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Sartorius & Science Prize亚军研究:构建更好的胆管
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
在肝脏内，胆管以管道网络形式分布，可将肝脏分泌的胆汁输送到肠道。在胆道疾病中，胆汁运输障碍会导致肝脏内毒性胆汁淤积、肝脏损伤及永久性瘢痕 （肝硬化），最终只能通过肝移植来**。实际上，胆道疾病（胆管病）是导致儿童肝移植的首要病因（70%），占成人肝移植病因的三分之一。 虽然此类疾病影响巨大，但我们对于胆道疾病发病机制的了解仍十分有限，一方面由于缺乏有效的实验模型，另一方面因为胆管细胞（胆管上皮细胞）体外培养非常困难。此外，目前**方法有限，既缺少特效药物，也缺乏手术重建或替换病灶胆管所需的正常细胞和组织。我的研究重点就是解决这些难题。 具体而言，我的研究目标是开发一套适合人胆管上皮细胞体外生长的系统；利用这些细胞构建胆管病体外模型；并利用这种体外模型筛选、测试和发现新的胆道疾病**药物。我还尝试利用健康胆管细胞构建生物工程胆管，并在动物模型中证明其能够用于胆道的手术重建或替换。 培养人胆管上皮细胞 人胆管上皮细胞的培养面临两大阻碍，即：不通过手术方式获取胆管组织，以及胆管上皮细胞原代培养过程中功能会丧失。为了解决组织获取的问题，我设计了一套从人诱导性多能性干细胞 (hIPSC) 获取胆管上皮细胞的操作流程，而hIPSC可方便地从患者皮肤样本中获得。 为了在体外培养中保留人胆管上皮细胞的功能和特性，我采用三维培养方式将细胞培养成类器官，后者呈现中心有空腔的囊状或管状结构 (1, 2)。类器官围绕管腔逐渐发育形成的结构类似于天然的胆道，这种hIPSC来源的胆管上皮细胞功能更好，生长更快。该方法也首次实现了利用切除的胆管或胆囊大量培养人原代胆管上皮细胞 (3)。 为了证明这种类器官平台既具有培养优势，又能保留正常的胆管上皮细胞功能，我将hIPSC来源的胆管上皮细胞或原代培养物与人体内胆管细胞进行了生理和功能比较。实验结果表明，类器官培养获得的胆管上皮细胞与体内来源的人胆管细胞类似，是目前为止最为准确的体外胆管上皮细胞平台。
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追根溯源：细说靶向重测序与扩增子捕获技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
追根溯源：细说靶向重测序与扩增子捕获技术 Thermo 与 Illumina合作的消息公布之后，在生物医学界投下了一颗重磅炸弹，Ion Ampliseq也一下子成为网络热搜词。Ion Ampliseq这个技术究竟是什么？它有什么独特之处？为什么这个技术会造成轰动性的效应呢？让我们追根溯源，从NGS说起。 NGS，即下一代测序技术（Next-generation sequencing technology）又称高通量测序技术（High-throughput sequencing），以能一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定但读长一般较短为标志。 NGS技术正逐年成熟，这使得全基因组测序的成本越来越低，但是对全基因组进行测序后得到的极其庞大、繁杂的数据量的分析工作并没有随之一起变得更加简单，恰恰相反，更高的测序深度反而导致最后的数据量变得更加庞大了,分析工作也变得更加困难。于是，测序技术的发展出现了两个极端的方向：一种是大而全的全基因组测序，一种是小而精的靶向重测序。 相比于全基因组测序（WGS），靶向重测序技术直接从样品中对感兴趣的基因组区域进行分离测序。这种方式能够更加高效且经济地发挥NGS技术的优势，后续的分析速度也会有跨越性的提升。比如外显子组仅占基因组的1%左右，但却包含了绝大部分的已知致病突变，将外显子区域分离出来后单独进行测序，后续的分析就能降低99%的工作量，极大的加快了分析的速度。 在遗传突变、肿瘤筛查等领域，靶向重测序所能达到的灵敏度也是全基因组测序完全无法实现的。由于靶向重测序在测序前就对基因的目标区域进行了分离与富集，目标区域的大幅减少可实现5000×甚至更高的测序深度。测序深度的提高意味着更高的灵敏度（能够检测低频率的变异），其检测极限低至0.1%。 、 靶向重测序中，目标片段的富集主要由两种方式来实现：杂交捕获和扩增子捕获。 ○●○ 杂交捕获技术 通过设计与目标片段互补的生物素化探针，使其与含目的基因的片段进行杂交，以达到将目的基因片段富集后进行高通量测序的目的。根据支持物的不
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Microtomy and Paraffin Section Preparation
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
Utilize Safety Features Properly You must be familiar with the safety features of the microtome you are using and observe some basic rules when cutting sections. Microtome knives and disposable blades are extremely sharp and can inflict serious injuries unless appropriate care is taken when working with them. Accidents occur when a microtomist is distracted and not concentrating fully. Use forceps or brush instead of your fingers to pick up sections or wax fragments from blade or block face. • Leica rotary microtomes are equipped with a safety guard (knife guard or finger guard), a handwheel lock and a handwheel brake to enable safe operation. The safety guard can be positioned to cover the whole length of the cutting edge. The handwheel lock will lock the object head at the top of the cutting stroke and must be used when changing blocks. The guard must be in place and the handwheel lock engaged when a block is being placed into or removed from the cassette clamp, or when any manipulation of the block is being undertaken while the knife or blade is in place. The guard must also be used when the microtome is left unattended. The handwheel brake will lock the microtome when the handle is in any position and is used when realigning a block face or adjusting the coarse feed. The red safety guard on the Leica RM2235 Microtome has been flipped up into place in this illustration. It completely covers the cutting edge of the blade. The handwheel lock is shown here with the handwheel in the 12 o'clock position and the lock engaged. This lock will only engage in this p
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如何摸索慢病毒最佳MOI值
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
MOI （multiplicity of infection），即感染复数，指的是感染时病毒与细胞数量的比值。一般认为MOI是一个比值，没有单位，其实其隐含的单位是pfu number/cell。但对于某些病毒如AAV病毒，无法用pfu表示病毒的数量，而是采用TU、IU、病毒颗粒（viral particles, v.p）或基因组数量（vector genome,v.g.）来表示病毒数量。 慢病毒（Lentivirus）载体是基于HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）的单链RNA病毒载体，可感染分裂或非分裂细胞，并将外源基因有效地整合到宿主染色体上，且具有较低的免疫原性，被广泛应用于各种体外细胞实验中。 常见细胞MOI参考值（慢病毒） 慢病毒MOI值摸索步骤 实验前信息准备 目标细胞系培养条件及增殖速度 排除细胞支原体污染 查阅文献，获得目标细胞参考MOI值（如没有相关文献，则可首先设置较大梯度的MOI进行预实验） MOI梯度设置 在查阅到的参考MOI值前后各设置2个梯度，每个梯度至少相差2倍，举例：查阅到某细胞系在文献中慢病毒MOI应用为10，则设置MOI梯度为2.5-5-10-20-40。 低于参考值 低于参考值 查阅到的MOI 高于参考值 高于参考值 （可视情况省略此设置） 2.5 5 10 20 40 根据公式计算所需添加的病毒量： MOI值=病毒滴度（TU/mL）×病毒体积（mL）/细胞个数 铺细胞 在96孔板中铺1×104个细胞/孔，培养基定容至100μL/孔； 慢病毒感染 依据所计算出的病毒体积，逐个孔添加慢病毒，并于感染次日更换新鲜培养基。 （5）确定MOI范围 a．带荧光标签的慢病毒：观察荧光 感染后72小时后，于荧光显微镜下观察细胞状态和荧光情况，确定细胞状态较好且荧光数较多的孔，对应为较适宜的MOI值。 不带荧光标签的慢病毒：抗性筛选（puromycin/bla
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维真稳转株构建流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
稳转株即稳定表达细胞株，指的是基于某一细胞系构建的持续过表达或干扰某特定基因的细胞系。慢病毒感染-药物筛选法是目前广泛应用的稳转株构建方法，具有高效整合、目标细胞广泛等特点。 一．准备及预实验 确定细胞系相关信息，需包括如下内容 目标细胞系培养条件 目标细胞增殖速度 支原体污染情况 注：为避免慢病毒感染后细胞死亡，务必保证细胞无支原体污染！ 预实验确定MOI值 查阅文献确定慢病毒在目标细胞系中的MOI； 参考查阅得到的数据，设计梯度实验，摸索最适MOI。 预实验确定筛选药物用量： 查阅Puromycin/Blastincidin等在目标细胞系中稳转株筛选的致死用量信息； 参考查阅得到的数据，确定3个药物浓度梯度（如没有相关信息，则需将药物浓度梯度范围增大，数量增多至6个）； Day0将细胞铺于6孔板中，使Day1细胞融合度约90%； Day1按（2）中设置的药物梯度，加入药物； Day4换液，并重新加入药物； Day7观察，找到致死率100%的孔，该孔使用的药物浓度，即为药物筛选浓度。 附1：经验筛选药物用量 二．稳转株筛选及构建 注：以下实验参数，按1株稳转株为例描述，实验需考虑有无对照稳转株！ 细胞铺板： 将细胞接种于6孔板中（4个孔），使次日细胞融合度约70% 病毒感染： 根据预实验确定的MOI值，计算慢病毒体积，添加慢病毒（每孔添加ADV-HR 2μL）； 换液： 慢病毒感染次日，将细胞进行换液处理； 观察感染效率： 感染后72小时，观察感染效率，效率最低不应低于40%。 筛选： 多克隆稳转株：从感染72小时后开始于6孔板中加筛选药物，每隔2天，重新换液加入药物。药物筛选需至少持续14天，直至显微镜下观察荧光细胞比例为100%。 注：第一次加入药物时在上午进行，4-6小时后观察细胞状态，如细胞死亡过多，需更换新鲜不含药物的培养基。 附2：多克隆稳转株 多克隆稳转株的荧
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沃特世全新检测技术让“神草”人参不再神秘
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
人参自古就被视为神草，几千年来一直被视为一种拥有众多疗效的神奇药材。随着现代药理学和实验室检测技术的发展，人参作用于人体代谢并发挥作用的过程逐渐明确。目前我们发现，人参中的主要成分是人参皂苷——人参皂苷是一种固醇类化合物，它通过影响多重代谢通路发挥抗肿瘤、抗高血压、抗病毒和免疫调节等效能。 而就在今年年初，吉林大学传来人参皂苷研究达成新成果的好消息，吉林大学的一个课题组成功发现了人参皂苷的人类靶点，为认证人参的抗肿瘤功效提供了重要线索。这个课题的部分成果已经在《自然》旗下开放子刊《科学报告》上发表，这是有关人参皂苷人类靶点的首次报道。能取得这样的成果，可以说离不开现代的实验室检测技术。 人参皂苷有十几种之多，他们根据糖苷基架构的不同被分为达玛烷型和齐墩果烷型两大类。人参皂苷类别和含量的变化导致人参不同组织如根和根状茎的临床疗效和临床运用的差异，因此研究不同人参皂苷在组织中的空间分布能为人参的临床运用提供更多参考信息，同样有利于理解和改进人参的育种和培养。 目前，业内的一个前沿方向是利用解吸电喷雾电离(Desorption Electrospray Ionization, DESI)进行人参皂苷的检测。DESI是一种快速的大气压环境下的质谱成像技术。与其他质谱成像技术如MALDI相比，DESI几乎不需要对样品进行前处理(如研磨，萃取，衍生等)，因此能真实的反应化合物在样品中的分布情况。 实验方法 样品制备： 4年生IR826人参的主根用于制备20 μm的冰冻横切片用于DESI质谱成像 质谱分析方法： 质谱系统: Waters Xevo G2-XS Tof 电离模式: ESI- 毛细管电压: 4.5 kV 锥孔电压: 80 V 质量扫描范围: m/z 100-1200 喷雾溶剂: ♦ 90% MeOH ♦ 10% H2O ♦ 0.1mM NH4Cl ♦ 0.1 mM leucine enkephaline (lockmass，m/z 554.2615) 喷雾流速: 1.5 μL/min 像素大小: 100 μm x 100 um 扫描速度: 400 μm/s 质谱数据成像: Waters HDImaging 通过这一方法，我们可以得到： 人参横切片可以分
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AAV在中枢神经系统研究中的注射方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
中枢神经系统是由许多不同类型的细胞构成的，包括神经元和神经胶质细胞。其中，根据不同的形态、大小和功能，神经元可以分为很多类型。而神经胶质细胞主要包括星形胶质细胞、少突胶质细胞和小胶质细胞。 AAV在中枢神经系统（central nervous system，CNS）中的应用包括很多方面，比如在神经系统疾病和中枢神经系统损伤中的研究和**，以及某些神经系统疾病模型的局部转基因研究等。 由于AAV的血清型、转录因子和注射位点的不同，AAV在大脑中介导的转基因通常不是均一的，这种不均一表现在时间和空间（不同细胞种类的特异性）方面。除此之外，AAV病毒制备的技术（影响纯度和滴度）、病毒注射的方法也会大大影响到AAV介导的转基因的效率。值得注意的是，AAV感染后所使用的检测方法和目的蛋白的自然属性（胞内蛋白/分泌蛋白/转运蛋白）等因素也会影响到最终对转基因效果的评价。组织学染色，比如免疫组化或单/双免疫荧光可以帮助观察转基因表达的分布特征，但却不能量化评价病毒感染的效率。对脑提取物进行ELISA或RT-qPCR可以定量转基因效率。 事实上，通过将AAV直接注射大脑或大脑外围区域（肌肉或静脉注射）能够产生不同的转导模式。已经有文献证明AAV9可在小鼠/猫和非人灵长类动物中穿过血脑屏障。并且，AAV载体可以从肌肉逆行运输到脊髓运动神经元（27-30）。简单来说，就是运动神经元的轴突接触到AAV病毒，并将其传递给胞体。实验表明，AAV1的逆行效率较高。本文主要介绍几种在神经科学研究中常用的AAV注射方法。 一．通过立体定位仪直接向脑内注射AAV（需佩戴手套和口罩） 目前，成年雌雄大鼠和小鼠的大脑图谱都可通过文献和书籍获得。立体定位手术时，颅骨上最常用的注射参照点就是前囱，也就是中矢状冠状缝的交叉点。具体的注射部位，可依据研究的需要而确定。微创技术可以避免炎症，以降低转导细胞的排斥反应。 1.安装定位仪: 在生物安全柜中安装立体定位框架和工具。 2.准备并吸满病毒悬
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ADV-HR（病毒助感染试剂）使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
一、产品概述： 产品名称: ADV-HR（病毒助感染试剂） 产品货号：FH880805 规格：1ml（标准规格）/100ul（赠送规格） 浓度：1mg/ml 二、储存条件： 建议分装后保存于-20℃，一周内使用4℃储存即可。注意避免反复冻融！反复冻融会严重影响实验效果，请予一周内使用！ 三、产品原理： ADV-HR(病毒助感染试剂）试剂通过物理吸附将病毒富集在细胞表面，从而增加病毒对细胞的感染效率，起到助感染的效果。 四、产品优点： 1、腺病毒、慢病毒感染均可使用； 2、可显著提高感染效率； 3、与同类型试剂产品相比毒性更低。 五、实验举例： （一）直接加入法（适用于较易感染的细胞类型） 1、进行病毒感染时，将ADV-HR试剂直接加入培养皿/孔/瓶中，混匀即可。 2、后续操作依病毒类型和实验需要而定。 （二）孵育法（适用于较难感染的细胞类型） 以6孔板为例： 1、在1.5mL EP管中建立100μL感染体系如下所示： ①ADV-HR XuL ②病毒 YμL ③细胞悬液 (100-X-Y) μL （含1.0×106个细胞） （其中ADR-HR用量X需参照附2及预实验结果；病毒用量Y需参照病毒滴度及实验所需MOI。） 用移液器轻轻吹打混匀，于37℃细胞培养箱中孵育0.5-1个小时。 3、用移液器将感染体系中的细胞轻轻悬起，全部转移至预先加有2mL培养液的6孔板中，37℃、5%CO2培养箱中培养。 4、后续操作依病毒类型和实验需要而定。 六、特别注意： 1、高浓度的ADV-HR具有细胞毒性，影响细胞状态和感染效率（详见附2）。我们建议您务必于目的细胞中进行ADV-HR浓度梯度预实验。 2、本试剂仅供与我公司的病毒产品搭配使用，和其他公司产品搭配使用所产生的一切后果均与我公司无关，本产品的最终解释权归我公司所有。 附1 ADV-HR使用案例 腺病毒感染A549细胞41h后拍摄的荧光图片： 慢病毒感染CNE2细胞72h后拍摄的荧光图片： 附2 摸索助感染试剂ADV-HR的使用极值
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做电泳实验常见条带问题分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
一、微笑形区带（两边翘起，中间凹下）： 形成原因：主要是由凝胶中间部分凝固不均匀引起的，多出现于较厚的凝胶中。 处理办法：待其充分凝固再做实验。 二、皱眉形区带（两边向下，中间鼓起）： 形成原因：主要出现在蛋白质垂直电泳槽中，一般是由两板之间的底部间隙气泡未排除干净引起的。 处理办法：可在两板之间加入适量缓冲液，以排除气泡。 三、区带拖尾： 形成原因：主要是由样品溶解效果不佳或分离胶浓度过大引起的。 处理办法：加样前离心；选择适当的样品缓冲液，加适量样品促溶剂；电泳缓冲液放置时间过长，重新配制；降低凝胶浓度。 四、区带出现纹理： 形成原因：主要是由样品不溶性颗粒引起的。 处理办法：加样前离心，加适量样品促溶剂。 五、鬼带： 形成原因：主要是由于还原剂在加热的过程中被氧化而失去活性，致使原来被解离的蛋白质分子重新折叠结合和亚基重新缔合，聚合成大分子，其分子量比目标区带大，有时不能进入分离胶。但它与目标区带有相同的免疫学活性，在免疫印迹反应中可见，能与目标区带对应的抗体作用。 处理办法：加热煮沸后再添加适量的DTT或Beta巯基乙醇，以补充不足的还原剂；加适量EDTA来阻止还原剂的氧化。 六、溴酚蓝不能起到指示作用： 形成原因：实验中常遇到溴酚蓝已跑出板底，但蛋白质却还未跑下来的现象，主要与缓冲液和分离胶的浓度有关。 处理办法：更换正确pH值的Buffer，降低分离胶浓度。 七、区带很粗： 形成原因：主要是由于浓缩胶未浓缩好。 处理办法：适当增加浓缩胶长度，保证浓缩胶贮液的pH正确（6.8），适当降低电压。 八、电泳电压很高而电流很低： 形成原因：主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。 处理办法：电泳槽正确装配。
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Corning - Apricot Designs应用实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
TPS EZ可一次性处理96/384个不同的样品，对于通量需求更高的客户，TPS EZ无疑是独树一帜的，已经成为广大科研工作者的得力助手。如果您拥有更高通量的需求，请联系我们！ 特点和优势 1. 可实现96、384、1536孔板间的液体操作，并可进行逐行和逐列系列梯度稀释； 2. 可选择使用一次性枪头或固定针式枪头； 3. 可选配8、12、16、24、96、384等多种锁头放置于台面上，仪器会自动装卸锁头； 4. 可选配对应的8、12、16、24、96、384等通道的枪头放置于台面上，自动装卸吸头； 5. 板位数量最多可达到20个； 6. 配备内部机械手，用于在仪器内部板位之间搬动微孔板、吸头、锁头等； 7. PC控制界面，直观易学，具有程序存储、孔板记忆等功能，再次操作无需重复设置； 8. 可选配负压、温控、震荡等多种功能模块； 9. 开放的台面设计可以方便配置外部机械手、叠板机等来满足实验室自动化需求。 以下为有关TPS EZ全自动核酸提取工作站与Corning的实验海报，请参考：
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Cre-loxP重组系统技术详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
Cre-loxP重组系统 一．Cre-loxP重组系统作用原理 1. Cre重组酶和loxP位点 Cre重组酶（Cyclization Recombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点。 LoxP（locus of X-overP1）位点长为34bp，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。 图1. Cre重组酶和loxP位点 （http://2012.igem.org/Team:Tsinghua-A/Project/Design） 2. Cre-loxP重组系统诱导基因重组的方式 Cre-loxP系统存在几种诱导重组的方式，这是基于Cre重组酶与loxP位点的相互作用而实现的。 当基因组内存在loxP位点时，一旦有Cre重组酶，便会结合到loxP位点两端的反向重复序列区形成二聚体。此二聚体与其他loxP位点的二聚体结合，进而形成四聚体。随后，loxP位点之间的DNA被Cre重组酶切下，切口在DNA连接酶的作用下重新连接。重组的结果取决于loxP位点的位置和方向。主要存在几下几种重组方式： （1） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列； （2） 两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转； （3） 两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位； （4） 四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。 图2. Cre-loxP诱导基因重组的方式 （https:///search/rolling%20circle%20replication） 二．Cre-loxP重组系统的优势 之所以Cre-loxP重组系统在转基因动物方面得到广泛的应用，因其具有非常明显的优势。主要体现在：时空特异、高效性、准确性、快速性。 图3. Cre-loxP重组系统的优势 三．Cre-loxP重组系统在转基因中的
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质粒转染试剂使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
一、性能参数 产品名称：Transfection Reagent 简称“TR” 产品货号： FH880806 浓度：1μg/μl 推荐使用浓度：1μg-10μg/ml 规格：50μl （赠送） 保存条件：2-8℃ ，切勿放-20℃ 有效期至： 18个月 运输条件：常温运输 使用范围：仅限科研使用，不能应用于临床。 二、产品详细描述 1、产品说明 TR（质粒转染试剂）是一种多聚阳离子聚合物，具有较高的阳离子电荷密度使得聚合物网络在任何 pH 下都能充当有效的“质子海绵”(proton sponge)体。这种聚阳离子能将各种报告基因转入各种种属细胞，其效果好于脂质聚酰胺，经进一步的改性后，其转染性能好于树枝状聚合物，而且它的细胞毒性低。 2、主要特点 · 高效转染各种贴壁细胞。 · 对悬浮细胞有很高的转染效率。 · 在同类产品中具有较高的转染效率和较低的毒性。 · 有无血清存在(0-20％)对转染试剂的效果无影响。 · 可用于单个质粒或多个质粒共转。 · 转染24-72小时后，有高的蛋白表达量。 3、注意事项 推荐在混合前使用Opti-MEM （Cat. No. 267485)或DMEM细胞培养基(Cat. No. SH30022.01B)稀释TR和核酸。 · 转染过程中勿向培养基中添加抗生素，以免造成细胞死亡。 · 不同批次实验请保持细胞接种条件相同。 · 转染前细胞的状态好坏对最终的转染效果高低影响很大，请务必保证转染前，细胞处于良好的生长状态。 三、质粒转染步骤 所列步骤适用于24孔板培养的哺乳动物细胞，其他培养材料，请参考表1按照转染规模调整，所有数量和体积均是按孔计算。大部分细胞系所使用的DNA(μg)与TR(μg)的比值为1:3或1:4，转染状态良好的细胞可获得高转染效率、高表达水平和低细胞毒性。 1、贴壁细胞：转染前一天每孔0.5-2×105个细胞接种于500μl培养基中，在转染时细胞可长至90-95%融合。 悬浮细胞：在配制转染液前每孔4-8×105个细胞接种于500μl培养基中。 2、转染
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IPTG诱导蛋白表达的实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
实验原理： E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激 活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表 达 。 在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结 合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 实验试剂： 1、LB（Luria-Bertani）培养基：酵母膏(Yeast extract)5g 、蛋白胨(Peptone) 10g 、NaCl 10g 、琼脂(Agar) 1-2% 、蒸馏水(Distilled water) 1000ml 、pH 7.0。 2、IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，-20 ℃ 保存。 3、凝胶电泳加样缓冲液 ：50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 、50 mmol / L DTT、 2 % SDS （电泳级）、 0.1 ％ 溴酚蓝 、10 ％ 甘油。 实验步骤： 1、用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA和目的基因； 2、按连接步骤连接目的基因和载体，并转化到转化DH5α感受态细胞中； 3、分别挑取单菌落接种于5 mL LB ( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃培养过夜； 4、以2 %体积比转接于2 ml LB( 0.1 g·L-1 氨苄青霉素)中，37℃继续培养2.5 hr，至细菌对数生长期，加0.1
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想洞悉细胞线粒体内部精细结构？全新SIM超分辨技术有话讲！
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
生物圈的小伙伴肯定还记得前段时间的一则刷屏新闻： 北京大学陈良怡教授团队和华中科技大学谭山教授团队合作，成功发明了一种新型结构光照明超分辨显微成像技术——海森结构光照明显微镜。研究成果于高水平学术期刊Nature Biotechnology（IF=41.67）进行了发表。 之所以轰动，是因为该技术拥有超高的采集速度和灵敏度，以及低于共聚焦和其他超分辨成像方法（STORM/STED等）千分之一以上的光毒性和光漂白效应，成为了目前进行超长时间活细胞高速超分辨成像的利器。 而且，这个牛气哄哄的技术一经发明，便已经夺得生物成像领域的好几个“首次”： · 首次在活体细胞中清晰解析出线粒体的内膜结构，以及线粒体融合与裂解过程中内膜的动态变化； · 首次观察到活体细胞中线粒体嵴与内质网之间的相互作用与运动； · 首次通过连续成像的形式，捕捉到了完整的囊泡分泌与融合过程中的孔道及融合中间态。 那么究竟这台高大上仪器是怎样被研发而出？它爆炸性的技能点具体又是怎样？接下来我们就来深度解读一下啦！ 实时观察线粒体融合分裂及内膜动态变化 从1994年Stefen W. Hell提出STED显微镜理论，到2014年三位科学家因为超分辨显微技术获得诺贝尔化学奖。短短20年间，超分辨成像可以说是声名大噪，各种超分辨成像平台也几乎成为了各大高校研究所的必备。 但是，一个奇怪的现象让北京大学的陈良怡教授产生了疑惑：虽然遍地开花，但由超分辨成像技术所带来的生物学新发现却屈指可数。究竟是何种原因，限制了超分辨显微成像在生物研究领域大显身手？ 目前，主流的超分辨成像技术主要有三类： 1、基于可随机开关的单分子荧光闪烁定位的STORM/PALM方法； 2、基于荧光蛋白受激发射损耗原理的STED方法； 3、基于结构光调制与解调制图像信息的SIM方法。 其中，STED通过纯光学方法能够获得50 nm甚至更低的分辨率，不通过算法拟合重建，成像速率取决于共聚焦平台的振镜扫描速率。但是其明
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云序生物最新m6A“RNA甲基化”研究汇总—非编码RNA篇
作者：德尔塔 日期：2022-04-20
RNA甲基化是目前申请国自然项目热点，也是唯一能在短短3个月内发数十篇nature，cell级别高分文章领域，近期RNA甲基化研究引起了科研工作者的研究热潮。因mRNA参与蛋白编码，之前多数文章针对mRNA甲基化进行研究（详细见云序课堂之前往期回顾）。然而许多研究表明发生m6A甲基化的非编码RNA在基因调控、干细胞分化、癌细胞增殖、组织生长发育等过程中起关键作用，因此对于非编码RNA甲基化研究也是越来越火热。今天，就让我们来讲讲m6A RNA甲基化调控非编码RNA家族中的明星成员：miRNA，LncRNA和circRNA。 1.Nature：m6A调控pri-miRNA的识别 影响因子：40.10 美国洛克菲勒大学的科研团队对人类乳腺癌细胞进行了m6A RNA甲基化测序，高通量数据统计结果表明m6A靶向的pri-miRNA上有许多METTL3 motif。因此，就METTL3是否参与pri-miRNA的m6A甲基化修饰问题展开了立项调查。经过细胞敲降，过表达，细胞定位等实验，证实METTL3与pri-miRNA结合。又经过Clip测序，表明METTL3与pri-miRNA可直接结合。这篇文章干货满满，还详尽介绍了两者的作用机制。 图1. m6A甲基化调控pri-miRNA 2.Nature：LncRNA(MALAT1)的m6A调控pre-mRNA合成 影响因子：40.10 美国芝加哥大学研究团队首次报道了一个LncRNA（MALAT1），与人类的肺癌相关，该基因的茎环结构上存在一处m6A修饰。作者通过RNA pull down实验，发现该位点发生m6A甲基化修饰后，与hnRNP C蛋白的结合能力增强。并证实甲基转移酶METTL3和METTL14也参与此过程。想研究单个位点RNA甲基化的老师们，可以参考一下这篇文章。 图2.MALAT1 上m6A甲基化修饰调控与hnRNP C结合 3.Cancer Cell：m6A甲基化调控LncRNA FOXM1-AS促进癌细胞增殖 影响因子：27.41 作者分析了多个癌症相关的数据库，预测到ALKBH5基因与恶性胶质瘤的不良预后有关。进行了功能实验后，也证实了其功能。随后，作者以敲减ALKBH5基因的细胞为样本，进行了m6A RNA 甲基化测序和转录组测序，迅速找到靶基因FOXM1。
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