-
数字PCR应用及前景
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
剖析|你想要知道的数字PCR应用及前景 一． PCR的发展历史 PCR技术自问世以来，在遗传病、病原体、癌基因等分子诊断领域和法医鉴定等方面发挥了巨大作用。第一代 PCR在进行扩增后通过凝胶电泳进行定性分析。 随着生物分子荧光技术的发展，1992年实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR, qPCR) 应运而生。qPCR是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质荧光强度来测定每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以Ct值也就成为定量的依据。基于荧光探针或染料的第二代 PCR 技术随后逐渐发展为检测核酸目标片段的主流分子诊断学技术。 在实时定量 PCR（qPCR） 过程中，荧光信号随着扩增产物的积累而增强。qPCR 能够实时获得模板扩增的荧光值，然后根据DNA 模板在指数增长时期的 Ct 值与标准 DNA 的Ct值比较来计算初始模板的浓度。但是这种方法由于是大体积反应系统，非特异性的扩增增加了假阳性结果和背景信号，因此，最终无法获得绝对定量的结果。 随着MEMS工艺的不断成熟和微流控技术的不断发展，新一代PCR技术，数字PCR(digital PCR, dPCR) 也随之出现。digital PCR是一种新的绝对定量PCR，主要是对PCR反应物进行有限稀释，随后在不同的反应腔室里进行PCR扩增，最后根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例得出靶分子的起始拷贝数或浓度的技术。 图1. PCR技术的发展历程 二． 数字微流控（dPCR）的原理 20 世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。 dPCR是一种核酸分子绝对定量技术。 dPCR一般包括两部分内容，即PCR扩增和荧光定量分析。 在PCR
-
随着测序技术的不断快速发展，PCR测序方法你知道几种？
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
自从 Sanger等(1975)引人双脱氧核苷三磷酸( ddNTP)作为链终止剂,DNA序列测定技术得到迅速发展。 ddNTP在DNA聚合酶作用下,通过其5三磷酸基团可以掺入到正在延伸的DNA链中,但由于其脱氧核糖3位置缺少一个羟基,因此不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键,使得DNA链的延伸被终止。根据此原理,在DNA合成反应混合物的4种dNTP中加入一定比例的一种 ddNTP,dNTP参与的链延伸将与ddTP参与的链终止发生随机竞争,最终反应产物是一系列的寡核苷酸链,其长度取决于从用以起始DNA合成的引物末端到出现过早链终止的位置之间的距离。在4组独立的酶反应中分别采用4种不同的dNTP,结果将产生4组寡核苷酸链,它们将分别终止于模板链的每个A、C、G或T的位置上,通过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。 PCR测序根据标记的方式不同和循环的次数不同可分为直接测序法和循环测序法。 直接测序法 一、原理 PCR扩增获得双链DNA产物经变性形成单链,测序引物与其中一条模板链上的互补序列退火。退火的引物在低进行性反应条件下(如低温和低dNTP浓度),通过DNA聚合酶催化作用延伸20~80个核苷酸;由于此反应体系中掺入放射性标记的dNTP,能使新合成的DNA链中含有多个放射性标记,便于产生高放射显影度。标记的DNA链在高进行性反应条件下,通过DNA聚合酶催化进行延伸,通过在反应体系中掺入 ddNTP,使链延伸反应终止。反应产物经过电泳分离和放射自显影,就可以进行序列判读。 二、材料 (1)DNA模板PCR产物离子交换色谱纯化,作为DNA模板,浓度为:0.01~0.1mmol/L。 (2)引物20个核苷酸的DNA引物可以不经过纯化,直接用作测序引物,引物浓度 l mmol/L (3)DNA聚合酶要求该酶在低温条件下仍具有活性,以便有效地在新合成的DNA链中掺入放射性标记。比如USB/ Amersham公司生产的测序酶2.0。 (4)测序反应缓冲液根据测序酶具体而定,如测序酶2.0的反应缓冲液可用40mmol/LTris-HCl(pH7. 5), 20mmol/L MgCI, Fl 50mmol/L NaCl. (5)放射性
-
锂矿中锂量分析解决方案—锂量的测定 火焰光度法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
锂的存在形式和全球分布 锂为稀碱元素之一，在自然界分布比较广泛，是一种重要的能源金属，它在高能锂电池、受控热核反应中的应用使锂成为解决人类长期能源供给的重要原料。不仅仅如此，锂系列产品广泛应用于冶炼、制冷、原子能、航天和陶瓷、玻璃、润滑脂、橡胶、焊接、医药、电池等行业。 锂提取的矿物原料主要是锂辉石(含Li2O5.8%～8.1%)、锂云母(含Li2O3.2%～6.45%)、磷锂铝石(含Li2O7.1%～10.1%)等，产物主要是碳酸锂、氢氧化锂、磷酸铁锂、铬酸锂、氯化锂、氟化锂、钴酸锂、锰酸锂、镍钴锰酸锂等等。 全球对锂系列产品需求不断增大，中国作为全球产量最大的三个国家之一，也是亚洲唯一有锂矿资源的国家，锂储量占全球的25.7%。为了充分利用可开采的资源，提高产出效率，国家相关部门制定了一些相关标准。 解读YS/T1028.2-2015 磷酸铁锂主要用于各种锂电池的正极材料，我们以YS/T1028.2-2015《磷酸铁锂化学分析方法 第二部分：锂量的测定 火焰光度法》为例，来解读锂含量的测定方法和注意事项。 该标准中明确锂的测试范围为3%-5%，相当于30000ppm-50000ppm,针对如此高的锂含量标准中对样品进行了逐级的稀释，以达到合适的上机浓度。根据标准中锂质量分数的计算公式得出磷酸铁锂中锂含量为5%时上机浓度为10μg/ml(10ppm),相当于对样品稀释了5000倍，巨大的稀释倍数决定了上机读数一定要很准确，否则测量结果偏差会很大。所以标准中也规定：“独立地进行两次测定，取其平均值。” 在样品高浓度下，而大部分火焰光度计有效的测量范围又很小，只能通过对样品进行高倍的稀释才能测得锂的浓度。这些都是为了能够并且尽可能准确的测得锂的含量。 锂矿中锂含量测定解决方案 利用火焰光度计进行锂矿中锂的测定时，用户常常面临数据准确性不高、重现性不好的困惑。由于锂系列产品中锂的测定的结果对于锂矿行业研发和质量控制意义重大，故我们推荐如下解决方案： 英国BWB设计制造的BWB-LI四通道锂火焰光度计具
-
人脐静脉内皮细胞的形态学观察和鉴定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
人脐静脉内皮细胞爬片准备：细胞换液后直接在倒置显微镜下观察细胞的形态及生长特征，并作相差摄影，同时进行常规HE染色观察并摄片。鉴定采用DAB免疫组织化学法，在6孔培养板中放置载玻片，在玻片上植入2ml含有1×106的细胞悬液，待细胞贴壁后，取出载玻片，放入-20℃的冷丙酮中固定30min,用PBS冲洗3次，每次2min,滴加3%H2O2室温孵育10min，PBS冲洗3次，每次2min,以消除内源性过氧化物酶的活性。滴加兔抗人Ⅷ因子相关抗原多抗工作液，放入湿盒内4℃过夜，同时另一盖玻片不加一抗作阴性对照。次日，用PBS冲洗3次，每次2min,滴加辣根酶标记的羊抗兔IgG, 37℃孵育30min, 用PBS冲洗3次，每次2min,用DAB底物混合工作液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后，终止显色，进行复染，脱水，透明，封片，相差显微镜下观察摄影。 人脐静脉内皮细胞（Sciencell #8000）的形态学观察：相差倒置显微镜下观察，人脐静脉内皮细胞贴壁单层生长，呈短梭状或铺路石样镶嵌排列，细胞为扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富。胞核清晰可见，为圆形或椭圆形。原代培养细胞，于接种后2h开始贴壁生长，传代细胞约半小时后即开始贴壁生长。原代细胞一周左右可长满，传代细胞生长旺盛，有时可见多核细胞。 Ⅷ因子相关抗原免疫组化鉴定：人脐静脉内皮细胞（Sciencell #8000）Ⅷ因子相关抗原免疫组化染色可见细胞呈圆形、梭形或多边形，胞浆内可见棕黄色颗粒，核周密集，而对照组内未见着色。证实培养的细胞为内皮细胞。 北京裕恒丰科技有限公司作为第一家引进美国ScienCell 原代细胞等细胞产品的领头人，为国内各大院校、科研机构提供了高质量的、价格公道的进口原代细胞，并为每一种原代细胞搭配适合自己的培养基，并且培养基中包括生长因子、高质量胎牛血清、双抗，试验中当时混匀即可，操作简单快速，促进了原代细胞的生长能力，大大提高了细胞的传代次数。电话13683626447
-
康成tRF测序应用于Biomarker研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
【康成客户首篇tRF文章】tRF的Biomarker研究 南京医科大学第一附属医院肿瘤科副主任医师殷咏梅教授长期从事消化道肿瘤和乳腺肿瘤的内科**，近来，其实验室利用tRF&tiRNA测序，发现在曲妥单抗敏感和耐受的乳腺癌细胞中，tRNA来源的小非编码RNA分子tRF&tiRNA表达差异显著。其中tRF-30-JZOYJE22RR33和tRF-27-ZDXPHO53KSN在Trastuzumab（曲妥单抗，一种抗乳腺癌药物）耐受的临床病人中明显上调。结合临床信息分析显示，这两个tRF表达上调的曲妥单抗耐药乳腺癌病人与更差的无进展生存期具有明显的相关性，预示着这两个tRF可作为潜在的不良预后的生物标志物。该研究成果发表在2018年8月的Cellular Physiology and Biochemistry（IF：5.104）。（tRF&tiRNA测序由康成生物提供技术服务） 什么是tRF&tiRNA? tRF（15-30nt）和tiRNA(30-35nt)是由Dicer酶或ANG酶在多种条件下，精确地、特异性的切割tRNA后产生的小非编码RNA。已有多项研究表明，tRFs和tiRNAs作为sncRNA执行多种生物学功能。它们能够作为miRNA行使RNA干扰；替换与mRNA结合的翻译起始因子eIF4G，直接抑制蛋白的翻译过程；结合某些蛋白因子，例如YBX1，影响mRNA的稳定性 ；与细胞色素C相互作用，调控细胞凋亡；在应激条件下促进应激颗粒 (Stress Granules, SGs) 的组装；敏化细胞氧化应激诱导的p53激活以及p53依赖的细胞死亡；作为父代表观遗传因子，改变子代基因转录级联过程等。 >>详细内容请见：tRF&tiRNA：为什么以及如何研究它们？ 研究背景 约20%-25%的乳腺癌病人中人上皮生长因子受体-2（HER-2）表达上调，且HER-2与不良预后相关。曲妥单抗是一个HER-2的单克隆抗体，可明显提高乳腺癌病人的生存期。但大多数病人在接受曲妥单抗**后，会产生抗性，因此寻找HER-2阳性的乳腺癌患者产生曲妥单抗耐药性的分子机制已成为迫切需
-
戊巴比妥钠半数有效量（ED50）的测定
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一、 实验目的和原理 测定戊巴比妥钠（ 57-33-0） 腹腔注射对小鼠催眠作用的 ED50值。 戊巴比妥钠为巴比妥类镇静催眠药，用适当剂量给小鼠腹腔注射后产生的催眠效应， 常用翻正反射的消失来判断， 该指标仅有阳性（ 睡眠） 和阴性（ 不睡眠） 两种现象， 属于质反应。 质反应量效曲线的横坐标为对数剂量， 而纵坐标采用阳性反应发生的频数时， 一般为常态分布曲线。 如改用累加阳性频数为纵坐标时， 可以得到标准的 S 型曲线。 该曲线的中央部分（ 50%反应处） 接近一条直线， 斜度最大， 其相应的剂量也就是能使群体中半数个体出现某一效应的剂量， 通常称为半数效应量。 如效应为疗效， 则称半数有效量（ ED50） ； 如效应为死亡， 则称半数致死量（ LD50） 。 这些数值是评价药物作用强度和药物安全性的重要参数。 021-51602548 孙氏改进的 Kaerber 法的设计条件是： 各组实验动物数相等， 各组剂量呈等比数列， 各组动物的反应率大致符合常态分布。 若以 Xm 为最大反应率组剂量的对数， i 为组间剂量比的对数， p 为各组反应率， Pm 为最高反应率， Pn 为最低反应率， n 为实验组数， 则：ED50＝ lg-1[Xm－ i（ ∑ P－ 0.5） ＋ i/4（ 1－ Pm－ Pn） ]含 0%及 100%反应率时，ED50＝ lg-1[Xm－ i（ ∑ P－ 0.5） ]ED50的 95％ 可信限＝ lg-1（ lgED50± 1.96· S）其中 S＝ i 二、 实验材料 小鼠 50 只， 1% 戊巴比妥钠（ sodium pentobarbital solution） 小鼠笼， 天平， 0.5ml 或 0.25ml 注射器。 三、 实验步骤 1、确定给药剂量：先以少量动物做预实验，以获得小鼠对戊巴比妥钠催眠反应率为 100％ 的最小剂量（ ED100） 和反应率为 0％ 的最大剂量（ ED0） 。 然后在此剂量范围内， 按等比数列分成几个剂量组（ 一般 4～ 8 组） ， 各组剂量的公比（ r） 为 r＝ n-1√ ED100/ED0 求得 r 后， 自第一剂量组（ ED0） 开始乘以 r， 可得相邻的下一个组的剂量。 若共分为 5 个组， 各组剂量分 别为 ED0、
-
细胞消化知识你知道多少？
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
无论是原代细胞还是细胞系或癌细胞，细胞长满瓶后，需要对细胞进行传代或将细胞收集起来用作其他实验。贴壁生长的细胞必须要做的一步便是消化过程，下面便对细胞消化、中和、洗涤等过程做个简单介绍。 1、绝大部分细胞消化的时候是只需用胰酶润洗一遍即可，吸去胰酶后，残留胰酶附着在细胞表面在37度一般不到2min足够消化细胞（绝大部分1min不到）。对于这些细胞原则上不要用胰酶孵育细胞，这样连续传代，对细胞伤害很大。简单的程序是PBS润洗吸去，胰酶润洗吸去，然后37度消化。 2、什么算是消化好了呢？ 不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才算消化好了，一般肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙状移动，其实已经可以了，很多人喜欢把细胞消化或者吹打成完全分离细胞，这是没有必要的。一般能移动了，就应该停止消化，不要等到看到镜下所有细胞都分离得非常好，间隙很大，才停止。细胞就是完全成单个细胞悬液，之后在贴壁的过程中仍然会聚集，这个是贴壁培养的细胞，尤其是肿瘤细胞的一个特性。细胞只要能从基质上脱离下来，这个时候即使是成片的，吹打不超过20次后（一般10次即可），成小规模聚集（10个细胞左右），是正常的，不要试图再去延长消化时间。 3、EDTA的作用。 许多人不用胰酶，只用EDTA，或者用trypsin/EDTA联合作用。这里要明白，trypsin切割细胞外基质的一些负责粘连和附着的蛋白，而EDTA通过螯合Ca2+，作用于Integrin的活性，所以EDTA的作用更加温和。有的人在trypsin里添加一些EDTA，或者对付特别难消化的细胞，添加多一些EDTA，就是这个道理。一般不要试图延长消化时间（如果10min还消化不彻底的话），而应该想其它办法。针对如上情况，美国ScienCell公司专门配制了胰酶浓度为0.25%的trypsin/EDTA消化液（T/E，货号# 0103）和胰酶浓度为0.05%的trypsin/EDTA消化液（T/E，货号# 0183） 4、PBS洗涤。 消化之前用PBS洗涤，是常见的操作，因为Serum含有抑制trypsin的
-
细胞株培养过程中常见的问题有哪些呢？
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细胞株是用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群。细胞株的特殊性质或标志必须在整个培养期间始终存在。然而，细胞株在体外培养的过程中会出现一些问题，比如：细胞株无法在培养皿上贴壁生长，细胞株生长缓慢，细胞株死亡等。 那么该如何解决呢？ 一、细胞株无法在培养器皿上贴壁生长 1.细胞株胰酶消化过度：缩短胰酶消化时间或减少胰酶用量。 2.支原体污染：隔离细胞株，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞株被污染，灭菌处理后丢弃。 3.培养基中无附着因子：如果使用的是无血清配方，应确保含有附着因子或者使用经过包被的培养板。 二、细胞株生长缓慢 1.培养基或血清改变：比较不同培养基配方中葡萄糖、氨基酸及其他成分有无差异；通过生长实验比较新老批次血清有无差异；增大细胞株初始接种密度；使细胞株逐步适应新的培养基。 2.必需生长促进成分（如L-谷氨酰胺或生长因子）耗竭、缺乏或分解：去除原培养基，加入新鲜培养基；向培养基中添加生长促进成分（如L-谷氨酰胺）。 3.轻度细菌或真菌污染：在不添加抗生素的条件下进行培养，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。 4.时间存储不当：血清应于-5℃至-20℃下储存；培养基应于2℃~8℃下避光储存；尽量减少血清和培养基见光时间。 5.细胞株初始接种密度低：增大活细胞接种密度。 6.细胞株衰老、老化：将老化细胞丢弃，取用代数较少的细胞。 7.支原体污染：隔离细胞株，检测是否感染支原体；清洗通风厨和培养箱，如细胞被污染，灭菌处理后丢弃。 三、培养基pH值变化迅速 1. 培养箱CO2分压设置错误：根据培养基中NaHCO3的浓度增大或降低培养箱CO2的分压，NaHCO3浓度为2.0-3.7g/L时，应相应地使用5%-10%的CO2分压。 2.细胞培养瓶瓶盖过紧：将瓶盖旋松1/4圈。 3.碳酸氢盐缓存系统缓冲能力不足：加入HEPES缓冲液，使其终浓度为10-25mM。 4.培养基中盐含量不正确：CO2平衡环境中使用以Earle平衡盐为基础的培养基，大气条件下
-
一种新型可视细胞趋化实验方法及系统搭建的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一种新型可视细胞趋化实验方法及系统搭建的介绍 广州科适特科学仪器有限公司 一.细胞趋化实验原理 定义：趋化性（Chemotaxis，亦被称为化学趋向性）是趋向性的一种，指身体细胞、细菌及其他单细胞、多细胞生物依据环境中某些化学物质而趋向的运动。这对细菌寻找食物(如葡萄糖)十分重要，细菌以此趋进有较高食物分子浓度的地方，或远离有毒(如苯酚)的地方。在多细胞生物中，趋化性对其发展和其他正常功能一样不可或缺。正趋化性指趋向较高化学物质浓度的运动，而负趋化性则相反。 二.目前细胞趋化实验方法的主要问题 目前一般做这个实验的方法：用transwell做，如下图，下部空间放诱导剂，上部空间放细胞，经过一定时间，数细胞穿到下部空间的数量（细胞染色或者把细胞擦下来再数），穿到下部的细胞越多，说明趋向性越强，进而得出细胞的趋化性结果。 主要问题： （1）由于显微镜工作距离的限制，无法使用显微镜进行实时观察，无法记录细胞趋化过程，如果能够实时拍摄记录细胞趋化的过程，实验结果更直观。 （2）采用末端点测量方式，transwell只能数最终穿到下室的细胞数量，细胞运动速度是没办法考察的。 （3）不稳定的浓度梯度，transwell要做一系列的孔才能完成浓度梯度的趋化实验，因为transwell每孔只能在下室放一个定值的浓度，所以要做出一系列浓度梯度，就要做好几孔（比如每孔分别设置2，4，6，8单位浓度，这2，4，6，8就是个梯度）；这个实验做浓度梯度的目的是看细胞是不是确实在诱导剂越浓的情况下有更强或更弱的趋向性（或根据诱导剂浓度的升高有个趋向性的高低变化）。 （4）非生理实验环境，生理状态下需要控制温度，湿度，CO2浓度，O2浓度，流体环境的。 三．可视化细胞趋化实验工作原理和流程 基本原理：在两个大的蓄液池中通过一个大概60ul的狭窄观察区域相连，细胞注入通道内的基质胶中，在其上方形成线性和时间稳定的浓度梯度， 线性浓度梯度(维持48小时以上)。 主要工作流程 1.细胞接
-
浅谈人因工程及Noldus与人因工程
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
提及“人因工程”，想必大家并不陌生并且早已耳熟能详。随着科技进步与工业化水平的提升，人因工程在近年来也得到了飞速发展，同时也一直备受关注。回顾以往，从2016年至2018年，已分别在深圳、杭州、长沙召开了首届、第二届和第三届人因工程高峰论坛，由此也可看出人因工程的重要性日益增加。 那么人因工程究竟是什么？主要应用在哪些领域？为何要大力发展人因工程？促进人因工程的发展又该从哪些方面着手？本文将带着这些问题为大家进行阐述，浅谈人因工程。同时也穿插了刚刚圆满落幕的第三届人因工程高峰论坛回顾内容，旨在让大家感受一下会议现场的氛围，了解政府、学者专家们对人因工程的高度重视及独到见解。 点击此处，阅读全文。
-
测定土壤微生物的实验原理和方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一、实验原理 测定微生物细胞数量的方法很多，通常采用的有显微直接计数法和平板计数法。 显微计数法适用于各种含单细胞菌体的纯培养悬浮液，如有杂菌或杂质，常不易分辨。菌体较大的酵母菌或霉菌孢子可采用血球计数板，一般细菌则采用彼得罗夫· 霍泽（Petrof Hausser）细菌计数板。两种计数板的原理和部件相同，只是细菌计数板较薄，可以使用油镜观察。而血球计数板较厚，不能使用油镜，计数板下部的细菌不易看清。 血球计数板是一块特制的厚型载玻片，载玻片上有4条槽而构成3个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面各有一个计数区，计数区的刻度有两种：一种是计数区分为16个大方格（大方格用三线隔开），而每个大方格又分成25个小方格；另一种是一个计数区分成25个大方格（大方格之间用双线分开），而每个大方格又分成16个小方格。但是不管计数区是哪一种构造，它们都有一个共同特点，即计数区都由400个小方格组成。计数区边长为1mm，则计数区的面积为l mm2，每个小方格的面积为1/400mm2。盖上盖玻片后，计数区的高度为0.1mm，所以每个计数区的体积为0.1mm3，每个小方格的体积为1 /4000mm3。 使用血球计数板计数时，先要测定每个小方格中微生物的数量，再换算成每毫升菌液（或每克样品）中微生物细胞的数量。 已知：1mm3体积=10 mm×10 mm×10 mm= 1000mm3 所以：1mm3体积应含有小方格数为1000mm3/1/4000mm3=4×106个小方格，即系数K=4×106 。 因此：每ml菌悬液中含有细胞数= 每个小格中细胞平均数（N）×系数（K）×菌液稀释倍数（d） 二、实验方法 1．对于出芽的酵母菌，芽体达到母细胞大小一半时，即可作为两个菌体计算。每个样品重复计数2—3次（每次数值不应相差过大，否则应重新操作），求出每一个小格中细胞平均数（N），按公式计算出每ml（g）菌悬液所含酵母菌细胞数量。 2．测数完毕，取下盖玻片，用水将血球计数板冲洗干净，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免损坏网格刻
-
制备培养基的操作要点
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一、玻璃器皿的清洗 在制备培养基的过程中，首先要使用一些玻璃器皿，如试管、三角瓶、培养皿、烧杯和吸管等。这些器皿在使用前都要根据不同的情况，经过一定的处理，洗刷干净。有的还要进行包装，经过灭菌等准备就绪后，才能使用。 1、新购的玻璃器皿 除去包装沾染的污垢后，先用热肥皂水刷洗，流水冲净，再浸泡于１～２％的工业盐酸中数小时，使游离的碱性物质除去，再以流水冲净。对容量较大的器皿，如大烧瓶、量筒等，洗净后注入浓盐酸少许，转动容器使其内部表面均沾有盐酸，数分钟后倾去盐酸，再以流水冲净，倒置于洗涤架上将水空干，即可使用。 2、用过的玻璃器皿 凡确无病原菌或未被带菌物污染的器皿，使用后可随时冲洗，吸取过化学试剂的吸管，可先浸泡于清水中，待到一定数量后再集中进行清洗。有可能被病原菌污染的器皿，必须经过适当消毒后，将污垢除去，用皂液洗刷，再用流水冲洗干净。若用皂液未能洗净的器皿，可用洗液浸泡适当时间后再用清水洗净。洗液的主要成份是重铬酸钾和浓流酸，其作用是将有机物氧化成可溶性物质，以便冲洗。洗液有很强的腐蚀作用，使用时应特别小心，避免溅到衣服、身体和其他物品上。 二、培养基的类型 在实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基(Media)。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。 1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。 a.天然培养基天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：牛肉膏、麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛
-
细菌数量的测定方法汇总
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
1、颜色改变单位法（colour change unit,简称CCU） 这种方法通常用于很小，用一般的比浊法无法计数的微生物，比如支原体等，因为支原体的液体培养物是完全透明的，呈现为清亮透明红色，因此无法用比浊法来计数，由于支原体固体培养很困难，用cfu法也不容易计数，因此需要用特殊的计数方法，即CCU法。它是以微生物在培养基中的代谢活力为指标，来计数微生物的相对含量的，下面以解脲脲原体为例，简单介绍其操作： （1）取12只无菌试管，每一管装1.8ml解脲脲原体培养基。 （2）在第一管加入0.2ml待测解脲脲原体菌液，充分混匀，从中吸取0.2ml加入第二管，依次类推，10倍梯度稀释，一直到最末一管 （3）于37度培养，以培养基颜色改变的最末一管作为待测菌液的CCU，也就是支原体的最大代谢活力，比如第六管出现颜色改变，他的相对浓度就是10的6次方CCU/ml. 一般来说，比浊法和菌落计数法就可以满足绝大多数细菌的计数，但是对支原体这样比较特殊的微生物，用CCU法比较合适。 测定微生物生长的方法很多，各种方法均有其优缺点，也不是在任何情况下都适用。在微生物学工作中一般常用的是平皿菌落计数法、计数器法和比浊法。至于哪种方法比较适合你，得根据你的具体条件而定。 2、计数器测定法： 即用血细胞计数器进行计数。取一定体积的样品细胞悬液置于血细胞计数器的计数室内，用显微镜观察计数。由于计数室的容积是一定的(O.1mm3)，因而根据计数器刻度内的细菌数，可计算样品中的含菌数。本法简便易行，可立即得出结果。 本法不仅适于细菌计数，也适用于酵母菌及霉菌孢子计数。 3、电子计数器计数法: 电子计数器的工作原理是测定小孔中液体的电阻变化，小孔仅能通过一个细胞，当一个细胞通过这个小孔时，电阻明显增加，形成一个脉冲，自动记录在电子记录装置上。 该法测定结果较准确，但它只识别颗粒大小，而不能区分是否为细菌。因此，要求菌悬液中不含任何碎片。 4、活细胞计数法 常用的有平板菌落计
-
食品中溶血性链球菌的检验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
1、范围 本标准规定了食品中溶血性链球菌的检验方法。 本标准适用于各类食品和食物中毒样品中溶血性链球菌的检验， 2、规范性引用文件下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单〔不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准．GB/T4789.28一2003食品卫生微生物学检验染色法、培养基和试剂 3、设备和材料 3.1冰箱：O℃——4℃。 3.2恒温培养箱：36℃士1℃。 3.3恒温水浴锅：36℃土1℃。 3.4显微镜：10*～l00*。 3.5均质器或灭菌乳钵。 3.6离心机：4000r/min。 3.7架盘药物天平：0g——5009，精确至0.5g。 3.8灭菌试管：10mm*100mm、l6mm*160mm。 3.9灭菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、5mL、10mL（具0.1mL刻度）。 3.10灭菌锥形瓶：100mL。 3.11灭菌培养皿：直径90mm。 3.12灭菌棉签、镊子等。 4、培养基和试剂 4.1葡萄糖肉浸液肉汤：按GB/T4789.28一2003中4.1规定。在肉浸液肉汤内加人1％葡萄糖。 4.2肉浸液肉汤：按GB/T4789.28一2003中4.1规定。 4.3匹克氏肉汤：按GB/T4789.28一2003中4.62规定。 4.4血琼脂平板：按GB/T4789.28一2003中4.6规定。 4.5人血浆。4.6 0.25%氯化钙。 4.7 0.85％灭菌生理盐水。 4.8杆菌肤药敏纸片（含0.04单位）。 5、操作步骤 5.1样品处理按无菌操作称取食品检样25g（ml)，加人225mL灭菌生理盐水，研成匀浆制成混悬液。 5.2培养将上述混悬液吸取5ml，接种于50ml工葡萄糖肉浸液肉汤，或直接划线接种于血平板。如检样污染严重，可同时按上述量接种匹克氏肉汤，经36℃ 土l℃ 培养24h接种血平板，置36℃ 士1℃ 培养24h,挑起乙型血圆形突起的细小菌落，在血平板上分纯，然后观察溶血情况及革兰氏染色，并进行链激酶试验及杆菌肤敏感试验。 5.3形态与染色本菌里球形或卵圆形，直径0.5um ——1um链排列，链长短不一，颊者4个～8个细胞组成
-
改变菌种生理状况的原因分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
菌种的遗传特性需要在一定条件下才能表现出来。由于培养条件不适当，使菌种处于不利于发酵生产的生理状况，其结果也表现为菌种衰退。菌种处于不利于发酵的生理状况有以下三个方面的原因。 1、一个菌种不是纯的群体，而是由一些变异株混合组成，这些变异株所占的比例决定该菌种的特性。一个由单菌落发育而来的菌种在固体培养基上分离，可以长出许多种形态培养特征的菌落。这些不同的菌落类型在代谢和生长繁殖速度等方面有一定差异。培养条件可以影响各变异株在培养物中的比例而改变该菌种的特性。同一个菌种的单孢子分离在不同的培养基上，所生长出的单菌落，其形态培养特征有显著差异，各种类型菌落所占的比例也不同。如灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)在豌豆琼脂培养基上，单孢子分离呈现出3～4种菌落类型，而在黄豆粉培养基上仅出现两种菌落类型。在开始菌种选育工作时，要研究单菌落的分离培养基，找出能呈现较多菌落类型的分离培养基。菌落类型和发酵产量之间存在着某种程度的相关性。在选种实践中，人们经过对菌落形态的考察，有意识地丢弃一些被认为是低产的菌落，挑选那些可能是高产的菌落。 2、菌种培养基可通过影响菌种的生理状况而影响发酵产量。菌种培养基营养过于丰富不利于孢子形成，因而影响发酵。菌种培养基营养贫乏也同样不利于发酵。因为菌种在营养贫乏的培养基中多次传代，会使菌体细胞内缺乏某些生长因子而衰老甚至死亡。因此，自然选育或菌种培养所用的培养基应选择具有菌种传代后生产能力下降不明显、菌体不易衰老和自溶的正常形态菌落、孢子丰富的培养基。 3、在某些培养条件下，菌体的某些基因处于活化状态或阻遏状态，而使菌种的生理状态改变。这种改变可能以类似于生理性迟延或细胞分化的机制保持较长一段时间。 由于菌种的衰退将会引起发酵过程的产量急剧下降，一旦发生菌种衰退，就必须采取有效的预防和防治措施，防止菌种的优良性状发生退化。同时若发现某些优良性状退
咨询热线
18133906270
德尔塔官方微信