估计也应该跑的出来。双染虽然是机器操作，但在调试补偿时，人为的影响还是挺明显的，也不是特别的客观。基线稍微左移，你的凋亡率就成倍上升。所以，给你的建议是在经费、时间允许的范围内再多做几次吧。感觉这么大的
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培养细胞时都有哪些分类？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
动物细胞培养 在所有的细胞离体培养中，困难的是动物细胞培养。下面是它所需要的特殊条件。 ⑴血清：动物细胞离体培养常常需要血清。常用的是小牛血清。血清提供生长必需因子，如激素、微量元素、矿物质和脂肪。在这里，血清等于是动物细胞离体培养的天然营养液。 ⑵支持物：大多数动物细胞有贴壁生长的习惯。离体培养常用玻璃，塑料等作为支持物。 ⑶气体交换：二氧化碳和氧气的比例要在细胞培养过程中不断进行调节，不断维持所需要的气体条件。 植物细胞培养 ⑴光照：离体培养的植物细胞对光照条件不甚严格，因为细胞生长所需要的物质主要是靠培养基供给的。但光照不但与光合作用有关，而且与细胞分化有关，例如光周期可对性细胞分化和开花调控作用，所以以获得植株为目的的早期植物细胞培养过程中，光照条件特别重要。以植物细胞离体培养方式获得重要物质，如药物的过程，植物细胞大多是在反应器中悬浮培养。 ⑵激素：植物细胞的分裂和生长特别需要植物激素的调节，促进生长的生长素和促进细胞分裂的分裂素是基本的激素。植物细胞的分裂，生长，分化和个体生长周期都有相应的激素参与调节。和动物细胞相比，植物细胞离体培养对激素要求的原理已经了解，其应用技术也已相当成熟，已经有一套能使用的培养液。同时解决了植物细胞对水、营养物、激素、渗透压、酸碱度、微量元素等的需求。 [2] 微生物细胞培养 微生物多为单细胞生物，野生生存条件比较简单。所以微生物人工培养的条件比动植物细胞简单得多。其中厌氧微生物培养比好氧微生物复杂，因为严格厌氧需要维持二氧化碳等非氧的惰性气体浓度，而好氧微生物则只需要通过不断搅拌提供无菌氧气。微生物对培养条件要求不如动植物细胞那样苛刻，玉米浆、蛋白胨、麦芽汁、酵母膏等成为良好的微生物天然培养基。对于一些特殊微生物的营养条件要求，可以在这些天然培养基的基础上额外添加
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原代细胞培养中常见的一些错误
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
原代细胞（primary culture cell）是指从机体取出后立即培养的细胞。原代细胞不仅广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究，如蛋白质组学、基因组学、细胞株（系）研究、DNA，RNA和遗传学研究等，还可应用于当今热门的生物医药产业如药物筛选、药物代谢和毒理研究、癌症药物的研究等。 原代细胞如何进行培养？ 常用的原代细胞培养有组织块培养和分散细胞培养。 分散细胞培养大致步骤为：将动物组织从机体中取出离散成单个细胞（常用胰蛋白酶），置合适的培养基中培养，使细胞 得以生存、生长和繁殖（注意整个过程无菌）。 组织块培养是将剪碎的组织块直接移植在培养瓶壁上，加入培养基后进行培养。 原代细胞培养中的常见错误及正确操作方法？ 错误＃1：一小管原代细胞在水浴中解冻一段时间 纠正＃1：原代细胞对解冻过程非常敏感，因此将小瓶置于37℃水浴中，保持并轻轻旋转直到内容物刚刚解冻是很重要的。然后应立即从水浴中取出小瓶，并转移到无菌操作台。确保您的培养瓶在解冻前已经准备就绪，以便可以立即用于接种细胞，并置于培养箱中。 错误＃2：解冻小瓶后直接离心原代细胞 纠正＃2：我们不建议在解冻后离心细胞，因为离心程序比少量的DMSO残留更有害。记住，在恢复原代细胞后的第二天更换培养基以去除任何残留的DMSO。 错误＃3：允许原代细胞变得过于融合 纠正＃3：当生长至100％汇合时，原代细胞可以变得衰老。记住，原代细胞不是100％纯，因此重要的是尽量减少污染细胞的生长。我们建议在细胞达到90-95％融合时，对原代细胞进行传代培养。 错误＃4：传代原代细胞时过度胰蛋白酶消化 纠正＃4：当细胞传代时，使用低浓度的胰蛋白酶并在显微镜下密切监测细胞。此外，记得在胰蛋白酶消化后完全中和细胞中的胰酶，因为任何活性的胰蛋白酶都将损伤细胞。推荐专门为原代细胞配制的胰蛋白酶中和溶液，但也可以使用10％血清或大豆胰蛋白酶抑制剂。 错误＃5：原代细胞可以很容易地重新冻存 纠正＃5：
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细胞培养的一些条件因素
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞培养（cell culture）是指在体外模拟体内环境（无菌、适宜温度、酸碱度和一定营养条件等），使之生存、生长、繁殖并维持主要结构和功能的一种方法。细胞培养也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。不论对于整个生物工程技术，还是其中的生物克隆技术来说，细胞培养都是一个不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或少分化的多细胞，这是克隆技术不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。细胞培养技术是细胞生物学研究方法中重要和常用技术，通过细胞培养既可以获得大量细胞，又可以借此研究细胞的信号转导、细胞的合成代谢、细胞的生长增殖等 环境因素 1．无菌环境 无毒和无菌是体外培养细胞的要条件。细胞在活体内，解毒系统和免疫系统可抵抗微生物或其他有害物质的入侵，但细胞在体外培养的过程中，缺乏机体免疫系统的保护而丧失对微生物的防御能力和对有害物质的解毒能力。为bao证细胞能在体外环境中生长繁殖，必须要确保无菌工作区域、良好的个人卫生、无菌试剂和培养基以及无菌操作。 常见的微生物污染有支原体、细菌、真菌。支原体无致死毒性，可与细胞长qi共存，对细胞有潜在影响，但体积小，不易鉴别，可借助于地衣红或Hoechst33342染色来进行检测。细菌增殖快，在短时间内即可大量扩增，并产生毒素杀死细胞。真菌的种类繁多，肉眼可见，漂浮于培养液面上，可呈丝状、管状或树枝状等。 2.合适的温度 一般哺乳类与禽类细胞在体外培养的适宜温度是37～38℃，不适宜的环境温度会影响细胞的生长。细胞对低温的耐受能力要强于对高温的耐受能力，在低温下，细胞的代谢活力及核分裂能力降低。若温度不低于0℃，虽然细胞代谢受到影响，但无损伤作用；25～35℃时，细胞以缓慢的速度生长；但若被置于40℃数小时，则不仅不利于细胞生存、生长，甚至可导致其死亡。 3.适宜的渗透压 高渗溶液或低渗溶液会引起细胞发生褶皱
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双抗和胰酶的使用方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
双抗 一、什么是双抗？ 青霉素加上链霉素，俗称“双抗”。 二、培养液中需要加入双抗吗？ 加不加双抗不是绝对的，视实际情况而定。 如果你实验室条件足够好，如果你操作足够规范，就尽量不要加双抗了。 相反，如果你实验条件不够，操作也没有绝对把握，还是加的好。 好的方法是做个实验对照，看有没有必要加双抗。 三、如何加双抗？ 加在DMEM里，因为如果是直接在换液传代滴加的话，那个双抗的浓度实在不好控制，如果加多了话对细胞毒性太大，如果担心时效，可以Z在培养液配好后分装于100ml的小玻璃瓶中，在每启用一瓶之前加，加了之后应尽快用完。 胰酶 一、胰酶使用的时候要注意什么？ 1、在使用胰酶细胞消化液的过程中要特别注意避免消化液被细菌污染。 2、胰酶细胞消化液消化细胞时间不宜过长，否则细胞铺板后生长状况会较差。 二、以贴壁细胞的消化为例： 1、吸去培养液，用无菌的PBS、Hanks液或无血清培养液洗涤细胞一次，以去除残余的血清； 2、加入少量胰酶细胞消化液，略盖过细胞即可，根据胰酶效率差异可以增加惑减少胰酶用量。室温放置30秒至2分钟（不同的细胞消化时间有所不同） 3、显微镜下观察，细胞明显收缩，并且肉眼观察培养器皿底部发现细胞的形态发生明显的变化呈白茫状；或者用枪吹打细胞发现细胞刚好可以被吹打下来。 4、此时吸除胰酶细胞消化液。加入含血清的完全细胞培养液，吹打下细胞，即可直接用于后续实验如果发现消化不足，则加入胰酶细胞消化液重新消化。 如果发现细胞消化时间过长，未及吹打细胞，细胞已经有部分直接从培养器皿底部脱落，直接用胰酶细胞培养液把细胞全部吹打下来。1000-2000g离心1分钟，沉淀细胞，尽量去除胰酶细胞消化液后，加入含血清的完全培养液重新悬浮细胞，即可用于后续实验。 常用的细胞消化液为胰蛋白酶（Trypsin），EDTA等，其功能主要是使细胞间的蛋白质（如细胞外基质）水解，改变细胞间的连接，使组织或细
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白细胞介素分为几种？有哪些应用？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
白细胞介素，最初指由白细胞产生又在白细胞间起调节作用的细胞因子，现指一类分子结构和生物学功能已基本明确，具有重要调节作用而统一命名的细胞因子，它和血细胞生长因子同属细胞因子。 主要功能： （1）刺激活化B细胞增殖，分泌抗体； （2）刺激T细胞增殖及CTL(细胞毒性T淋巴细胞)活化； （3）刺激肝细胞合成急性期蛋白，参与炎症反应； （4）促进血细胞发育。 白细胞介素-1 (IL-1) IL-1主要由巨噬细胞产生，此外几乎所有的有核细胞，如B细胞、NK细胞、体外培养的T细胞、角质细胞、树突状细胞、星形细胞、成纤维细胞、中性粒细胞、内皮细胞以及平滑肌细胞等均可产生IL-1。正常情况下只有皮肤、汗液和尿液中含有一定量的IL-1，绝大多数细胞在受到外来抗原或丝裂原刺激后才能合成和分泌IL-1。IL-1有两种不同的分子形式，一种称IL-1α,由159aa组成；另一种称为IL-1β，含153aa；两者由不同的基因分别编码。虽其氨基酸顺序仅有26%的同源性，然而IL-1α和IL-1β以同样的亲和力结合于相同的细胞表面受体，发挥相同的生物学作用。 白细胞介素2 (IL-2 ) IL-2是T细胞和NK细胞产生的15.5kD糖蛋白，在机体的免疫应答中起重要作用。IL-2zui重要的作用是诱导T淋巴细胞增殖（从G0期进入S期）和分化。人胸腺中的T细胞前体表达IL-2Rß并分泌低水平的IL-2，这种自分泌作用可促进胸腺细胞增殖。IL-2参与调节T细胞受体基因的重排和表达。IL-2能诱导NK细胞增殖，增强NK细胞的活性，诱导LAK细胞和TIL，并刺激它们产生细胞因子。高剂量IL-2能引起单核巨噬细胞增殖和分化，并增强单核巨噬细胞杀肿瘤细胞的作用。在体内，IL-2有抗肿瘤、抗微生物感染、引起移植排斥和自身免疫以及免疫调节等作用。 白细胞介素3 (IL-3) IL-3又称为多能集落刺激因子(Multi-CSF)，主要由活化的CD4+T细胞产生。其主要作用为促进骨髓中多能造血干细胞的定向分化与增殖，产生各种类型的血细胞。此外IL-3还可调节多种成熟细胞的生
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细胞培养时的一些注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞培养注意事项 1. 实验进行，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水 现在做细胞培养实验的实验室越来越多，如果打算开展或者已经开展的单位或者实验室更要做到以下几点。 1、选择正确的培养基 在养细胞之，就要了解，你所养细胞的来源以及种类和名称，查阅一定量的文献，确定所需培养液种类以及是否需要添加特殊成分，常用的细胞培养
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生物实验室胎牛血清使用问题汇总
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
血清在使用过程中，有很多的具体注意事项，现阐述如下： 1、血清的保存方法。 建议血清应保存在-5℃至-20℃。假如存放于4℃，请勿超过个月。若血清瓶次无法用完，建议无菌分装至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻，避免反复冻融。 2、在培养基中添加了血清和抗生素后，是否可以长期保存? 因为些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解，所以新鲜培养基中添加了血清和抗生素后，应该在两到三周内使用完毕。 3、如何解冻血清才不会使产品质量受损? 血清从冷冻箱取出后，先置于2～8℃冰箱融解，然后在室温下全融。解冻血清时，必须在融解过程中规则地摇晃均匀，使温度及成分均，减少沉淀的发生。 推荐在-20℃以下储存血清，并避免反复冻融。因为长时间储存在2-8℃时，血清中的各种蛋白和脂蛋白(如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等)可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。 请勿将血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。 4、血清解冻后为何会有絮状沉淀物出现，该如何处理? 沉淀包含纤维蛋白和脂蛋白。这是正常特性，这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。 血清中沉淀物的出现有许多种原因，但普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之)在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之。 去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以400g,1-2分钟稍微离心,上清液即可接着加入培养基内起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。 大多情况轻轻摇动沉淀并加热至37℃就会再溶解。所以，使用产品时要摇动并加热血清至37℃，沉淀会自然消失。 5、如何避免沉淀？ 按如下操作可避免沉淀的产生： 1)解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均，减少沉淀的发生。 2) 血清分装冻存时，须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均
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牛羊布病快速检测卡的原理和试验方法介绍
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
布鲁氏菌病(也称布氏杆菌病,简称布病)是由布鲁氏菌引起的以感染家畜为主的传染病,世界动物卫生组织(OIE)将本病列为必须通报的传染病之一。牛羊作为主要的基层畜产品养殖，及早发现解决牛羊布病，才能有效提升基层畜产品的整体质量安全。 牛羊布病快速检测卡采用胶体金免疫层析试验（GICA）原理制成，样本加入到加样孔后与胶体金标记物一起沿层析膜移动，若样本中存在羊布病抗体则与胶体金标记物及检测线上的抗原结合而显示紫红色，若样本中不存在羊布病抗体则不产生颜色反应。 试验方法： 1.用配套吸管吸取已准备好的样本，垂直而缓慢的滴加1滴血清或者2滴全血或者2滴奶样到样本稀释液中（注意：该步骤很关键，样本切不可多加），混匀后待用。 2.撕开检测卡铝箔包装袋，取出检测卡，放于平整、洁净的台面上,使用袋内吸管吸取步骤1得到的待测液2-3滴（约60ul）缓慢滴加到加样孔内。 3.室温下放置10-15分钟判断结果,15分钟后结果只作参考。
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细胞生长缓慢有哪些影响因素？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞生长缓慢是实验人员在培养细胞时常遇见的问题，那么究竟是哪些因素影响？又如何改善呢？ 一.个别人的培养体系出现问题 1.检查你所培养的细胞是否存在污染。 （a）如果培养细胞未添加抗生素(必须添加!),细胞污染则是不可避免的。 1）用肉眼和显微镜进行检查 2）如果细胞被污染则要弃掉。 （b）由于支原体污染不容易觉察到，因此必须定期检测 （c）检测可能污染的途径和原因 2.检查你用于培养细胞的培养基和血清(例如:是否批次不同或厂商不同)。如果你常规使用的是粉剂或10X储存液，而现在购买的培养基更换为1X液体，而随后证明问题就出自于此，处理方法请参见下则分享内容。 3.如果问题与培养基无关，那么很可能还是细胞的问题。 （a）复苏另一支冻存的细胞，并且与正在培养的细胞加以比较。两种细胞的培养应分开，以免在培养之初就产生污染。随后按（b）~ （d）步的方法做排查。 （b）对传代培养的细胞进行计数，并绘制生长曲线与以前培养该细胞的资料进行比较，检查是否有下列改变: 1）传代时是否接种密度过低。 2）细胞传代是否过于频繁。 3）传代前细胞平台期是否过长。 （c）是否更换了胰蛋白酶或其他分离剂的批号?检查批号和供应商。 （d）是否细胞分离过程中严重损伤了细胞?应检测: 1）胰蛋白酶(其他消化试剂)消化时间是否过长。 2）消化液的浓度和活性是否过高、过强。 3）胰蛋白酶消化时、孵箱温度是否过高。 4）吹打消化细胞时是否过于用力。 5）细胞是否对EDTA过于敏感(如果添加了EDTA)， 6）胰蛋白酶稀释是否有误。 7）是否使用了一批劣质的胰蛋白酶消化液。 二.问题较为普遍，其他人也遇到同样的困难 检查共用的设备和试剂 温室和孵箱温度 1.温度和温度设定不准。 （a）自动调温器损坏。 （b）开关孵箱门过于频繁。 （c）孵箱门未关紧。 (d)风扇损坏造成散热不均。 用便携式温度表重新标定孵箱温度。 2.孵箱湿度不能维持 （a）水盘中未加水， （b）孵箱有渗漏
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胎牛血清在细胞培养中起到的作用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
血清是一种很复杂的混合物，其组成成份虽大部分已为人所知，但还有一部分尚不清楚，而且血清组成及含量常随供血动物的性别、年龄、生理条件和营养条件不同而异。 1.蛋白质是牛血清中主要成份。除包括可携带金属离子、脂肪酸和自身是激素类蛋白外主要还有白蛋白，球蛋白。纤维粘连素细胞促进细胞附着；α2巨球蛋白抑制胰蛋白酶的作用；胎牛血清中含胎球蛋白促细胞附着；转铁蛋白能结合铁离子，减少其毒性和被细胞利用。 2.多肽：血小板促生长因子能促细胞分裂，是多肽家庭的主要成员，是主要的促细胞增殖因子；成纤维细胞生长因子、表皮细胞生长因子、神经细胞生长因子等，血清中含量虽很少，但对细胞生长也有一定作用。 3.激素：激素对细胞的作用是多方面的。胰岛素：促进细胞摄取葡萄糖和氨基酸，与促细胞分裂有关。类胰岛素生长因子：能与细胞表达的胰岛素受体结合，从而有胰岛素同样的作用。促生长激素：促细胞增殖效应。 4.其他成本：氨基酸、葡萄糖、酮酸等对多种营养成分的合成培养基意义不大。与蛋白相结合状态的微量元素对细胞培养有意义。 胎牛血清是一种性状、外观 浅黄色澄清、无溶血、无异物稍粘稠液体。胎牛血清应取自剖腹产的胎牛；新牛血清取自出生24小时之内的新生牛；小牛血清取自出生10－30天的小牛。 由于胎牛从未接触过外界， 与新生牛和小牛血清相比，抗体含量明显降低，故抗体与培养细胞发生交叉反应的风险也较低，是理想的细胞生长补充剂。本文缔一生物为您具体分析胎牛血清在细胞培养中的作用。 1. 提供对维持细胞指数生长的激素，基础培养基中没有或量很少的营养物，以及主要的低分子营养物。 2. 提供结合蛋白，能识别维生素、脂类、金属和其他激素等，能结合或调节它们所结合的物质活力。 3. 有些情况下结合蛋白质能与有毒金属和热原质结合，起到解毒作用。 4. 是细胞贴壁、铺展在塑料培养基质上所需因子来源。 5. 起酸碱度缓冲液作用。 6. 提供蛋白酶抑制剂，使在细胞传代时使剩余
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细胞培养实验中有什么需要注意的？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
细胞培养注意事项 1. 实验进行，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等之无菌操作台(至少Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目：5.1. CO2 钢瓶之CO2 压力5.2. CO2 培养箱之CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水 现在做细胞培养实验的实验室越来越多，如果打算开展或者已经开展的单位或者实验室更要做到以下几点。 1、选择正确的培养基 在养细胞之，就要了解，你所养细胞的来源以及种类和名称，查阅一定量的文献，确定所需培养液种类以及是否需要添加特殊成分，常用的细胞培养
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