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iTRAQ蛋白质组学揭示油菜卷叶机理
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
题目：Histological, Physiological, and Comparative Proteomic Analyses Provide Insights into Leaf Rolling in Brassica napus 期刊：Journal of Proteome Research 影响因子：4.268 合作技术：iTRAQ 研究背景 叶片是大多数植物光合作用的主要器官，叶片发育影响作物产量和植物结构。适度的卷叶被认为是作物理想型育种的一个重要组成部分，它能够改变植物的结构，提高光合效率，延缓叶片衰老，减轻干旱、高温和高光等胁迫带来的损害。近年来，在拟南芥和水稻等物种中，已经分离出了卷曲叶片突变体，并对它们的分子机制进行了深入的研究。油菜作为世界上最重要的油料作物之一，虽然也发现了一些卷曲叶片的突变体，但是对于其作用机制仍有待进一步的研究。 本文作者主要利用iTRAQ定量蛋白质组学技术分析油菜卷叶突变株Bndcl1与野生株（WT）的差异蛋白，阐明了卷叶机理及其对植物的生理影响，有望促进油菜的理想株型育种。 研究内容及结果 1. 本研究中，作者选取了油菜卷叶突变株Bndcl1，首先经组织学对比发现，相比于野生株（WT），突变株（Bndcl1）幼苗期的叶片表型上比较紧凑（图 1A和B）。组织切片结果中发现Bndcl1叶绿体数目明显增多，特别是在海绵状的叶肉细胞中(图1C和D)。此外，作者发现，在Bndcl1突变体中，在远轴端韧皮部组织细胞较少，而在其叶脉以下的远轴端表皮细胞明显增大(图1E和F)。 图1.叶片的组织学分析 2. 为了评估卷曲叶片对Bndcl1突变株光合性能的影响，作者测定了Chl的含量、Chl荧光和气体交换参数。与野生株相比，Bndcl1株中的叶绿体数量、PSII和净光合速率的有效量子产量显著增加。 3. 活性氧(ROS)的生成在光合作用的光反应过程中是不可避免的，PSII极易受到光破坏的影响。光抑制的光合作用不可避免的损失会因ROS的产生而加剧，而ROS的产生会减慢PSII的修复。为了减少光氧化伤害，光合生物体已经进化出多种机制，而对抗氧化剂的上调是调节机制
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“ 点击化学”（Click chemistry）的技术原理
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
Click chemistry是美国一家小众里知名生物公司，国内通常称呼为CCT，生产有浓缩介质，代谢标记试剂，生物素标记试剂，荧光染料以及交联剂。 点击化学（Click chemistry）—蛋白质组学研究和新药研发的理想技术。美国一家小众里知名生物公司，国内通常称呼为CCT，生产有浓缩介质，代谢标记试剂，生物素标记试剂，荧光染料以及交联剂. “点击化学"（ “Click chemistry"）是2001年美国诺贝尔化学奖获得者、史格堡研究院（Skaggs institute）化学生物研究所的研究员贝瑞夏普利斯（K. Barry Sharpless）发展出一种新技术，其所具有的高效和高控制性，在化学合成领域掀起了一场风暴，成为目前国际医药领域吸引人的发展方向，被业界认为是未来加快新药研发有效的技术之一。“点击化学"的基本思想就是利用碳-杂原子成键反应快速实现分子多样性，一般由叠氮化物（azide）和炔烃（alkyne）作用形共价键，具有高效稳定，高特异性等优点。反应不受PH影响，能在常温条件下的水中进行,甚至能在活细胞中进行。 2001年美国诺贝尔化学奖获得者、史格堡研究院（Skaggs institute）化学生物研究所的研究员贝瑞·夏普利斯（K. Barry Sharpless）发展出一种名为“Click chemistry”的新技术，其所具有的高效和高控制性，在化学合成领域掀起了一场风暴，成为目前国际医药领域最吸引人的发展方向，被业界认为是未来加快新药研发最有效的技术之一 。 “点击化学”的提出顺应了化学合成对分子多样性上的要求。从20世纪末开始，新药线的需求和高通量筛选方法的出现，使大量新型分子的合成成为化学合成的迫切任务，建立分子库、发展分子多样性成了重要的课题。90年代的新兴技术——组合化学是这方面的一项重要技术，在多肽分子库的建立上尤其成功，但在结构类型大改变的多样性上还有很大的局限性，因此需要有更多的方式和途径来发展分子多样性。“点击化学”的基本思想就是利用碳-杂原子成键反应快速实现分子多样性。 “点击化学”
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免疫印迹实验相关原理介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
免疫印迹(Western blot)简介和原理 免疫印迹用于鉴定能够与特异性抗体相互作用的大分子抗原（一般为蛋白质）并测定抗原的大小。蛋白质首先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相支持物上，固相支持物包括硝酸纤维素膜，聚偏乙烯二氟（PVDF）膜和阳离子尼龙膜等。首先把膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附，这样固定的蛋白即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用。最后通过放射，生色或化学发光的方法进行定位。 实验常规试剂 1. 1.0 mol/L Tris•HCl （pH6.8） 2. 1.5 mol/L Tris•HCl（pH8.8） 3. 10% SDS 4. 10% 过硫酸胺（AP） 7. 还原型 5XSDS 上样缓冲液 8. 10X电泳液缓冲液 9. 10X转膜缓冲液 10. 1X转膜缓冲液 11. 10XTBS缓冲液 12. 1XTBST缓冲液 13. 封闭缓冲液: 1X TBST 含5% w/v 脱脂牛奶或者1X TBST 含2%-5%的牛血清白蛋白(BSA)。 14. 一抗/二抗稀释缓冲液: 常规稀释液使用的是含5% BSA 或5%脱脂牛奶的1X TBST，见一抗/二抗说明书；每种Elabscience®抗体都有固定的最佳稀释比例。 操作步骤 1. 根据待测蛋白分子量大小确定凝胶（分离胶）浓度制胶 2. 上样 使用适当的裂解液以及裂解方法裂解贴壁细胞、悬浮细胞或者组织样品。 3. 跑胶： 浓缩胶推荐用 80 伏电压，待样品进入分离胶后，可用 120-180 伏。 4. 跑胶完成以后，需先将胶上无样品的多余部分切除，滤纸和海绵需要预先润湿。 5. 分离的多肽转移至膜载体上 选择合适的膜 转膜：以NC膜为例 提前十分钟到半小时用转膜 Buffer 润洗 NC 膜 按照以下的结构来安装转膜体系：负极-海绵-三层滤纸-胶-膜-两层滤纸-海绵-负极。 6. 转膜，一般为 2 小时。 7. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。 将膜晾干备用。 8. 抗原检测 免疫印迹膜
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石蜡切片免疫组化实验步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
脱蜡和水化 1. 将切片依次浸入二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ（10 min）。 2. 再次浸入无水乙醇Ⅰ（5 min）-无水乙醇Ⅱ（5 min）-95%酒精（5 min）-80%酒精（5 min）-70%酒精（5 min），然后去离子水冲洗2次，每次2 min。 抗原修复 (可选) 3. 将组织切片放入修复盒，然后加入适量0.01M枸橼酸缓冲液（pH 6.0）或EDTA修复液（pH 9.0），液面要浸没组织。 4. 微波中档修复10 min（液体沸腾时开始计时），此过程中勿使组织干片。 5. 将修复盒从微波炉中拿出，自然冷却降温，当修复液降至室温后取出玻片，PBS（pH 7.4）冲洗3遍，每次3 min（冲洗过程中切勿对着组织冲洗，以免弄破组织）。 灭活 6. 将配制好的3%的过氧化氢（去离子水稀释30%过氧化氢）滴加于切片组织上以阻断内源性过氧化物酶，室温孵育15 min，PBS冲洗3次，每次3 min。 抗体孵育 7. 吸水纸吸干PBS，在玻片上滴加5%的正常血清（与二抗种属来源一致或相似），37℃封闭30 min。 8. 用吸水纸擦干玻片组织周围的液体，用油性笔在组织周围画圈，然后滴加稀释好的一抗，如果做阴性对照实验，就在对照组的组织上滴加PBS。加完一抗后于4 °C湿盒中孵育过夜。（抗体的最佳稀释比应预先通过实验确定，时间控制在15h以上）。 9. PBS 冲洗切片3次，每次3 min，吸水纸擦干切片后滴加辣根过氧化物酶标记二抗 ，37 ℃孵育30 min。 信号检测 10. PBS冲洗切片4次，每次3 min，甩去PBS液体后吸水纸擦干切片，每张切片滴加新鲜配制的DAB显色液，显微镜下观察，阳性信号为棕黄色或棕褐色，时间要控制好，切勿显色过深。用自来水冲洗切片终止显色。 11. Harris苏木素复染，一般30 s-1 min左右，水洗后用1%的盐酸酒精分化，再用自来水冲洗返蓝。（染核，可选） 脱水固定封片 将切片置于水中冲洗后，将切片依次放入：70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-无水乙醇Ⅰ-无水乙醇Ⅱ-二甲苯Ⅰ-二甲苯Ⅱ中脱水透明，每个试剂中放置2 min，最后在通风
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IHC原理、操作及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性及定量的一项技术。 IHC的实验流程和方法总体不难，但做出漂亮的染色结果却不容易，所谓“细节决定成败”，也正是IHC实验中尤为重要的关键点。那么“细节”主要是哪一些呢？下面就为您一一道来。（以石蜡组织切片为例介绍） 1. 标本固定 固定的目的除了使细胞内的蛋白质凝固，减少或终止内源性或外源性细胞内分解酶的反应，防止组织细胞自溶，更是为了保存组织或细胞内的抗原性，使抗原不失活，不发生弥散。不同的抗原对固定液耐受程度不同，因而要选择合适的固定剂。 现在常用的固定剂有中性甲醛液，4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液。有些固定剂对特殊组织有更好效果，如苦味酸对于头皮、指甲固定有软化效果，Helly固定液对于胰岛和垂体效果较好，PLP固定液对于含糖组织抗原保存更好。 2. 脱水、石蜡包埋和制片 脱水用梯度乙醇(由低到高)充分脱水，对于一些易脆的组织（如肝、脾等）应减少高浓度酒精里的停留时间，透明的时间也应该控制缩短。对组织浸蜡时，一般选用56℃~58℃熔点的石蜡，浸蜡温度**不超过60℃，防止抗原的损失。包埋时应选好角度动作迅速，以便切片时有完整的切面。切片时则要该快则快该慢则慢，及时检查刀片是否出现缺口，防止蜡带出现划痕。 3. 脱蜡和水化 使组织恢复到固定后的正常状态暴露出抗原以方便与一抗结合。若脱蜡和水化不全易出现局灶性反应和浸洗不全，而产生非特异性背景着色。 4. 抗原修复 由于组织在甲醛或多聚甲醛固定过程中，发生了蛋白之间交联及醛基的封闭作用，从而掩盖抗原决定簇。通过抗原修复，使得细胞内抗原决定族重新暴露，提高抗原检测率。常用的修复方法从强到弱一般分为三种，高压
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免疫组化实验原理和步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理： 抗体和抗原之间的结合具有高度的特异性，免疫组织化学正是利用了这一原理。先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫动物后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的同类的抗原物质。由于抗原与抗体的复合物是无色的，因此还必须借助于组织化学的方法将抗原抗体结合的部位显示出来，以其达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性，定位或定量的研究。 实验材料： （一）仪器设备 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉、水浴锅 （二）试剂 1、PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L、KCl 2.7mmol/L 、Na2HPO4 4.3mmol/L、KH2PO4 1.4mmol/L。 2、0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g、柠檬酸0.4g。3、0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。 4、1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。 5、 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。 6、3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。 7、风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合b 油和TBS(PBS)配制 8、TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。 实验步骤： （一）脱蜡和水化： 脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 1、 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟。 2、无水乙醇中浸泡五分钟。 3、 95%乙醇中浸泡五分钟。 4、75%乙醇中浸泡五分钟。 （二）抗原修复： 用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： 1、抗原热修复 （1）高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m柠檬酸钠缓冲溶液（ph6.0）。盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟
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琼脂糖凝胶电泳的原理及实验过程
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理 琼脂糖凝胶电泳常用于分离、鉴定 DNA、RNA 分子混合物，以琼脂凝胶作为支持物，利用 DNA 分子在电场中时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA 分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中由阴极向阳极运动。在一定的电场强度下，忽略DNA分子携带的电荷，DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA 分子的迁移速度与相对分子量成反比。 不同构型的 DNA 分子的迁移速度不同。如环形 DNA 分子样品，其中有三种构型的分子：超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形 DNA 分子(IDNA)。这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为:cccDNA＞IDNA＞ocDNA。 核酸电泳通常使用琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶两种介质。琼脂糖是一种聚合链线性分子；聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）在 N,N,N′-四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸铵（AP）的催化下聚合形成长链，并通过交联剂 N,N′-亚甲双丙烯酰胺（Bis）交叉连接而成。琼脂糖凝胶适合分离200bp至近50kb的DNA片段，而聚丙烯酰胺凝胶对于小片段（5bp-500bp）的分离效果**，且分辩力极高。选择不同浓度的凝胶，可以分离丌同大小范围的 DNA 分子。电场强度愈大，带电颗粒的运动赹快。但凝胶的有效分离范围随着电压增大而减小，所以电泳时一般采用低电压，不超过 6V/cm。而对于大片段电泳，可以选择 0.5-1.0V/cm 电泳过夜。如果选择高电压电泳，可使用聚丙烯酰胺凝胶。 核酸电泳常采用 TAE、TBE、TPE 三种缓冲系统。TAE 价格低廉，但缓冲能力低。TPE 在进行 DNA 回收时，会使 DNA 污染磷酸盐，影响后续反应。所以综合考虑，多采用 TBE 缓冲液。 核酸电泳中常用的染色剂是溴化乙锭（EB）。溴化乙锭是一种扁平分子，可以嵌入核酸双链的配对碱基之间。在紫外线照射 BE-DNA 复合物时，通过发光指示核酸的位置。由于EB有较强的挥发性和毒性，现在大多选择EB替代品进行试验，比较常用的有gelred，goldview，ybr-gree
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知识分享：去泛素化酶（DUBs）家族专题介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
去泛素化酶（DUBs）,是一类数量很大的蛋白酶类家族。它主要通过水解泛素羧基末端的酯键、肽键或异肽键，将泛素分子特异性的从链接有泛素的蛋白质或者前体蛋白水解下来。人类基因组编码近100种去泛素酶，使得它们成为泛素系统酶中最大家族。在人类中的去泛素化酶基因，可分为两大类：半胱氨酸蛋白酶家族和金属蛋白酶家族。半胱氨酸蛋白酶家族包含一些泛素特异型加工蛋白酶（USPs），泛素羧基末端端水解酶（UCHs），Machado-Josephin结构域蛋白酶（MJDS）和卵巢肿瘤相关蛋白酶（OTU）。金属蛋白酶家族只包含MPN(+)/JAMM蛋白酶家族。 去泛素化酶在泛素化途径中扮演重要的角色，在泛素-蛋白酶系统中已泛素化的蛋白底物，通过裂解切断泛素链与底物蛋白之间的连接及泛素化链之间的连接，使泛素分子从蛋白质底物中脱离出来。 А -泛素化蛋白质（在泛素-蛋白酶体系统中蛋白质正在降解），В，D - 与完全除去泛素分子的蛋白质，蛋白恢复正常运作，С，部分地去除泛素分子的蛋白质，蛋白酶体降解或其在细胞中的位置改变。 维真生物现货库中有供做各类去泛素化酶（DUBs）研究的基因现货，目的基因已克隆至穿梭载体、腺病毒载体，各类去泛素化酶的腺病毒现货等以最短的周期，最优惠的价格供您使用。
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如何阅读基因载体图谱
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
基因载体是基因工程的核心，也是基因**中强有力的生物工具，我们先来认识和阅读载体图谱吧。 一、载体分类及载体组成元件 载体分类 1、按属性分类：病毒载体和非病毒载体 病毒载体是一种常见的分子生物学工具，可将遗传物质带入细胞，原理是利用病毒具有传送其基因组进入目的细胞，进行感染的分子机制。可发生于完整活体或是细胞培养中。可应用于基础研究、基因疗法或疫苗。用于基因**和疫苗的病毒载体应具备以下基本条件： （1）携带外源基因并能包装成病毒颗粒； （2）介导外源基因的转移和表达； （3）对人体不致病； （4）在环境中不会引起增殖和传播。 非病毒载体一般是指质粒DNA。 2、按进入受体细胞的类型分类：原核载体、真核载体、穿梭载体（含原核和真核2个复制子，能在原核和真核细胞中复制，并可以在真核细胞中有效表达）。 3、按功能分类：克隆载体、表达载体 克隆载体：具有克隆载体的基本元件（Ori，Ampr，MCS等），可以携带DNA片段或外源基因进入受体细胞并克隆和大量扩增DNA片段（外源基因）的载体。 表达载体：克隆载体中加入一些与表达调控（具有转录/翻译所必需的DNA顺序）有关的元件即成为表达载体。 载体组成元件 1、复制起始位点Ori：即控制复制起始的位点。Ori的箭头指复制方向，其他元件标注的箭头多指转录方向（正向）。 2、抗生素抗性基因：可以便于加以检测，如Amp+ ，Kan+ （1）Ampr：水解β-内酰胺环，解除氨苄的毒性。 （2）tetr ：可以阻止四环素进入细胞。 （3）camr：生成氯霉素羟乙酰基衍生物，使之失去毒性。 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸转移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。 （5）hygr：使潮霉素β失活。 3、多克隆位点：MCS克隆携带外源基因片段，它具有多个限制酶的单一切点，便于外源基因的插入。如果在这些位点外有外源基因的插入，会导致某种标志基因的失活，便于筛选。决定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。还要再看外
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手把手教你设计shRNA
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
一、认识shRNA： 在研究基因功能中，RNAi由于可以特异性地使基因沉默或表达量降低而成为生物实验中的有力工具。其中，shRNA是可以克隆至表达载体并表达siRNA双链的DNA分子。今天给大家分享两种能快速设计shRNA的方法。 二、shRNA的设计: 1. Sigma网站 Sigma公司做了一个针对人和小鼠的shRNA库，而且部分基因的shRNA序列经过验证，因此直接使用Sigma公司已验证过的RNAi序列最为方便。 首先打开网址：http://www.sigmaaldrich.com/life-science/functional-genomics-and-rnai/sirna/mission-predesigned-sirna.html 出现以下界面： 以NLRP3基因为例，直接输入基因名，点击search，出现以下界面： 在Products中找到并点击shRNA选项，出现以下界面： 点击“MISSION shRNA Lentiviral Transduction Particles”这一行的“价格”，这时会弹出界面展示针对目的基因的shRNA，界面如下： 注：建议选择CDS区的shRNA，3UTR基本不选，而且选择的每一条shRNA尽量在NCBI上做下BLAST，确保靶点的特异性。 2. Life Technologies网站 Life Technologies公司有个非常实用的在线shRNA设计软件，操作非常方便，而且设计出来的shRNA不需要再到NCBI上Blast，直接可以使用。 首先打开网址：https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/sort.do，在Target Design Options处选中shRNA，以NLRP3基因为例，输入Accession number或Nucleotide sequence，其他条件不变： 下拉点击“RNAi Design”，出现如下页面： 选取原则：1.避免选取GGG和CCC等高GC序列 ；2.ShRNA目的序列的第一个碱基必须是G以确保RNA聚合酶转录。如果选择的目的序列不以G开头，必须在紧连正义链的上游加一个G。 根据Rank评星，从中选取合适靶点序列（一般选择4条，不同位置各一条），点击Design shRNA Oligos： 然后在“Default Loop Sequence”选择合适的序列，在“Custom Loop Se
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武汉伊莱瑞特教你ELISA实验样本处理方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
可用于ELISA实验的样本一般有血清、血浆、尿液、细胞培养上清以及组织匀浆等。不同样本类型的预处理方法也不同。适当的样本预处理是确保ELISA实验正确性和准确性的第一步。这里，我们将介绍几种不同样本类型的处理方法。 1. 血清 血清是ELISA实验最常用的样本，其预处理也十分简单。 使用无热原无内毒素的试管或离心管采集血液样本，将试管或离心管在室温下放置2小时或4℃过夜，分离出血清（建议倾斜试管或离心管以扩大液面的横截面，使血清可以更大程度地分离出来）。4℃下以1000×g离心20分钟，小心收集上清液（血清），立即进行测定。建议在-20℃或-80℃下将收集的血清分装保存，避免反复冻融。 在收集血液样本的过程中应避免溶血，因为红细胞在溶解时会释放具有过氧化物酶活性的物质，这种情况下，ELISA实验中将会出现非特异性显色反应，导致检测结果不准确，出现假阳性结果。另外，样本还应避免细菌污染，因为细菌可能含有内源性HRP，也会导致检测结果不准确。 2. 血浆 使用含抗凝剂的采血管或离心管采集血液样本，采集后30分钟内，4℃下以1000×g离心15分钟，小心收集上清液（血浆）。建议在-20℃或-80℃下将收集的血浆分装保存，避免反复冻融。样本应避免溶血或高血脂。常见的抗凝剂包括EDTA，肝素钠，枸橼酸钠等。检测前请仔细阅读ELISA试剂盒说明书，查看该试剂盒针对抗凝剂是否有特殊要求。 3. 细胞培养上清 将细胞培养上清液吸入离心管中并以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融。 4. 细胞 反复冻融方法 1） 吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。 2） 将细胞悬浮液收集到离心管中，以1000×g离心10分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次。 3） 加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。在6孔培养板中，每个孔需要150-250μL的PBS来重
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武汉伊莱瑞特教你计算ELISA结果
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
作为ELISA的最后一步，检测结果的计算对整个实验十分重要。 以夹心法为例。 1. ELISA的样本通常要设置1~2个复孔进行检测，分别求出标准品、实验组样本的吸光度的平均值。单个样本的检测值不应超出平均值的20%。 2. 样本的OD（吸光度）平均值要减去标准品浓度为0时的OD平均值。 3. 建立标准曲线 在对数坐标图上拟合四参数的逻辑函数曲线（X轴上为标准品浓度，Y轴为对应的OD值）。推荐使用origin软件。 详细步骤如下： 第一步: 输入OD值和标准品浓度 第二步：选择拟合曲线类型 选中输入的数值框，按如下操作依次点击选项。 第三步：勾选“find specific X/Y” 完成上述操作后，点击Fit按键，拟合曲线和相关信息将自动生成（如第四步所示） 第四步：查看标准曲线信息（如参数值，R-Square等） 第五步：设置坐标轴类型为对数。 双击第四步中的拟合曲线图，对其进行编辑。双击X轴、Y轴设置坐标类型为“Log10”。 第六步：根据标准曲线计算样本浓度 选择第四个工作表（Fit NLF Find X from Y1），在左列输入样本的OD值，对应的浓度将在右列自动生成。 如果样本的OD值超出标准曲线的上限，请在实验前适当稀释样本以获得精确结果。在分析数据时，样本实际浓度应为标准曲线上获得的浓度乘以稀释倍数。
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高通量光合、呼吸及能量代谢测量技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
随着CO2等传感器技术的创新发展，特别是荧光光纤O2传感器技术的应用，高通量测量微小生物如藻类等浮游植物、浮游动物、鱼类虫卵、土壤微生物、果蝇、斑马鱼等呼吸与能量代谢，对于实验生物学研究、污染生态学与环境毒理学、环境科学与气候变化研究等，都具有越来越重要的意义 早在2005年，为了实现个体水平上的海底无脊椎动物胚胎（或幼虫）的呼吸率的高通量测量，美国特拉华大学的Szela和Marsh把384孔微量滴定板改造成384个呼吸室/微型呼吸计，采用平板读取的荧光计对卤虫无节幼虫的呼吸率进行了持续实时的测量（参见下图）。 Koster等（2008）则对海洋浮游动物（桡足类幼虫）呼吸进行了实时监测，得到稳定的线性呼吸率曲线（参见下图）。 商业化的高通量呼吸测量系统的问世，使得水生动物的胚胎（或幼虫）呼吸测量变得高效、精确，配合自动化的水体环境因子调控的设备，鱼类等水生动物的胚胎和发育学研究变得方便快速。例如，2017年，美国加利福尼亚大学的Flynn和Todgham采用高通量呼吸测量技术，对发育的南极鱼代谢活动进行了测量和分析（参见下图）。 美国海洋和大气管理和研究局的（NOAA）Xaymara Serrano等（2018）使用200微升的高通量呼吸系统测量了两个物种的加勒比礁珊瑚幼虫的耗氧率（参见下图）。研究团队的成员来自位于迈阿密的大西洋海洋和气象实验室以及迈阿密大学海洋与大气学院，他们研究了多种因子（如温度、硝酸盐富集）对幼虫的活动的影响，研究结果刊登在《Coral Reefs》杂志上，并在论文里详细介绍了他们是如何使用该技术测量如此微小的生物的耗氧率。 不列颠哥伦比亚大学的Bernhardt等（2017），则利用200微升的高通量溶解氧测量技术，对浮游植物细胞光照条件下的放氧量及黑暗条件下的氧气消耗量进行了测量分析，并计算其质量归一化代谢率（氧通量/总细胞体积）和光合作用的活化能。实验中使用了透明的PCR膜密封呼吸室，在3小时内每隔15秒测量一次氧气浓度（参见下图）。 英国约克大学的Pren
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单细胞ICP-MS联合HCS为您揭秘顺铂化疗耐药机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
传统化药·机制研究·精准** 顺铂（Cisplatin）是1978年经FDA批准用于临床**癌症的化疗药物。顺铂药物的**机制是通过结合形成Pt-DNA复合物，干扰DNA复制合成，从而杀死快速增殖的癌细胞，属于细胞周期非特异性药物。许多癌症患者最初对基于铂类的**比较敏感，但一段时间后，患者通常对顺铂**表现出耐药性，导致了癌症复发。因此在化疗后细胞必须修复DNA 损伤，否则DNA 复制受阻会导致细胞死亡。对于顺铂的耐药机制研究，也是目前抗癌药物研究热点。目前三种主要的分子机制包括DNA 修复加速，胞浆失活加速和细胞摄取药物能力的变化。其中，细胞摄取药物能力的变化主要表现在细胞对顺铂的摄入能力降低及顺铂转运加速。 单细胞ICP-MS NexIon2000 1. 单细胞水平顺铂摄入研究[1] 细胞内顺铂的摄入与肿瘤负荷相关，也就是说肿瘤对顺铂反应降低会导致细胞内顺铂的含量降低。所以，分析单个细胞水平对顺铂的摄入和分布对于评估**的有效性具有非常重要的意义。过多顺铂进入细胞内会增加DNA 损伤和细胞死亡的频率。了解单个细胞水平及细胞亚群对顺铂的摄入的机制将能为新疗法的开发提供科学依据，以改善肿瘤对顺铂的耐药性，降低肿瘤复发率。 单细胞电感耦合等离子体质谱 (SC-ICP-MS)是以单颗粒电感耦合等离子体质谱技术为基础，测量单个细胞（或单个纳米颗粒）在进入等离子体时产生的离散信号，对溶液中对金属元素进行评估与定量。每个细胞中的金属成分离子化，产生离子流，检测器以每秒100000 数据点的速度快速对信号采集测量，从而使得单个细胞中的金属含量能被定量到阿克（ag）/ 每细胞的水平。相比测量细胞内顺铂摄入的传统方法，SC-ICP-MS 所得结果的信息量更加全面。 通过对两株卵巢癌细胞系A2780（顺铂敏感型）和A2780/CP70（顺铂耐药型）顺铂摄入量的实时检测发现：相比A2780 敏感细胞系，顺铂摄入在耐药性的A2780/CP70 细胞系上水平降低；但顺铂摄入的细胞差异性不是由于细胞周期的不同，因为血清饥饿细胞并不改
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知识分享：稳转株的制备
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理： 利用哺乳动物系统生产蛋白的方式有两种：瞬时转染和稳转株筛选。通过稳定细胞系构建筛选稳定表达细胞株。针对瞬时转染，外源基因在短时间转录翻译得到的蛋白量较少，能够满足小量蛋白制备，大量生产成本很高。相对于此，稳定转染的是将外源基因整合到细胞自身的基因组上，随着细胞的生长分裂外源基因可以稳定转染表达，同时经过抗生素加压筛选，最终得到能够稳定转染表达蛋白的细胞株，稳转株生产蛋白稳定性更好，批次差异性更小。 稳定转染的应用 稳定转染适用原因 稳定转染应用 外源基因要整合到细胞染色体上 基因敲除以及基因插入突变筛选等修饰基因组的研究 细胞之间存在个体差异，同一类型细胞，不同个体细胞 基因组存在差异，会对实验结果造成干扰 单克隆稳转株筛选 外源基因未整合到细胞会导致注射入动物体内后，外源 基因片段很快丢失 需要在动物体体内注射已经表达外源基因的细胞 一些蛋白稳定性很强，瞬时 RNA 干扰作用周期短，无法去除已经表达的目的蛋白 需要通过稳转株筛选，实现更好的基因干扰效果 稳转株筛选很大程度上降低频繁转染或者病毒包装的 成本，也很大程度上方便实验研究 在某些细胞中长期研究基因的功能 通过稳转株筛选，能使那些病毒载体也无法达到高转导 效率的细胞高效表达外源片段 获得外源片段的高效表达 避免引入人为因素影响实验结果的精确性，稳转株筛选 有助于筛选出拷贝数适量的细胞 得到过表达的目的基因或干扰拷贝数 影响稳定转染的因素 1、外源基因整合的几率 决定了稳转株筛选的简易程度，有利于稳定转染细胞的获得； 2、插入外源基因片段的拷贝数 一般情况下，低拷贝或者单拷贝可以降低人为因素的干扰； 3、整
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