德尔塔
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如何让细胞乖乖沉睡或满血复活

如何让细胞乖乖沉睡或满血复活

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

养细胞时期的小编, 常常希望自带一股开挂神力, 保护好娇弱的细胞,拯救惨不忍睹的实验! 如同《星球大战》里拥有 ”原力光环“的主角们, 可以隔空移物,手接闪电,最后拯救世界! 小编至今疑惑“原力”到底是什么?  “ I am one with the force , and the force is with me.” 翻译过来比较玄,很像中国武侠小说的内力~ “ 我与原力同在,原力与细胞同在 冻存的细胞,满血复活吧! ” 回    到    现    实 经常有用户反映“细胞冻存与复苏遇到了问题” “如何握住原力,让你的细胞乖乖沉睡又满血复活?” 逍鹏生物的老司机为此做了以下总结:  选 好 细 胞 冻 存 液 是 基 础 使用动物血清常常会遇到很多问题,例如:病毒感染、其他动物源的污染。使用无血清制品培养与冻存细胞,可以消除这方面的隐患。此外,无血清冻存液可以确保细胞在化学成分固定的条件下生长,更进一步确保细胞冻存时的条件稳定。 慢 慢 做 冷 冻 若您养的是贴壁细胞,请先将细胞消化下来;若是悬浮细胞,请直接按以下步骤进行: 1. 以200-300g离心3分钟,弃去上清,收集细胞。 2. 用BI无血清冻存液将细胞重悬(不需回温),将细胞密度调整为3~5x106 cells/ml,添加到冻存管中(一般每管1ml)。 3. 建议将含有细胞悬液的冻存管放进渐进降温盒或是保温杯中,置于-80°C冰箱6小时以上或是过夜(或不需要程序降温)。 4. 将冻存管迅速移到液态氮中保存。 5. 冻存24小时后,建议检测细胞存活率。 细 胞 复 苏 要 迅 速 1. 将细胞冻存管由液态氮中取出,置于室温回温,不用水浴溶解。此时可准备新鲜培养   基、无菌15ml离心管、培养瓶。 2. 在生物安全柜内,直接以少量培养基反复冲融,使细胞团块化冻。 3. 先在无菌15ml离心管中加入5ml培养基,再将化冻的细胞悬液加入离心管中。以200~300g,3分钟离心收集细胞。 4. 倒去上清液,重悬细胞,移到培养瓶中培养。 BI无血清细胞冻存液 不含动物成份 细胞冻存与复苏后,平均活细胞回收比例超过90% Serum-Fr

Field-based Phenotyping 大田高通量作物表型成像分析技术方案

Field-based Phenotyping 大田高通量作物表型成像分析技术方案

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

本专辑主要介绍大田(野外)作物高通量、无损伤表型组学研究技术方案,以满足野外大田作物不同实验研究、不同预算条件下作物遗传育种(如抗性筛选等)、表型分析与表型大数据建设、生理生态研究(如胁迫生理等)、种质资源保护与品种检测鉴定、病害预测预报等需求。          手持式、便携式仪器无疑是野外大田作物表型分析性价比高、使用灵活方便的设备,如手持式FluorPen叶绿素荧光仪、手持式SpectraPen/PolyPen高光谱仪、IQ智能手持式高光谱成像仪、FluorCam便携式叶绿素荧光成像仪、Thermo-RGB冠层温度与彩色成像融合分析技术等,多种仪器可以进行各种各样组合成技术方案进行配合使用,不仅可以在叶片水平上,而且可以在植物冠层水平上(如IQ智能手持式高光谱成像仪)进行大田作物/植物无损伤表型测量分析与生理生态研究。   野外大田高通量作物表型成像分析技术方案主要有以下技术及方案:   PhenoDATA®表型分析传感器技术   1、 Thermo-RGB可见光与红外热成像融合分析技术:用于成像分析作物冠层形态结构及温度动态、阴影效应等,包括覆盖度、阳光照射叶片(SL)占比、阴影叶片(ShL)占比、土壤(Soil)占比及相应温度信息(最高温度、最低温度、平均温度、温度频率直方图等),还可以分析测量叶片颜色和形态如长、宽、面积、长宽比等等。可升级为Thermo-NDVI红外热成像与多光谱成像融合分析。   2、 SpectraScan高光谱成像分析技术:包括400-1000nm、600-1640nm、900-1700nm、1000-2500nm、400-2500nm及MWIR中波段红外高光谱、LWIR长波段红外高光谱等高端高光谱成像技术,及不同算法数据分析处理技术方案,全方位、大数据、高灵敏度、非损伤分析作物生理生化及形态结构功能表型数据,如基于植物光谱反射指数的决策树、冠层光谱特征与区分技术、SAM/SID快速检测技术等等。   3、 SIF(阳光诱导叶绿素荧光)高光谱成像技术:由Specim公司与德国Juelich研究中心为欧洲太空局(ESA)地球探测项目(FLEX)研制

如何设计实验中的动物给药剂量

如何设计实验中的动物给药剂量

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

动物实验给药剂量的确定,想必是很多同学都会烦恼的问题。如对于未接触过药理的生物系同学来说常常会盲目追求药效,导致设计剂量过高,甚至超过毒性实验剂量,殊不知这样的结果其实没有任何临床参考意义;但若剂量偏低,又看不到药物疗效,因此在进行药物研发时,我们必须同时考虑药物的有效性和安全性,找到确保安全条件下的最佳药效的剂量范围。那下面我们就看看这个剂量是如何确定的呢? 合适的动物给药剂量,其实是不断摸索的过程,起初它不是某个具体数字,而是通过初步设计范围,然后通过多种实验的探究,去圈定最合适的区间或某个数值。 一、首先,我们需要了解与药物研发密切相关的几种动物实验 药物的有效性和安全性是评价药物的最重要的两个标准,因此药物研发阶段,药效和毒性评价的实验必不可少,主要分为以下几类: 1. 药效学实验 定义:药效学即药物效应动力学,研究药物对机体的作用及作用机制。内容包括观测生理机能的变化、测定生化指标的变化及观测组织形态变化。 目的:确定药物的**作用及一般药理作用,为新药临床实验提供可靠依据。 2. 急性毒性实验 定义:急性毒性是指24 h内单次或多次大剂量给予某药物所出现的有害作用,亦指机体一次性大剂量接受某种药物后所产生的快速而剧烈的中毒反应,包括死亡效应。 目的:①测定药物的半数致死量 (LD50) 及相关参数,初步估计该药物毒性大小;②通过观察药物的急性中毒症状,推测其毒性靶器官,为毒性作用机制分析及临床毒副反应监测提供依据;③为多次重复给药或长期毒性试验提供剂量设计参考。 3. 长期毒性实验 定义:长期毒性是指药物以一定的等级剂量连续多日给予受试动物所产生的有害作用,为观察这种有害作用而设计的毒理学实验。其与急性毒性实验的根本差异在于给药的期限、剂量范围不同,所观察的毒性效应不同。 目的:通过重复的动物实验表征受试药物的毒性作用,预测其可能对人体产生的不良反应,降低临

关于动物实验给药剂量的疑点解答

关于动物实验给药剂量的疑点解答

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

最近常常有同学问:对于一个新的化合物,我们已经在体外细胞或者离体器官上看到较好的药效,下一步就要进行动物体内试验,然而此时可以依据的往往仅有从细胞上的IC50数值,它可以外推到动物试验的给药剂量吗?另外在设置给药浓度时,我们看到大多数文献都是以2倍系数递增,这又是什么原理,是否可以适用于所有动物试验呢?本期小编就把这些常见疑点总结了一下,统一为大家解答! 疑点1:体外细胞试验数据真的可以估算出动物的给药剂量? 案例:如果知道一个小分子化合物在体外试验 (MTT) 对SGC7901细胞的IC50是20 µg/mL,现在需要做动物试验,把SGC7901细胞接种到裸鼠身上,等到它们长出肿瘤块之后进行灌胃给药,那么应该如何确定这个动物试验的给药剂量呢? 分析:关于这个问题,目前还没有明确的指导原则和公式进行参考。有人建议可以根据动物的体重、药物的生物利用度来进行换算。如,裸鼠的体重为25 g,药物的口服生物利用度为20%,细胞试验IC50为20 µg/mL,血液占体重的比例为8%,则可以计算出该药物在体内的EC50(有效中浓度)为0.2 mg,即给药剂量为8 mg/kg。EC50的计算公式如下:           答案:但是笔者觉得这种外推方法的参考价值不大,因为体内的环境比较复杂,影响因素比较多。比如血浆蛋白结合率、靶器官(肿瘤)中的药物浓度等对药效的发挥起到关键的作用,不能忽略。因此这种换算方式并不值得借鉴。 那么问题来了,若细胞试验数值不能直接换算到动物,对于一个新的化合物,且无参考数据的情况下,该如何确定给药剂量呢?关于具体的试验方法大家可以参考往期发表的一篇文章,如何确定动物试验的给药剂量?本期我们不再赘述!下面我们主要探讨一下剂量设置时的倍数关系。 疑点2:为何文献多用4:2:1来设计给药梯度? 案例:通过查阅大量文献,不难发现大多数文章中所报道的药效学试验一般都是三个剂量,即低、中、高浓度梯度(4:2:1),即按2倍递增,如下图为:检测药物MONCPT对异种移植瘤生长的影

离子通道系列科普——水通道蛋白(Aquaporin)

离子通道系列科普——水通道蛋白(Aquaporin)

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

1988年Agre在分离纯化红血球细胞膜上的Rh血型抗原时,发现了一个疏水性跨膜蛋白,称为CHIP28,1991年,Agre将CHIP28的mRNA注入非洲爪蟾卵中,在低张溶液中,卵迅速膨胀,并于5 分钟内破裂,纯化CHIP28置入脂质体,也得到同样结果。细胞这种吸水膨胀现象会被Hg2+抑制,而这是已知的抑制水通透处理措施。这一发现揭示细胞膜上确实存在水通道,Agre因此与离子通道的研究者Roderick MacKinnon共享2003年诺贝尔化学奖。  水通道蛋白,又称水孔蛋白,是位于细胞膜上的蛋白质,可协助水的跨膜运输。水分子在没有水通道蛋白协助的情况下可以缓慢的跨膜扩散,而水通道蛋白可以使水分子快速地流出或流入细胞膜,帮助细胞调整内渗透压。  水通道蛋白主要大量存在于哺乳动物的肾脏,也存在于植物中。目前研究最多的是水通道蛋白1,水通道蛋白2,水通道蛋白3和水通道蛋白4。  水通道蛋白1(AQP1)的作用主要是肾脏中的水分重吸收,位置分布在肾脏近端小管曲部、近端小管直部、亨利氏环下降细端的顶部和底外侧细胞膜。水通道蛋白1同样存在于红细胞、血管内皮、胃肠道、汗腺及肺部。  水通道蛋白2(AQP2)的功能主要是在抗利尿激素的作用下对水分进行重吸收,位置分布于肾脏中的初始集合管、皮质集合管、外髓质集合管和内髓质集合管的顶部细胞膜。水通道蛋白2在接收到抗利尿激素的信号之前储存在小泡的膜上,接收信号之后会移动到细胞膜上形成通道,从尿液中重吸收水分。 水通道蛋白3(AQP3)的作用是重吸收水和甘油,位置分布在肾脏髓质集合管的底外侧细胞膜。分布在皮肤角质细胞的水通道蛋白3负责调节皮肤的含水量,伤口愈合以及肿瘤形成。水通道蛋白3同时也出现在未成熟的免疫系统树突细胞和红细胞中。 水通道蛋白4(AQP4)的主要功能是对肾脏中水分重吸收,分布在肾脏髓质集合管的底外侧细胞膜。中枢神经系统的星形胶质细胞也表达水通道蛋白4,负责控制细胞水流。  您的科研伙伴艾美捷科技为您推荐StressMarq生产的多种水通道蛋白多

如何选择合适的算法确定常用的阳性药物的给药剂量

如何选择合适的算法确定常用的阳性药物的给药剂量

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

前言 一个药物几天给药一次,给药多久结束,我想这应该是常常被忽略的问题。大多数的我们常会根据师兄师姐的经验或者参考文献,粗糙的确定这种药物的给药频率或者周期,却不知给药时间需要科学的方法来确定,如受试物的药代动力学特点、毒性反应等!本期,我们就一起看看药物的给药时间究竟是设置3h,1天或是1个周?   首先,我们先看看药物在体内的过程(ADME) 如下图所示,药物的体内过程是指药物经过各种给药途径(如静脉注射、静脉滴注、口服给药等)进入直至排出机体的过程,包括药物的吸收(absorption)、分布(distribution)、代谢(metabolism)和排泄(excretion),即ADME四个基本过程。 图1. 药物的体内过程图 药物动力学是一门用数学分析手段来处理药物在体内的动态过程的学科,可以定量地描述与概括机体中药物动态变化规律。根据药代动力学特点,药物在血浆的浓度随着时间的推移而发生变化,即为时量曲线,如下图所示: 图2. 药物的时量曲线 给药频率和周期一般都是建立在药代动力学的基础上来科学设置!下面就仔细看看! 一、受试药的给药频率如何设置呢? 根据上述药代动力学特点和时量曲线得知,药物在体内的浓度一直处于动态变化的,因此为了维持药物疗效,通常采用多次给药以保持有效血药浓度。血药浓度需要维持在**窗之内(即有效浓度和中毒浓度之间),而药物半衰期是决定给药次数和间隔的重要参数。 1. 何为**窗? 最低有效浓度MEC<药物浓度<最低中毒浓度MTC,在这两个浓度之间限定一个合理**区域,常称为"**窗"(或称为**范围),它对评价一个新药的安全性和有效性十分重要。如下图为**窗示意图:    图3. 药物的**窗示意图 (血管外给药,Cmax:达峰浓度  tmax:达峰时间) 2. 药物半衰期(t1/2) 药物半衰期是指血浆药物浓度下降一半所需要的时间,即药物消除一半所用的时间。在某种特定剂量范围中大部分药物消除速度为一级,所以能够利用K(消除速率常数--单位时间化合物消

如何利用药代力动学确定给药时间

如何利用药代力动学确定给药时间

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

细胞凋亡、细胞计数都会用到细胞染色 今天我们就聊聊: 新手入门 如何轻松搞定细胞染色, 给你的细胞一个精致瑞丽的妆容? 细胞骨架的荧光染色 台 盼 蓝 染 色 台盼蓝染色是细胞培养常见的实验,用于细胞计数,检测细胞活性。健康的正常细胞能够排斥台盼蓝,而死亡的细胞,膜的完整性丧失,通透性增加,细胞可被台盼蓝染成蓝色。   小鼠胚胎干细胞台盼蓝染色 三步轻松搞定台盼蓝染色: 1、胰酶消化贴壁细胞,制备单细胞悬液,并作适当稀释(106 细胞/ml)。 2、染色:细胞悬液与0.4%台盼蓝溶液以9:1混合混匀。 3、计数:在三分钟内,用计数板分别计数活细胞和死细胞 。  台盼蓝染色看起来so easy,但新手入门还是需要注意: 1、染色时间不能太长,否则活细胞也会逐渐积累染料而染成颜色,使检测结果偏离。 2、可结合细胞计数方法,同时进行细胞计数和活力检测。 3、有潜在致癌危险,为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作。 BI台盼蓝染液   细胞免疫荧光染色 荧光显微镜技术,不仅用于研究蛋白结构,对细胞凋亡检测也具有重要意义。常用的包括:Hoechst、碘化丙啶(Propidium-Iodide,PI)、annexin-v、JC-1、钙黄绿素-AM等方法。 hoechst染色,紫外光下核染为蓝色 hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合,有hoechest33342和hoechst33258两种,区别不大。但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些,所以一般hoechsts33258用于细胞固定后再染色,而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色! 用PI单一染色观测培养细胞,只能表示细胞的坏死情况,而不是凋亡(当然晚期凋亡PI亦可着色)。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况,而不是仔细区分坏死或凋亡,那么PI单一染色也可以。 JC-1染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1~5mg/ml),储存于-20℃,用时以培养液稀释至10ug/ml 终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液,漂洗细胞后直接加入染色液,10~30 min后在荧光显微镜下

手把手教您给细胞染色

手把手教您给细胞染色

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

本期我们想说说悬浮细胞 比起贴壁细胞,悬浮细胞不需要消化 养起来更方便、省心 但也没那么简单 总是会遇到一点问题: 为什么总是出现死细胞, 说好了传代很easy的, 冷冻、复苏又出现问题了! 关于悬浮细胞,你知道多少? 悬浮细胞生长不依赖支持物表面,在培养液中呈悬浮状态。 悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞或血液系统来源的细胞(如人胃癌细胞SNU-5,小鼠白血病细胞WEHI-3, 人白血病细胞K-562, HL-60),这种细胞体积小,它们天生就生活在悬液(血液)中。由于缺乏黏附分子的表达,在培养基中呈现悬浮状态,细胞大体呈球形或椭球型。 图为K-562细胞,来源于ATCC 关于悬浮 de 传代 1. 悬浮细胞无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离,整个过程较为迅速,对细胞的损伤也较小。通常有两种方法: 直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基,然后分装。 先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基,再用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀。 2. 至于何时传代,最准确的是根据细胞密度来确定。传代最大细胞密度随细胞系不同而有所差异,ATCC细胞库里提供的细胞培养信息,里面有培养条件选项,会详细说明细胞的接种密度和培养密度,有的还有图片或参考产品使用手册。 如何有效去除死细胞? 细胞复苏或培养过程中常会出现死细胞和细胞碎片,可通过低速离心的方法去除死细胞或细胞碎片,死亡细胞的碎片会留在上清中,即可除去。不同细胞离心力可能不一样,可以先试一下300×g~500×g这个离心力,如果能离下大部分细胞就行,如果一点细胞都离不下来就适当加大离心力和时间。  BI教您做好悬浮细胞的冻存和复苏  悬浮细胞的冻存和复苏与贴壁细胞基本一致: 1. 冻存 我们推荐使用BI的无血清冻存液,直接按以下步骤进行,操作更加方便,平均活细胞回收比例超过90%: 以200×g-300×g离心3分钟,弃去上清,收集细胞。 用BI无血清冻存液将细胞重悬(不需回温),将细胞密度调整为3~5x106 

怎么养好悬浮细胞培养

怎么养好悬浮细胞培养

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

本期我们想说说悬浮细胞 比起贴壁细胞,悬浮细胞不需要消化 养起来更方便、省心 但也没那么简单 总是会遇到一点问题: 为什么总是出现死细胞, 说好了传代很easy的, 冷冻、复苏又出现问题了! 关于悬浮细胞,你知道多少? 悬浮细胞生长不依赖支持物表面,在培养液中呈悬浮状态。 悬浮培养的细胞一般为淋巴细胞或血液系统来源的细胞(如人胃癌细胞SNU-5,小鼠白血病细胞WEHI-3, 人白血病细胞K-562, HL-60),这种细胞体积小,它们天生就生活在悬液(血液)中。由于缺乏黏附分子的表达,在培养基中呈现悬浮状态,细胞大体呈球形或椭球型。 图为K-562细胞,来源于ATCC 关于悬浮 de 传代 1. 悬浮细胞无需通过酶的作用使其从培养容器表面脱离,整个过程较为迅速,对细胞的损伤也较小。通常有两种方法: 直接给带传代的培养瓶中补充一定量的新鲜培养基,然后分装。 先通过离心弃掉营养匮乏的旧培养基,再用适量的新鲜培养基重悬细胞沉淀。 2. 至于何时传代,最准确的是根据细胞密度来确定。传代最大细胞密度随细胞系不同而有所差异,ATCC细胞库里提供的细胞培养信息,里面有培养条件选项,会详细说明细胞的接种密度和培养密度,有的还有图片或参考产品使用手册。 如何有效去除死细胞? 细胞复苏或培养过程中常会出现死细胞和细胞碎片,可通过低速离心的方法去除死细胞或细胞碎片,死亡细胞的碎片会留在上清中,即可除去。不同细胞离心力可能不一样,可以先试一下300×g~500×g这个离心力,如果能离下大部分细胞就行,如果一点细胞都离不下来就适当加大离心力和时间。  BI教您做好悬浮细胞的冻存和复苏  悬浮细胞的冻存和复苏与贴壁细胞基本一致: 1. 冻存 我们推荐使用BI的无血清冻存液,直接按以下步骤进行,操作更加方便,平均活细胞回收比例超过90%: 以200×g-300×g离心3分钟,弃去上清,收集细胞。 用BI无血清冻存液将细胞重悬(不需回温),将细胞密度调整为3~5x106 

植物蛋白酶体和自噬研究的抗体的作用

植物蛋白酶体和自噬研究的抗体的作用

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

蛋白酶体是催化蛋白酶的大的多亚基,负责大部分细胞质和核蛋白降解,并且它们的结构和功能在真核生物中是保守的。蛋白酶体最初被鉴定为泛素依赖性蛋白水解途径的蛋白水解模块。 植物细胞含有26S和20S蛋白酶体的混合物,其分别介导泛素依赖性和泛素非依赖性蛋白水解。26S蛋白酶体是一种ATP依赖性蛋白酶,它负责许多重要细胞调节因子的降解,特别是那些与多种泛素结合的蛋白酶。26S蛋白酶体含有20S蛋白酶体和一个或两个调节颗粒,这是泛素依赖性降解所必需的。 已有研究表明拟南芥26S蛋白酶体生物发生的减少会导致热休克超敏性和降低细胞分裂速率,其通过增加的细胞扩增来补偿。26S蛋白酶体功能的丧失还导致20S蛋白酶体生物发生增加,其反过来增强细胞降解氧化蛋白的能力,从而增加氧化应激耐受性。 自噬是真核生物中主要的细胞降解途径。研究揭示了自噬在植物生命的许多方面的重要性,包括幼苗建立,植物发育,抗逆性,新陈代谢和繁殖。这证明了自噬在恶劣环境条件下进行大量降解的双重能力,同时高度选择性地靶向特定区域和蛋白质复合物以调节关键的细胞过程,即使在有利的生长条件下也是如此。细胞成分被输送到液泡中使其能够循环利用,尤其是在压力下影响植物代谢组。 艾美捷科技作为专业的生命科学领域解决方案供应商,为您推荐Agrisera品牌的植物蛋白酶体、自噬和泛素样蛋白等相关研究的抗体。 植物蛋白酶体相关抗体整理如下:   产品名称 产品货号 反应种属 应用类型 PBA1 | 20S proteasome beta subunit A1 AS19 4260 拟南芥、玉米 WB PAC1 | 20S Proteasome alpha subunit C1 AS19 4258 拟南芥 WB PBF1 | 20S proteasome beta subunit F-1 AS19 4261 拟南芥 WB PAG1 | 20S Proteasome alpha subunit G1 AS19 4259 拟南芥 WB RPT2a | Regulatory particle triple-A ATPase subunit 2a AS19 4262 拟

Circulation│c-kit 细胞对成体心肌细胞贡献的再评价

Circulation│c-kit 细胞对成体心肌细胞贡献的再评价

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

7月8日,国际学术期刊Circulation在线发表了中国科学院生物化学与细胞生物学研究所周斌研究组与中国医学科学院阜外医院心血管疾病国家重点实验室聂宇课题组的最新科研成果“Reassessment of c-Kit+ Cells for Cardiomyocyte Contribution in Adult Heart”。 该研究利用双同源重组系统(Cre-loxP和Dre-rox)构建了两个可以有效标记Kit+细胞且不影响内源Kit基因表达的小鼠模型,并利用这些模型对Kit+的心脏干细胞(CSCs)是否参与成体心肌细胞的生成进行了探讨。   研究结果显示,无论心脏处于稳态或损伤状态下,都不会参与新生的心肌细胞的生成。  南模生物为该研究构建了Kit-2A-Cre、Kit-IRES-Cre和Tnnt2-DreER这三个小鼠模型。 限于之前的小鼠模型无法有效追踪CSCs的命运,Kit+ CSCs是否具有肌源潜能一直存在争议[1-3]。 去年发表在Nature上的一篇文章对已有的Kit-Cre模型进行了总结,并概括了现有模型的两大缺陷:1)构建时同源重组酶Cre取代了内源Kit基因的表达,从而引发单倍体不足(haploinsufficiency),即单个Kit等位基因不足以维持其正常功能;2)无法标记Kit表达量低的细胞。 为了解决Kit+ CSCs是否具有肌源潜能这一问题,本研究另辟蹊径,构建了2个全新的Kit-Cre工具鼠品系(Fig.1)。为了避免对c-Kit基因产生影响,研究人员选择将Cre插入到Kit的最后一个外显子后,并通过2A或者IRES元件分隔,从而实现与内源Kit共同表达的目的。   Fig.1 Schematic figure showing knock-in strategies for Kit-2A-Cre or Kit-IRES-Crealleles by homologous recombination.   Kit2A-Cre/2A-Cre 和 KitIRES-Cre/IRES-Cre纯合子小鼠可以正常存活至成年,检测野生型、纯合子、杂合子小鼠在大小、体重以及心脏大小、体重占比、功能等生理指标均没有差别,并且Kit在纯合小鼠中表达完整(Fig.2)。   Fig.2 Immunostaining for c-Kit on heart sections show its expression in tissues ofall groups (12–16W). 为了确定同时标

蓝靛果种苗组培快繁技术规程

蓝靛果种苗组培快繁技术规程

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

蓝靛果种苗组培快繁技术规程!   ⒈蓝靛果 [Lonicera edulis Turcz.]别名蓝靛果忍冬、蓝果忍冬、蓝果,俗称山茄子、羊奶子、黑瞎子果,为忍冬科忍冬属多年生落叶小灌木,果实为蓝色小浆果,具有很高的食用与保健价值。  ⑴植物组织培养 在无菌条件下,将离体的植物器官、组织、细胞或原生质体等,培养在人工培养基和人工控制的环境中,使其再生新植株的过程和技术。(GB/T 16620) ⑵外植体 用于植物组织培养的离体植物器官、组织、细胞以及原生质体等。  ⑶培养基 根据植物营养原理与植物组织培养的要求人工配制的营养基质。 ⑷培养基母液 按试剂种类和性质分别配制的高于培养基配方浓度的溶液。  ⑸植物生长物质 调节植物生长发育的物质,包括植物激素和植物生长调节剂。常用的植物生长物质有生长素类似物IBA(吲哚丁酸)、6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)、NAA(萘乙酸)、KT(激动素)等。 ⑹外植体灭菌 将外植体表面的微生物彻底杀死并尽可能少伤害外植体组织和表层细胞的过程。  ⑺接种 将灭菌后的外植体在无菌条件下接入培养容器内的培养基中的过程。 ⑻诱导培养 将灭菌后的外植体接种到诱导愈伤组织等器官培养基中进行培养的过程。 ⑼继代培养 培养过程中将培养材料周期性地分株、分割等操作后,转接入新鲜培养基中继续培养的过程。 ⑽生根培养 将不定芽转移到生根诱导培养基中诱导生根,生成完整植株的过程。 ⑾移栽 组培苗在培养瓶中长出一定数量的根或根原基后,从瓶中取出移植到基质中的过程。   ⒉实验设备 ⑴灭菌设备 高压蒸汽灭菌锅、紫外灯。 ⑵接种设备 超净工作台、枪式镊子、眼科用解剖剪、解剖刀、酒精灯等。 ⑶培养设备 培养容器瓶(罐头瓶)、培养架、空调、照明灯管。 ⑷实验设备 电子天平(0.01mg)、冰箱、pH 5.0~7.0精密试纸、酸度计、温湿度表、照度计、烧杯、试剂瓶、量筒、容量瓶、移液枪等。   ⒊环境设备消毒灭菌 ⑴接种室消毒灭菌 接种前用紫外灯照射30min,每周用高锰酸钾及甲醛混合薰蒸。 ⑵培养室消毒灭菌 每

如何分辨细胞老化以及应对方法

如何分辨细胞老化以及应对方法

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

常有用户提到细胞状态不好, 比如细胞不再透亮, 内部很多细碎的小黑点, 细胞形态不规则, 培养液变黄 ....... 你的细胞又不舒服了, 我们建议 除了考虑血清和细菌污染的问题, 也不要忽视细胞老化 1 细胞老化有哪些表现?   1.细胞老化最开始的现象通常为细胞内部会出现空泡(可能是凋亡小体),也可能会出现黑点,大多沿细胞周边排布,内部中间也可能会显现一些,但相对周边为少。 2.老化以后的细胞会出现立体感慢慢消失,开始成扁平状,细胞与细胞之间的间隔减小或混在一起,细胞不再是梭形,而会成为各种不规则形状。 3.细胞折光性变差,镜下可见细胞“变薄”,做转染实验时,细胞死亡率会较高。但培养液不会发生迅速变黄的现象,仍清亮。(但如果是细菌污染的话,一般会出现培养液的迅速变黄,混浊,镜下可见大量繁殖的细菌;若是支原体污染的话,细胞也会失去正常形态,会有细胞的死亡)。 4.细胞的贴壁性减弱,开始有细胞漂浮于培养液中。 5.老化的细胞,表面分泌物会增多,细胞表面的纯净度越来越低。 6.分裂的细胞数量明显的减少同时细胞的增殖速度也会大大下降。  7.细胞开始长角分化。 图1 HEK293细胞                  图2  MSC细胞 图1  实心箭头指示的是发生细胞老化的HEK293细胞,SA-β-gal染色阳性,而空心箭头指的是未发生老化的细胞。图2  被染上蓝色的是发生老化的MSC细胞, 未被染色的是未发生老化的细胞。 由图片可以看出老化细胞体积增大、细胞扁平。   2 细胞老化,可能有这些原因? 1.在体外传代次数太多或太久 2.培养液营养不够 3.接种密度不当 4.培养液pH偏离   3 如何预防细胞老化? 防止细胞老化最主要还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种,特别是传代,不能等细胞太密了之后传,一般细胞建议长到70%融合度传代**。 换培养液应该根据自己细胞消耗培养基的情况来确定是否该换。如果感觉时间不好把握的话就多培养几瓶细胞,在不同的时间换液,最后再来比

HPLC和LC/MS缓冲液选择指南:为什么要控制PH值?

HPLC和LC/MS缓冲液选择指南:为什么要控制PH值?

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

HPLC和LC/MS 缓冲液选择指南:为什么要控制PH值?   适用于HPLC和LC/MS的缓冲液 如果样品中含有离子化化合物,对于反相HPLC(RP-HPLC)分离,流动相pH值可作为控制保留的最重要的变量之一。 然而,如果控制不当,pH值也可能诱发诸多问题。 由于经RP-HPLC分析的大多数化合物含有一个或多个酸性或碱性官能团,因此大多数流动相需要控制pH值。 基于此,缓冲液的使用非常广泛。本手册为实际操作的色谱分析人员重点介绍了流动相pH值的一些重要方面。   为什么要控制PH值?   图1表明,如果存在离子化化合物,则需要控制pH值。 如果酸性溶剂pKa上下浮动超过2个pH单位,则至少99%的部分将分别离子化或非离子化。 低于其pKa时,碱基将被离子化;而超过其pKa时,将被非离子化。 非离子化形式将具有较小的极性(更疏水),因此在反相体系中能够更加有效地保留下来。 所以,pH值较低时,会保留更多的酸性(图1a),而在高pH值下,会保留更多的碱性(图1b)。     为什么要控制PH值? 如果流动相pH值接近pKa值,那么即便pH的变化极为微小,也会导致保留情况的巨大变化,因此,这不适合稳定分离。 图2a说明了部分化合物对pH的微小变化极为敏感。0.1个pH单位的变化就会导致分辨率两倍的变化,这是许多实验室常见的pH调节误差量。 图2b显示了酸性、碱性和中性化合物pH值与保留情况的关系。 pH为3时,其保留情况比pH为5时更加敏感(对于酸性),而对于碱性,则pH需要大于等于6。而且,当pH接近pKa时,保留时间将不稳定;如果存在类似结构的化合物,相应的峰值间距(选择性)会发生改变。 图2 流动相pH值的微小变化对分离的影响。 (a)碱性分析物:对氨基苯甲醚、间甲苯胺、对氯苯胺、间氨基苯甲腈(按保留次序);27:73甲醇/磷酸盐缓冲液。 (b)酸性(酸):水杨酸;碱;甲基苯丙胺;中性;非那西丁。 在选择流动相pH时还应考虑的另一个因素是色谱柱的稳定性。 一般来说,硅基色谱柱应在2 pH大于8时,硅胶

3种提取工艺制备的参麻益智方对血管性痴呆大鼠药理作用的比较研究

3种提取工艺制备的参麻益智方对血管性痴呆大鼠药理作用的比较研究

作者:德尔塔 日期:2022-04-18

【摘要】目的: 比较3种提取工艺制备的参麻益智方对山莨菪碱所致血管性痴呆模型大鼠学习记忆能力、脑组织病理形态及血脂、氧化应激、炎症因子、胆碱能系统等主要药效学指标的药理作用。方法清洁级S大鼠60只,随机分为6组,每组10只。3种不同工艺制备的参麻益智方组,分别给予参麻益智方1号方、2号方和3号方2.97g/(kg·d);阳性对照药组给予盐酸多奈哌齐片0.45mg/(kg"d);空白组和模型组均给予等体积纯净水。给药4周末,除空白组外,其他各组分别注射盐酸消旋山莨菪碱注射液2mg/kg。水迷宫测试大鼠学习记忆能力,腹腔麻醉后取脑组织检测海马CAI区病理形态,取血清检测血脂四项及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-PX)、丙二醛(MDA)、白介素B(I1β)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、一氧化氮(NO)、乙酰胆碱(λch)、乙酰胆碱酯酶(AchE)等主要药效学指标。结果与模型组比较,参麻益智方3组均可显著降低大鼠总胆固醇(TC)水平(P