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脑立体定位技术的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
脑立体定位技术的应用 哺乳动物的大脑是所有器官中最复杂的一部分，结构上分为很多区域和核团，在需要对某个特定核团进行研究的时候就需要通过立体定位技术对其进行精确定位和操作。 原理 某些颅外标记与颅内结构具有相对固定的位置关系，如： 前囟（bregma）:位于冠状缝和矢状缝的交接处； 人字缝尖(lambda):位于后囟人字缝与矢状缝交会点。 一般借助脑立体定位图谱进行操作，即George paxinos和Charles watson所著的THE RAT BRAIN及其系列图谱。 应用 **核团微量注射 电位引导 核团的刺激或损毁 核团微量注射（包括脑室注射）是最为常见的应用，一是因为对于区域和核团精确定位的要求，二是由于血脑屏障的存在，很多药物无法直接通过口服或者注射作用于大脑。 方法 1. 动物麻醉后，通过耳杆和上齿固定板固定于立体定位仪上 。 2. 剪去头部的毛，用75%酒精棉球作头部皮肤的消毒，沿矢状缝作切口，剥离筋膜及肌肉，推开骨膜，并用3%双氧水洗净，用干棉球擦拭，暴露骨缝，止血。 3.根据定位坐标，插入微量注射针，通过微量注射泵缓慢注入（如10min3微升）药物或者细胞悬液等。 结果 纹状体肿瘤： 病理染色：
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Nature突破性研究—RNA甲基化新修饰 m1A
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
说起近来的科研热点，RNA甲基化修饰的相关研究可以说是当前整个生命科学领域最热门的方向之一，亮点文章频出，着实让人有些目不暇接。日益增多的发表文章、特别是高分文章说明，这个领域现在正在迅速成为大家关注的焦点。RNA甲基化修饰类型很多，目前最热门的有三种，分别是：m6A RNA甲基化﹑m5C RNA甲基化﹑m1A RNA甲基化。而m1A RNA甲基化是一个新进入大家的视野的RNA甲基化修饰类型，即RNA分子腺嘌呤第1位氮原子上的甲基化修饰（N1-methyladenosine，m1A）。研究表明，m1A是真核生物tRNA和rRNA丰度很高的一种转录后修饰，近期研究也表明m1A修饰可调控mRNA翻译。m1A修饰作为一类新型RNA甲基化，其功能和机制都亟待挖掘。云序生物作为m1A RNA甲基化研究的先驱者，能够为客户提供专业和优质的m1A RNA甲基化测序服务。今天我们承接上期的m5C RNA甲基化，为大家带来m1A RNA甲基化研究进展。 1. Nature：真核生物mRNA中m1A的动态修饰研究 影响因子：41.456 近些年研究表明N6-methyladenosine (m6A)在mRNA代谢中扮演重要角色，此外，pseudouridine和5-methylcytosine也被发现在基因表达的转录后修饰中启着重要作用。但是N1-methyladenosine(m1A)在信使RNA中的修饰则未见报道。直到2016年，来自芝加哥大学等处的科学家在国际杂志Nature上发表的一项研究论文，该研究通过m1A RNA甲基化测序和RIP测序技术在真核生物mRNA中对m1A甲基化作用进行全面的分析,揭示了一种小型的化学修饰可以明显增强基因向蛋白质的表达过程。这种小型的修饰具有进化保守性，而且在人类、啮齿类动物及酵母中普遍存在，但其位置以及对基因表达的效应却可以反应一种新形式的表观转录组学控制。这项研究发现为生物学世界提供了一种新的视野。 图1：m1A的转录组比对 2.Cell：ALKBH1介导的tRNA去甲基化调控翻译 影响因子：30.41 芝加哥大学的研究者在对tRNA的研究中发现：ALKBH1作为tRNA去甲基化酶，能够催化tRNA中的m1A甲基化去甲基化。他们通过CL
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飘忽不定的诺贝尔奖机遇：如何理解和用好NMT数据？
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
关注旭月微信公众号，点击下方菜单栏“论文集”获取最新版NMT《论文集》。 作者：许越 点击查看作者自传 2） NMT数据重复性的挑战 从上面这些例子和解读可以看出，NMT的活体生理数据（或未来的生理指标）与大家比较熟悉的传统生命科学数据有较大的不同。以至于很多第一次拿到NMT数据的老师和同学，看到这些大的大，小的小，或者‘飘忽不定’的数据时，当初对NMT技术的美好憧憬，顷刻间化作了眉间的愁云。 尤其是NMT进入中国初期，大家都没有什么太多经验，很多老师同学在摸索的时候，也不太清楚所测的离子分子的生理学意义，就把材料不分‘男女老少’，也不管‘强壮赢弱’，通通交给NMT去检测。如同我们总发现在计算机面前，出错的多半是我们自己一样！NMT系统会忠实地把真实数据反馈给我们。 因此，NMT数据重复性的挑战，主要来自于两个方面。 一是生理指标（即：离子分子种类）的选择， 二是材料的筛选。 一）离子分子种类的选择通常比较直截了当，大家都知道自己想要的是什么。但是常常忽视的一点是，尤其在摸索初期，**能够找一个你自己相对比较熟悉，几乎可以预期的第二个，或可以用作参比/参照的另一个离子/分子，这样做的好处是，打个比方，当你用体温作为一个参照，如果某一‘样本’的体温极不正常的时候，你就知道了，你正在研究的未知生理指标的数据也是不正常的。 二)材料的筛选在大家注意了‘男女有别’‘年龄各异’之外，一个比较容易忽视的地方是‘强弱不同’的甄别，还有老师同学们这个时候固执地认为要保证实验材料的科学性，就必须保证‘强弱’都有，忘记了本文前面所述“生理学是研究活体生物及其各组成部分的正常功能的学科”。那么，‘正常功能’应该是指‘强者（健康者）’吧。 因此，NMT数据重复性的挑战，本质上是对NMT技术使用者生理学知识和实验材料准备工作水平的双重考验。 3） ‘飘忽不定’的机遇 下面是一位水稻科研人员多年前在旭月测得的数据。大多数老师和同学们看到这样的
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Plant Physiol：遗传所童依平组|硝酸盐诱导的NAC转录因子调控硝化反应增产小麦
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
通告：今日起，原“imOmics精华速递”改版为“旭月活体研究通讯”，简称“旭月通讯”，每周一期。除介绍最新的NMT文献外，还有实验设计、设备操作、数据分析、文章撰写、审稿答疑......更多干货，等你来撩。 NISC文献编号：C2015-036 研究使用设备 NMT活体生理检测仪 NMT Physiolyzer® 硝酸盐是谷类作物主要的氮源，因此掌握谷物的硝酸盐信号转导对于提高其氮利用效率至关重要。尽管已经在拟南芥中鉴定出了几个硝酸盐信号转导的调节因子，但在谷物中并未发现。 中国科学院遗传与发育生物学研究所童依平课题组在Plant Physiology上发表了一篇文章，题为“The Nitrate-Inducible NAC Transcription Factor TaNAC2-5A ControlsNitrate Response and Increases Wheat Yield”，主要探究谷物中硝酸盐转运反应。 野生型与过表达型玉米，在高低氮条件下根部NO3-流检测。正值表示吸收。 课题组从小麦中分离到一种硝基诱导的谷类特异NAM，ATAF和CUC(NAC)转录因子TaNAC2-5A。染色质免疫沉淀试验表明：TaNAC2-5A可直接与硝酸盐转运蛋白和谷氨酰胺合成酶编码基因的启动子区域结合。小麦中TaNAC2-5A过表达促进根的生长以及硝酸盐吸收速率，从而提高根系吸收氮素的能力。 研究利用基于非损伤微测技术（Non-invasive Micro-testTechnology, NMT）的NMT活体生理检测仪 Physiolyzer®，检测根部NO3-流，发现转基因型植物根部的NO3-吸收速率显著高于野生型，这为TaNAC2-5A促进作物根部NO3-吸收提供了最直接的生理证据。 2018年6月4日，旭月研究院前往中科院遗传所开展了非损伤微测技术应用培训。现场的老师同学，就非损伤检测植物钾营养吸收，提出了具有代表性的几个问题。 想要系统学习非损伤微测实验设计？快来报名参加培训班吧！ 一、为什么测不到钾营养吸收 1. 饥饿处理 ·氮（N）、钾（K）等营养吸收实验的首要关注点。N饥饿、K饥饿的时间，参考文献，一般为2-7天（C2014-022，想要文献全文，请在底部留
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微生物限度检测过滤装置原理和分类介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
微生物限度检查真空抽滤装置是一种适合于食品饮料生产企业、制药厂、疾控中心、医疗、高校科研或者是第三方检测机构使用的，适合于待检样品的水中微生物限度的检测检查过滤。其原理是在过滤装置的特定位置安装过滤膜，将样品倒入后，利用真空泵产生的压差，使得液体通过滤膜，过滤后将滤膜放入培养皿中进行培养。和一般过滤具有比较明显的不同是检查样品数量较多，使用传统单联式的过滤瓶可能会造成过滤效率较低的后果，而使用专业的微生物过滤产品单次可以过滤出3组、6组甚至更多样品。同时由于特殊使用需要，微生物检测试验对无菌、避免污染的要求则更高。 目前市场上微生物过滤产品种类繁多，客户在选择时可以根据这几条来选购适合自己的产品： 过滤样品的数量：最为常见的型号分类一般根据单联、三联、六联来分类，其主要区别是用户单次可以过滤的样品数量，分别对应1组、3组和6组，用户一般根据自己单位需要过滤的样品量来选择。目前比较推荐客户使用BV-321-A三联水中微生物检查真空过滤系统，一台真空抽滤泵配套一组三联过滤支架，支架上面带有3个滤杯，可以同时进行过滤，也可以使用滤杯下放的阀门开关关闭不需要使用的滤杯。而其最大特点在于当客户日后过滤样品数量增加需要扩充过滤座时，只需要再购买一台三联座，通过一个直通连接器就可以将2台三联座串联起来，而依然只使用原先配置的一台抽滤泵就可以实现过滤工作，不需要再额外购置抽滤泵。 过滤器的材质：过滤器材质部分可以分为两块，主体支架材质和漏斗的材质。目前主流产品支架材质有不锈钢、铝合金，支架部不论是铝合金还是不锈钢都可以使用121度高温高压灭菌，而铝合金则兼具了自重轻的优点，BV-321-A主体支架材质就采用了现金的阳极工艺铝合金；漏斗材质种类更多分为不锈钢、玻璃、塑料、陶瓷等，其中不锈钢材质可以直接用火焰烧灼消毒，玻璃材质价格便宜，塑料材质结构简单轻便耐摔，目前使用越来越广泛。 更多信息请来电咨询。
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细胞培养基中的病毒污染风险控制
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
Anika Manzke是病毒清除产品经理，Birte Kleindienst是病毒清除产品初级经理，二人均供职于Sartorius Stedim Biotech 一种新型病毒截留膜可用于过滤化学限定细胞培养基，从而降低病毒污染风险。 细菌、支原体和病毒等各种感染因子对生物反应器的污染会对患者安全构成潜在的威胁。近年来，病毒一直是导致多种生物反应器污染的原因（1）。许多生物制药公司已经报告过鼠细小病毒（MVM）或疱疹病毒属（2）等无包膜细小病毒对生产级生物反应器造成的污染。制药行业中的许多重量级公司都加入了CAACB来共同解决这一问题。 制造商可以采取多种方法降低细菌或支原体引起的细胞培养污染风险。但是，病毒（特别是无包膜细小病毒）引起的污染风险，即使是在使用化学限定培养基（1）的情况下，对生物制药行业而言仍然是一个巨大的挑战。 传统的除菌级过滤器， 即使是0.1微米的过滤膜都不能防止无包膜微小病毒造成的污染。 病毒污染比细菌污染（3）更难以检测。未能检测到的病毒可能会污染整个下游过程，甚至是最终药品。许多公司因鼠细小病毒或疱疹病毒属（2）污染而遭受了生产损失。针对所有上述情况，根源分析显示，最可能的源头是在供应链（4-6）早期储存过程中的培养基组分（如盐）污染。 图1：病毒污染事件的逐渐升级关联效应 防止老鼠进入这些仓库的措施不够充分。 这些污染事件可能对患者造成致命的后果。 这些无包膜病毒的稳定性高，因此它们可以长期存活。即使是一个感染性颗粒也会污染整个生物反应器。这一个颗粒会在生物反应器中迅速复制。在它进入生物反应器之前，要在1000 L的培养基中找出这一个颗粒无异于大海捞针。 污染影响 这种污染事件可能对患者造成致命的后果（参见图1）。如果公司发现存在污染，不仅需要关闭工厂，还需要进行大量的清洁工作。由此便可能导致药物短缺，患者不能获得救生药物（7）。 上游病毒清除解决方案 上游工艺中需要有新的病毒清除理念。 过去，研究人员已经研究了伽马辐射、UV
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细胞周期的四种检测方法详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。细胞周期是一个重要的检测参数，研究细胞周期变化的影响对于肿瘤的发展及药物研发有着重要的作用。例如，已知抑制有丝分裂的化合物大都用来减缓肿瘤细胞的生长。 细胞周期内有两个阶段最为重要：G1 到 S 和 G2 到 M；这两个阶段正处在复杂活跃的分子水平变化的时期，容易受环境条件的影响，如果能够人为地进行调控，将对深入了解生物的生长发育和控制肿瘤生长等有重要意义。能够方便有效地检测细胞周期的变化，对于药物研发和疾病研究等都具有重要的意义。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 那么，细胞周期的测定如何进行的呢？测定细胞周期的方法很多，有同位素标记法、流式细胞仪法、基于细胞成像的荧光检测法等。 一、同位素标记法测定细胞周期 标记有丝分裂百分率法 (PLM) 是一种常用的测定细胞周期时间的方法。其原理是对测定细胞进行脉冲标记、定时取材、利用放射自显影技术显示标记细胞，通过统计标记有丝分裂细胞百分数的办法来测定细胞周期。 测定原理： ① 待测细胞经 3H- 胸腺嘧啶核苷标记后，所有 S 期细胞均被标记。 ② S 期细胞经 G2 期才进入 M 期，所以一段时间内 PLM = 0。 ③ 开始出现标记 M 期细胞时，表示处于 S 期最后阶段的细胞，已渡过 G2 期，所以从 PLM = 0 到出现 PLM 的时间间隔为 G2期的持续时间。 ④ S 期细胞逐渐进入 M 期，PLM 上升，到达到最高点的时候说明来自处于 S 最后阶段的细胞，已完成 M，进入 G1 期。所以从开始出现 M 到 PLM 达到最高点 (≈ 100%) 的时间间隔就是 M 期的持续时间。 ⑤ 当 PLM 开始下降时，表明处于 S 期最初阶段的细胞也已进入 M 期，所以出现 LM 到 PLM 又开始下降的一段时间等于 S 期的持续时间。 二、流式细胞仪 PI 染色法 细胞周期分为间期与分裂期两个阶段。
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免疫组化试剂盒实验操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
仪器、设备： 移液器、免疫组化笔、微波炉或高压锅、计时器、孵育湿盒、染色架、盖玻片、光学显微镜、洗瓶等。 溶液配制： PBS溶液配制；EDTA组织抗原修复液及DAB显色液使用详见免疫组化试剂盒产品说明书操作步骤。 实验温度：15-28℃ 实验步骤： 1. 脱蜡水化 1) 石蜡切片置于新鲜的二甲苯中，浸泡15 min × 2次； 2) 去除多余的液体后，置无水乙醇中，浸泡3 min × 2次； 3) 去除多余的液体后，置95%乙醇中，浸泡3 min； 4) 去除多余的液体后，置85%乙醇中，浸泡3 min； 5) 自来水冲洗1 min； 6) PBS溶液冲洗3 min × 3次。 2. 加热EDTA抗原修复液（试剂1，采用微波进行抗原修复） 1) 将脱蜡水化后的组织切片置于烧杯（或修复盒）中的耐高温塑料切片架上； 2) 加适量的修复液1x EDTA抗原修复液，（溶液1，用纯净水稀释20倍后）于烧杯中，液面要浸过切片组织一定高度； 3) 微波炉先用高档加热使液体沸腾，当加热至沸腾时调到中档，此时开始计时，修复时间一般为20 min，此过程中勿使组织干片（修复液要足量）； 4) 将烧杯从微波炉中拿出，放入冷水中冷却降温； 5) 当修复液降至室温后取出玻片，用PBS（PH7.4）冲洗3 min × 3次。 注意： 抗原修复时，修复液务必保证切片始终浸泡在液体内，一般情况：修复液的量为800 mL/1架-1500 mL/3架； 取出玻片，用PBS冲洗时，切勿对着组织冲洗，以免弄破组织。 3. 阻断内源性过氧化物酶 1) 用吸水纸擦干玻片，免疫组画笔在组织周围画圈； 2) 将3%的过氧化氢（试剂2），滴加100 μL到切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15 min； 3) PBS冲洗3 min × 3次。 4. 封闭 用吸水纸擦干玻片，滴加正常山羊血清（试剂3），室温封闭15 min，以减少非特异性染色。 5. 一抗孵育 1) 用吸水纸擦干玻片组织周围的液体； 2) 滴加单克隆抗体（试剂4）100 μL，如果做阴性
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实时荧光定量PCR技术的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实时荧光定量PCR (real time fluorogenetic quantitative PCR, FQ-PCR)，是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。它是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域。 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念是Ct值。C代表Cycle, t代表threshold, Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。 研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可做出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 荧光定量PCR所使用的荧光物质可分为2种：荧光染料和荧光探针。荧光染料法是指SYBR Green I法，荧光探针法包括Taqman探针法、LightCycler法和分子信标（Molecularbeacon）法。 SYBR Green I法是在PCR反应体系中加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。扩增产物序列特异性通过反应后变性分析来确证。在反应的最后阶段，反应体系的温度逐渐升高，双链DNA慢慢地变成单链，从而SYBR Green I染料释放出来，导致荧光强度的慢慢降低，测定整个过程的荧光强度，可以获得PCR产物的变性温度，因为每一种PCR产物都有不同的长度和GC百分比，所以也具有特征性的变性温度。通过变性曲线得到的产物大小可以和PCR产物的电泳结果相比较。这种方法在检测禽肉中的沙门氏菌和干冻食品中的细菌活性方面已有报道。 Taqman探针法
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环介导等温扩增技术的原理与应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
原理与应用 环介导等温扩增（Loop-Mediated Isothermal Amplification，LAMP）技术是日本学者Notomi T于2000年发明的一种新的DNA扩增技术，该方法能够高效、特异、快速的在等温条件下完成。通过一系列的链置换扩增反应，该方法能够在1h内就可以将靶基因扩增109倍，当靶基因为RNA时，该方法还可以通过在反应体系中添加反转录酶而实现对RNA的扩增；在LAMP反应中，会有大量的DNA合成，因此会产生很多焦磷酸根离子，这些焦磷酸根离子可以结合溶液中的二价Mg2+形成不容的焦磷酸盐，便于对反应结果的观测，使扩增和检测一步就可以完成，大大提高检测效率。 1.1 LAMP反应的基本原理 该技术根据靶基因的6个区域设计出4条引物，包括两条内引物和两条外引物（如下图），其中内引物由靶序列正义链和反义链的两个特异区域组成，利用DNA链在60-65℃的恒温条件下处于解链和退火的动态平衡状态，在DNA聚合酶的驱动下结合靶序列启动DNA合成，由于内引物同时和双链互补，因此是形成环状结构的主要因素；外引物与内引物前端的序列互补，通过链置换DNA聚合酶的作用置换下内引物合成的DNA链并且合成自身DNA，被置换的链自身形成茎-环结构接着与内引物结合进行扩增和链置换，新合成的茎-环结构的长度是原来的二倍，如此经过滚环扩增之后形成的产物是周而复始的插入靶序列的不同长度的茎-环结构的DNA链，即由很多重复的环组成的花椰菜结构。为了提高反应速度，还可以通过引入两条环引物加快反应，环引物与合成过程中形成的环状区域互补，增加了在LAMP反应中DNA合成的起点数量，可大大缩短检测时间，提高检测效率。 R方法不同之处在于无需加热到使双链DNA解旋到两条单链的变性温度就可以驱动反应的进行，针对靶基因的6个特性性区域的引物结构如下图所示，其具体合成步骤如下： 第1阶段为起始阶段： 第一步：内引物FIP与模板链复性结合，以FIP引物中的F2区域3’端为起点，在Bst DNA聚合酶的链置换活性的驱动下合成与靶序列互补的一条新链。
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EMA -常温核酸扩增技术简介
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
基于分子仿生学的原理，把生物体内(如大肠杆菌，酵母或人体等)多酶介导的核酸复制机理在体外再现，使痕量的核酸靶标在普通生物耐受的条件下(常温下)进行快速的扩增，同时利用特异性荧光探针结合扩增产物，通过荧光检测仪实时监测荧光信号，实现核酸靶标的快速扩增和检测。 常温核酸扩增技（简称EMA技术），是由点晶生物公司首席科学家兼董事长的胡振新博士所发明，点晶生物公司也拥有相关研发技术专利所有权及使用权，目前基于EMA技术基础上所开发完成并投入生产、销售的检测试剂，都为点晶生物自主研发并拥有产权的专利产品。 EMA扩增检测系统优势： 快速：从取样到出结果仅需35分钟； 简便：操作简便，试剂常温保存，常温运输，常温检测，结果可视化； 检测对象广泛：可同时检测DNA和RNA； 多指标：针对单一样本，可以同时检测多种不同的病原体； 耐受性强：对PCR扩增的抑制剂耐受性较强，比较粗放提取的核酸样品也能检测； 常温反应：42℃常温恒温反应； 冻干工艺：采用先进的冻干工艺技术，将其制成干粉试剂，可直接上机检测，便于运输，操作更简便，也避免反复冻融带来损耗； 单管冻干工艺：试剂采用先进的冻干工艺技术，将其制成干粉试剂，可直接上机检测，与液态试剂相比操作使用简便，同时也便于运输，避免在运输或者使用过程中反复冻融带来损耗。 恒温扩增技术对比： 技术 EMA SAT Lamp+SybrGreen PCR+Taqman CPA 产物 DNA RNA DNA DNA DNA 检测 荧光检测 荧光检测 荧光比浊 荧光检测 试纸条 储存 常温避光 -15℃ ~ -35℃避光 -20℃避光 -20℃避光 A盒: -10℃~ -25℃ B盒：2-30℃ 有效期 12个月 12个月 12个月 12个月 12个月 反应温度及时间 42℃，40min 42℃，1min，40个循环 65℃，60min 3个温度循环，90min 63℃，60min 提取加检测总时间 35min
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数字PCR技术的发展和原理
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
数字PCR即Digital PCR（dPCR)，它是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。 在定量PCR时，我们常常纠结一个问题，究竟是相对定量还是绝对定量呢？如今，你无需纠结了，因为数字PCR（digital PCR）来了。尽管这两种技术有些类似，都是估计起始样品中的核酸量，但它们有一个重要的区别。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。因此特别适用于依靠Ct值不能很好分辨的应用领域：拷贝数变异、突变检测、基因相对表达研究（如等位基因不平衡表达）、二代测序结果验证、miRNA表达分析、单细胞基因表达分析等。 技术发展： 20世纪末，Vogelstein 等提出数字PCR( digitalPCR，dPCR) 的概念，通过将一个样本分成几十到几万份，分配到不同的反应单元，每个单元至多包含一个拷贝的目标分子( DNA 模板) ，在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。 数字PCR技术不断发展，Bio-Rad、LIFE Technologies及RainDance等厂家相继推出技术较为成熟的数字PCR产品。 QuantaLife公司开发出的微滴数字PCR技术。该产品还获得了2011年度Frost & Sullivan北美新产品创新奖。2011年10月，Bio-Rad公司收购了QuantaLife和ddPCR技术，相继推出了QX100、QX200微滴式数字PCR系统。 与其他数字PCR技术不同，Bio-Rad对样品进行微滴化处理。据该公司基因表达部门的销售经理Richard Kurtz介绍，他们的独特优势是能够产生非常均一、重复的1纳升液滴。这样的好处是每个样品形成20,000个液滴，而其他系统只能分成760-3,000个部分。分得越多，则意味着分析越准确。 数字PCR是一种核酸分子绝对定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量；实时荧光定量PCR（Real Time PCR）基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应
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隐孢子虫的介绍和诊断方式
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
隐孢子虫病是一种以腹泻为主要临床表现的人畜共患性原虫病，由隐孢子虫引起。寄生于人体的虫种主要是微小隐孢子虫。虽然本病无严格季节性，但多见于夏秋季。 临床症状 当狗狗的免疫受到抑制时，隐孢子虫会造成严重的腹泻，甚至可能造成死亡，大多没有临床症状。 传播途径 隐孢子虫病主要经水和食物等途径传播，粪口途径是主要的传播方式。水源污染是引起隐孢子虫病暴发流行的主要原因。人与动物可以相互传播。 传染源 感染了隐孢子虫的人和动物都是传染源，已知40多种动物，包括哺乳类动物，如牛、羊、犬、猫等均可作为该虫的保虫宿主。隐孢子虫病人和带虫者的粪便和呕吐物中均含有卵囊，都是重要的传染源。 诊断方式 用显微镜以特殊染色进行粪便检查,检验是否有卵囊的存在,也可通过小肠采样做进一步检查。对于大多数宠物来说，每年推荐一次或两次的常规粪便浮选试验很可能会错过隐孢子虫，因为它是一种如此小的生物。此时更加专业化的测试，如隐孢子虫 DNA的PCR检测是**的方法。武汉尚码生物是湖北省首家动物第三方检测中心实验室，拥有最全的动物检测项目，以及最快的时效，样本收到后最快24H出具检测结果。 预防措施 给宠物提供清洁饮水；避免喝生水、吃生肉；及时清除宠物的粪便；定期清洗消毒宠物用具。 尚码生物本地宠物第三方检测实验室，检测速度快、结果准、价格优，欢迎送检！
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“膜” 法学院之晋阶篇--解锁超滤实用小技能
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
是否提供无热源的超滤管 建议用Turbo系列，用1N NaOH溶液室温浸泡1小时，3000g离心，弃去剩余溶液。在使用无热源水3000g冲洗两次注意，赛多利斯超滤离心管系列，只有Turbo可以进行上述操作，而其他材质的膜，要考虑对NaOH的耐受性。比如，相对于RC膜，经过NaOH处理后，将会影响过滤速度和回收效果。 需要浓缩到一定的倍数？其实可以通过超滤管控制 首先，Vivaspin超滤管有最小回收体积，保证至少回收30ul的样本，并且不会让过长的离心时间导致样品离干。另外，如果需要浓缩一定的倍数，使用超滤管也可以直接完成，不需要另外的步骤。首先，预先计算外管液体达到滤过孔的刻度线的位置需要的体积，然后减去样品要滤出的体积，就是需要预先加入外管的缓冲液的体积。先在外管中加入计算得到的缓冲液，待滤出液的体积流入外管缓冲液中，使液面达到滤出孔，则样品不再浓缩，浓缩倍数得到了固定，看，样品浓缩就是那么简单！ 可以用超滤管分离外泌体吗 答案是可以的，除此之外核酸，纳米微球颗粒，多糖，病毒都可以用超滤的方法，而且超滤不会破坏外泌体的结构。对于外泌体，推荐使用过滤设备进行杂质去除（Minisart或Sartolab RF/BT系列），然后用超滤设备（Vivaspin或Vivaflow系列）进行外泌体的浓缩。具体步骤如下： a) 收集培养液，离心去除细胞和细胞碎片后，使用0.2um针头式滤器（Minisart系列，适合1-100mL样品）或正压/负压过滤器（Sartolab RF/BT系列，适合100-15,000mL样品）过滤去除囊泡等大颗粒物质 b) 样品使用Vivaspin超滤管（≤20mL），Vivacell超滤杯（20-250mL），或vivaflow 膜包（100ml-5L）超滤制备外泌小体。 其实已经有很多前辈用Vivaspin超滤管收集外泌体了，参考文献： 【1】Robert Gastpar, Mathias Gehrmann,Maria A. Bausero,Heat Shock Protein 70 Surface-Positive Tumor Exosomes Stimulate Migratory and Cytolytic Activity of Natural Killer Cells, Cancer Res 2005; 65: (12).
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