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西安德尔塔带你了解：免疫组化石蜡切片的染色方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
西安德尔塔带你了解：免疫组化石蜡切片的染色方法 1、载玻片的处理： 抗原修复过程中,由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。这里选用ZLI-9001 APES、ZLI- 9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下： (1)APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。 (2)HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟,然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。 (3)Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60℃烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： (1)胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。 (2)胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin(层粘蛋白)，Collagen IV(IV型胶原)等。 (3)皂素(Saponin)：一般使用浓度为2~10 g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)效果。枸橼酸盐缓冲液(粉剂)配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0±0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。 (1)石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3%H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液(工作液)
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RT-PCR荧光定量分析方法-PCR实验代测
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
RT-PCR荧光定量分析方法-PCR实验代测，德尔塔提供PCR代测服务，包括RT-PCR,QPCR等，专业的实验检测人员加上精良的仪器，确保您的每一份实验数据均真实可靠。提供原始数据，分析数据，内参，动力扩增曲线，溶解曲线等你需要的任何资料，欢迎来电咨询！ 荧光定量分析方法 我们在设计实验的时候通常对下列事情更感兴趣：1)测定未知样品的绝对量：如给定的血样中的病毒颗粒数，食品中某一种转基因成分的含量;2)未知样品与已知样品相比，基因的表达量改变了多少倍：如相当量的肿瘤组织和正常组织相比，p53mRNA改变了多少倍。分析这两种假设的方法就分别叫绝对定量和相对定量。 绝对定量是通过样品的Ct值和标准曲线进行比较实现的。分析的结果是给定数量的样品中(给定数量的细胞，每微克总RNA)中核酸的量(拷贝数、微克)。 相对定量的分析结果是在相当量的试验组(样品A)和对照组(样品B)中一个靶基因的相对比率(倍数差异)。 接下来我们就来看看我们在实验过程中如何来使用绝对定量和相对定量的分析方法。 5.1绝对定量分析方法 5.1.1绝对定量分析方法的使用条件 在这里我将举例来说明我们在实验过程中，何种实验需要用绝对定量来进行分析。医生对一个乙肝病人的每毫升血液中HBV DNA的精确拷贝数感兴趣。首先医生要从病人血液中提取DNA，然后通过荧光定量PCR实验来确定HBV病毒DNA的copy数。通过病人样品的Ct值和设置梯度稀释的已知HBV对照样品的标准曲线进行比较，医生就能确定病人血液中HBV病毒DNA的copy数。从这个例子，我们也可以看出，在实验过程中，如果*终的结果是对未知样品的定量描述，并不依赖别的样品的性质的时候，就应该使用绝对定量进行分析。 5.1.2绝对定量数据处理(举例)：确定某病人的血液提取的HBV病毒的精确量 如：PCR反应结束后，我们得到如下数据： copies/ml Ct1 Ct2 Ct3 Mean Ct STD 5×103 27.61 27.58 27.84 27.67667 0.13 5×104 24.25 24.42 24.55 24.40667 0.08 5×105 21.11 21.04
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德尔塔告诉大家：Elisa实验的标准操作方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
德尔塔告诉大家：Elisa实验的标准操作方法 elisa实验方法操作标准，用于ELISA测定的临床标本*为常用的是血清(浆)，有时因为特定的检测目的，也用到唾液、脑脊液、尿液、粪便等标本。目前临床上使用血清标本测定的标志物一般有传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物、激素、特种蛋白、细胞因子和**药物等。对用于激素和**药物测定的血清标本的收集，要注意收集时间甚或体位有可能会对测定结果产生影响。如可的松在早晨4～6点之间，会有一峰值出现：生长激素、促黄体激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以阵发性方式释放，因此，在测定此类激素时，有必要在密切相连的时间间隔内采取数份血样本，以其中间值为测定值。又如当从卧位变为站立位时，血清中肾素活性将出现明显增高。再如**药物的检测，应根据药代动力学选择服药后的*适时间抽血检测。用于传染性病原体的抗原和抗体、肿瘤标志物和特种蛋白等的检测的血清标本的收集则没有时间和体位方面的影响，只是在处理和保存方面要考虑以下几个方面： (1)要注意避免出现严重溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因此，在以HRP为标记酶的ELISA测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很容易在温育过程中吸附于固相，从而与后面加入的HRP底物反应显色。 (2)样本的采集及血清分离中要注意尽量避免细菌污染，一则细菌的生长，其所分泌的一些酶可能会对抗原抗体等蛋白产生分解作用;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作标记的测定方法产生非特异性干扰。 (3)血清标本如是以无菌操作分离，则可以在2～8℃下保存一周，如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长时间保存，应在-70℃以下。 (4)冰冻保存的血清标本须注意避免因停电等造成的反复冻融。标本的反复冻融所产生的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子产生破坏作用，从而引起假阴性结果。此外，冻融标本的混匀亦应注意，不要进行剧烈振荡，反复颠倒混匀即可。 (5)标本
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德尔塔分享：详细版western-blotting实验方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
德尔塔分享：详细版western-blotting实验方案，本司代做WB实验，欢迎来电咨询！ 一、配胶 注意一定要将玻璃板洗净，*后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面乡下倾斜置于干净的纸巾晾干。 分离胶及浓缩胶均可事先配好(除AP及TEMED外)，过滤后作为储存液避光存放于4度，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡(否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟)，加入10%AP(0.7~0.8：100,分离 胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5：100)及TEMED(分离胶用0.4：1000，15%的可用到0.3：1000，浓缩胶用0.8：1000)即可，如室温较低可升高10%AP及TEMED浓度到《分子克隆》建议浓度。 封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。封胶后切记，勿动。 待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。片刻后倒掉SDS，将玻璃板倒立放置片刻控净。 4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时宜边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形。拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。若上样孔有变形，可用适当粗细的针头拨正;若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出。30min后即可上样，长时间有利于胶结构的形成，因为肉眼观的胶凝时其内部分子的排列尚未完成。 (10%的AP现配现用，如在4℃存放勿超过两周。30%的丙烯酰胺如有沉淀，弃掉.) 二.样品处理 1.培养的细胞(定性)： ⑴ 去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍(冷的PBS有可能使细胞脱落)。 ⑵ 对于6孔板来说每孔加200~300μl，60~80℃的1×loading buffer。 ⑶ 100℃，1min。 ⑷ 用细胞刮刮下细胞后在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。 ⑸ 用干净的针尖挑丝，如有团块则将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，则可以将EP管置于0℃后在14000~
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德尔塔为大家简介：小鼠组织切片免疫组化操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
德尔塔为大家简介：小鼠组织切片免疫组化操作步骤 材料：二甲苯，酒精（100％，95％），EDTA抗原修复工作液（pH8.0，稀释50倍使用），0.5M Tris-NaCl (TBS) pH7.4（稀释10倍使用）, DAB显色液（临用前配制：试剂盒A、B、C各50ul，于1ml水中混匀）。 方法： 1. 石蜡切片置60℃烘箱中烘烤过夜 2. 二甲苯中脱蜡，梯度酒精入水(无水乙醇，95％酒精)，浸泡于蒸馏水中待用 3. 抗原修复 取500mlEDTA抗原修复工作液于1000ml烧杯中，在小功率电炉上加热，至似沸微沸（为了防止脱片）。将组织切片缓慢放入烧杯。继续加热，保持液体在微沸状态20分钟。将烧杯移开火源，室温下自然冷却后取出切片，蒸馏水洗1次3分钟，TBS洗2次每次3分钟。 4. 每张切片加一滴或50ul 3％过氧化氢溶液，室温下孵育10min， 以阻断内源性过氧化物酶的活性。 TBS冲洗3次，每次3min。 5. 除去TBS液，加一滴或50ul 一抗（灭活PLB免疫小鼠所得到的多抗，1:3000稀释），阴性对照采用普通血清， 室温下孵育2小时，或4℃过夜。 6. TBS洗3次，每次5min，除去TBS液，每张切片加一滴或50ul polymer enhancer（试剂A）， 室温下孵育20min， TBS冲洗3次， 每次3min。 7. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 过氧化物酶标记的抗鼠/兔聚合物（试剂B），室温下孵育30min，TBS洗3次，每次3min。 8. 除去TBS液，每张切片加一滴或50ul 新鲜配制的DAB，显色3－10min。 9. 自来水冲洗，苏木素复染10min，水冲洗。0.1%的盐酸分化，自来水冲洗，TBS返蓝。 10. 不需脱水，直接用中性树脂封片。 注意事项1.抗原修复时必须保证切片始终能浸泡在液体内，一定要等工作液冷却后才能将切片取出 elisa试剂盒,elisa kit,西安elisa实验代测,SOD试剂盒,IgG试剂盒,IgM试剂盒,WB实验代做,免疫组化实验代做,放免实验代测,GIBCO,AMRESCO-德尔塔 原创作者：德尔塔
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德尔塔报道：复旦大学抗肿瘤药物专利“天价”卖给美国公司
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
3月15日，复旦大学与美国HUYA（沪亚）公司在西安达成协议，复旦大学生命科学学院教授杨青将具有自主知识产权的用于肿瘤免疫**的IDO抑制剂有偿许可给美国HUYA公司。此次许可转让将至多为复旦大学和杨青教授带来6500万美元的收益。 据了解，IDO抑制剂作为具有新药靶、新机制的药物，可应用于**肿瘤、阿尔茨海默病、抑郁症、白内障等多种重大疾病，社会、经济效益前景广阔。 目前，国外医药行业对于IDO 抑制剂药物的市场前景颇为看好，多家国外知名药企均宣布要加入IDO抑制剂的研发竞争。但现有的 IDO 抑制剂普遍抑制效力低下，尚无IDO抑制剂药物问世。截至目前，美国New link Genetics公司与美国Incyte公司研发的相关化合物已经进入了临床试验阶段。而杨青带头研发的新型IDO抑制剂，已经申请了国内和PCT，有望成为第三个进入临床实验研究的IDO抑制剂。 据悉，协议签订后，美国HUYA公司将向复旦大学支付一定额度的首付款。若该IDO抑制剂在在国外临床试验结果取得优效；在欧盟、美国、日本成功上市；以及年销售额达到不同的目标后，美国HUYA公司向复旦大学支付累计不超过6500万美金的各项里程碑付款。 “可以说，6500万美金是一个比较可观的价格。” 中国医药工业研究总院副院长易八贤向澎湃新闻记者表示，此次复旦大学与HUYA的合作给国内高校及科研机构树立了很好的范本。 易八贤表示，相比国外更为成熟的产学研结合模式，目前国内高校和研究机构向国外输送研究存在模式瓶颈，*显著的就是创新药物在课题研究阶段的估值问题得不到解决。 “因为现在国内并没有从事此类估值的专业机构，科研机构内也没有足够的资金建立这样的专业部门。换句话说也就是我们的研究机构市场化程度太低，这使得国内的研究在国外的市场上常常不被认可或者估值偏低。”易八贤说。 “在过去，欧美国家在创新药研究领域一直国内，国内向国外输出的案例并不多。”北京鼎臣医药管理咨询中心创始人史立臣告诉记者。他表示，创新药物研发是一个投入大、风
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德尔塔分享：酶联接免疫吸附剂测定[ELISA]的操作要点
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
德尔塔分享：酶联接免疫吸附剂测定[ELISA]的操作要点优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证elisa检测结果准确可靠的必要条件。ELISA的操作因固相载体的形成不同而有所差异，国内医学检验一般均用板式点。本文将叙述板式ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。 1.1 标本的采取和保存 可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、粪便）等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液），有些则需经预处理（如粪便和某些分泌物）。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、血块收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。 血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂（见3.2.4）。 1.2 试剂的准备 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水
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德尔塔：慢病毒RNAi干扰
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
（1）原理 慢病毒是逆转录病毒的一种，具有逆转录病毒的基本结构，但也有不同于逆转录病毒的组份和特性，作为基因**（gene therapy）载体发展起来，*近已用于转基因动物（Transgenic animals）制备。利用慢病毒构建的shRNA/miRNA载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的shRNA相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，lentivirus－shRNA/miRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 （2）服务流程 1）含目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和纯化提取； 2）慢病毒干扰载体、pGag/Pol、pRev、pVSV-G四质粒共转染293T细胞； 3）培养48~72h，收集培养上清； 4）病毒的纯化和浓缩（超离和/或超滤）； 5）滴度测定、目的基因检定 6）将制得的慢病毒液转导客户的靶细胞，筛选混合稳定细胞株，并检测靶基因的表达。 客户提供 1）表达miRNA/shRNA的质粒（提供测序图谱）或所要Knockdown的靶基因的名称、序列； 2）所需要的病毒滴度及总量，病毒是否需要纯化 3）若需要检测靶基因的表达变化，如需要请提供相应的抗体 我们提供 1）提供重组后的慢病毒载体质粒 2）提供已测定好滴度、可以直接进行后续分析的慢病毒储存液 www.shxfbio.com elisa试剂盒,elisa kit,西安elisa实验代测,SOD试剂盒,IgG试剂盒,IgM试剂盒,WB实验代做,免疫组化实验代做,放免实验代测,GIBCO,AMRESCO-德尔塔 原创作者：德尔塔
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德尔塔：GM试验在长期中性粒细胞减少患者中的检测
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
随着对侵袭性曲霉菌病研究的深入，越来越多的医生，学者，专家关注侵袭性曲霉菌病的临床诊断，关注诊断方法及临床价值的实用性。目前市场上涌现了众多的曲霉菌检测方法，仅G试验的品牌就有4、5家，然而G试验是用来检测真菌细胞壁的1-3-β-D葡聚糖成份，是大多数真菌的细胞壁成份，针对曲霉菌缺乏特异性。曲霉菌的特异性成份是其细胞壁的多糖成份半乳甘露聚糖，其检测简称为GM试验。GM试验在欧美国家早已普遍开展，随着国内外医学者们不断地交流，国内也逐渐关注GM试验以及它为临床带来的价值。国外学者O.Penack,P.Rempf等进行了一份前瞻性研究，1该研究是在200例恶性血液肿瘤患者和严重的中性粒细胞减少患者的血清和肺泡灌洗液中使用酶联免疫方法检测半乳甘露聚糖诊断侵袭性曲霉病。研究中对胸部X射线或CT扫描发现有浸润的患者进行肺泡灌洗液和血清的GEI(Galactomannan enzyme Immuno Assay)对比检测，发现肺泡灌洗液GEI的诊断准确性较血清GEI高。同样地，研究中作者选用了美国Bio-Rad的PlateliaTM曲霉菌抗原检测试剂盒。通过该研究同时也验证了PlateliaTM试剂盒的性能，即准确性和特异性高，尤其肺泡灌洗液的特异性优于血清检测的特异性。PlateliaTM半乳甘露聚糖抗原的检测被全球权威机构EORTC/MSG推荐使用，说明GM试验在指南中的有着不可替代的价值。美国Bio-Rad公司研发的PlateliaTM曲霉菌抗原检测试剂盒采用酶联免疫双抗体夹心分析法检测血清中半乳甘露聚糖抗原。经典的elisa检测流程，卓越的品质和产品性能，高度的敏感性和特异性分别达到了92.1% 和97.5%，检出限为 0.4ng/ml，可在临床症状出现前6天和诊断前10 天即可检出GM抗原，真正实现侵袭性曲霉菌病的早期诊断。临床对高危患者进行2次/周GM的筛查，能实时监测患者的病情和药效，为医生提供诊断依据，以适时地启动恰当的**方案，是侵袭性曲霉病早期诊断的一款独特的工具。www.shxfbio.com elisa试剂盒,elisa kit,西安elisa实验代测,SOD试剂盒,IgG试剂盒,IgM试剂
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德尔塔：小液流法测定植物组织水势
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
植物组织与外液接触时发生水分交换时，若植物组织的水势等于外液的渗透势，则 ψ植物=ψS。 一、 原理 将植物组织分别放在一系列浓度递增的溶液中，当找到某一浓度的溶液与植物组织之间水分保持动态平衡时，则可认为此植物组织的水势等于该溶液的水势。因溶液的浓度是已知的，可以根据公式算出其渗透压，取其负值，为溶液的渗透势(ψπ)，即代表植物的水势(ψw)(waterpotential)。 ψw=ψπ=-P=-CRT(大气压) 二、材料、仪器设备及试剂 (一)材料：小白菜、菠菜、油菜或其它作物叶片 (二)仪器设备：1.带塞青霉素小瓶12个;2.带有橡皮管的注射针头;3.镊子;4.打孔器5.培养皿。 (三)试剂：1.0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30mol/L蔗糖溶液;2.甲烯蓝粉末。 三、实验步骤 (一)取干燥洁净的青霉素瓶6个为甲组，各瓶中分别加入0.05～0.30mol/L蔗糖溶液约4ml(约为青霉素瓶的2/3处)，另取6个干燥洁净的青霉素瓶为乙组，各瓶中分别加入0.05～0.30mol/L蔗糖溶液1ml和微量甲烯蓝粉末着色，上述各瓶加标签注明浓度。 (二)取待测样品的功能叶数片，用打孔器打取小圆片约50片，放至培养皿中，混合均匀。用镊子分别夹入5～8个小圆片到盛有不同浓度的甲烯蓝蔗糖溶液的青霉素瓶中(乙组)。盖上瓶塞，并使叶圆片全部浸没于溶液中。放置约30～60min，为加速水分平衡，应经常摇动小瓶。 (三)经一定时间后，用注射针头吸取乙组各瓶蓝色糖液少许，将针头插入对应浓度甲组青霉素瓶溶液中部，小心地放出少量液流，观察蓝色液流的升降动向。(每次测定均要用待测浓度的甲烯蓝蔗糖溶液清洗几次注射针头)。如此方法检查各瓶中液流的升降动向。若液流上升，说明浸过小圆片的蔗糖溶液浓度变小(即植物组织失水);表明叶片组织的水势高于该浓度糖溶液的渗透势;如果蓝色液流下降则说明叶片组织的水势低于该糖溶液的渗透势，若蓝色液流静止不动，则说明叶片组织的水势等于该糖溶液的渗透势，此糖溶液的浓度即为叶片组织的等渗浓度 四、结果计算 将求得的等
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德尔塔：核酸分子杂交的基本概念和实验原理
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
主要内容： 一、分子杂交的概念 二、分子杂交基本原理 (一)DNA变性： 1、DNA变性的方法 2、增色效应 3、溶解曲线 4、融解温度 5、影响Tm值的因素。 (二)复性：退火 一、分子杂交的概念： 分子杂交(molecular hybridization)指具有一定同源序列的两条核酸单链(DNA或RNA)，在一定条件下按碱基互补配对原则经过退火处理，形成异质双链的过程。 利用这一原理，就可以使用已知序列的单链核酸片段作为探针，去查找各种不同来源的基因组DNA分子中的同源基因或同源序列。 二、分子杂交基本原理： (一)DNA变性 ： DNA变性是指双螺旋之间氢键断裂，双螺旋解开，形成单链无规则线团，因而发生性质改变(如粘度下降，沉降速度增加，浮力上升，紫外吸收增加等) 。 1、DNA变性的方法： 1)加热; 2)改变DNA溶液的pH; 3)有机溶剂(如乙醇、尿素、甲酰胺及丙酰胺等)等理化因素。 2、增色效应：DNA在260nm处有吸收值，这一特征是由于含有碱基的缘故。在DNA双螺旋结构模型中碱基藏于内侧，变性时由于双螺旋解开，于是碱基外露，260nm紫外吸收值因而增加，这一现象称为增色效应(hyperchromic effect) 。利用DNA变性后波长260nm处紫外吸收的变化可追踪变性过程。 3、溶解曲线：如果升高温度使DNA变性，以温度对紫外吸收作图，可得到一条曲线，称为溶解曲线。 4、融解温度：通常人们把50%DNA分子发生变性的温度称为变性温度(即熔解曲线中点对应的温度)，由于这一现象和结晶的融解相类似，故又称融点或融解温度(melting temperature， Tm)。因此Tm是指消光值上升到消光值一半时的温度。 5、影响Tm值的因素：Tm不是一个固定的数值，它与很多因素有关： 1) 部因素：pH、离子强度。随着溶剂内离子强度上升，Tm值也随着增大。 2) 部因素：DNA的碱基比例、DNA的均一性 ;在相同条件下，DNA内G-C配对含量高，其Tm值也高。 6、DNA中的GC含量与Tm值关系： Tm = 69。3+0。41 × % (G+C) 对于小于20bp的寡核苷酸，Tm=4(G+C)+2(A+T)
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德尔塔：哺乳动物DNA:Southern印迹杂交技术实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
实验原理 核酸分子杂交技术是分子生物学领域中*常用的具体方法。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。但为了进一步构建出DNA分子的遗传图，或进行目的基因序列的测定以满足基因克隆的特殊要求，还必须掌握DNA分子中基因编码区的大小和位置。有关这类数据资料可应用Southern印迹杂交技术获得。 Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物(硝酸纤维素膜或尼龙膜)上，即印迹(blotting);二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。 早期的Southern印迹是将凝胶中的DNA变性后，经毛细管的虹吸作用，转移到硝酸纤维膜上。近年来印迹方法和固定支持滤膜都有了很大的改进，印迹方法如电转法、真空转移法;滤膜则发展了尼龙膜、化学活化膜(如APT、ABM纤维素膜)等。利用Southern印迹法可进行克隆基因的酶切、图谱分析、基因组中某一基因的定性及定量分析、基因突变分析及限制性片断长度多态性分析(RFLP)等。 实验方法 本节以哺乳动物基因组DNA为例，介绍Southern印迹杂交的基本步骤。 一、 待测核酸样品的制备 (一) 制备待测DNA 基因组DNA是从动物组织(或)细胞制备。1. 采用适当的化学试剂裂解细胞，或者用组织匀浆器研磨破碎组织中的细胞;2. 用蛋白酶和RNA酶消化大部分蛋白质和RNA;3. 用有机试剂(酚/氯仿)抽提方法去除蛋白质。 (二) DNA限制酶消化 基因组DNA很长，需要将其切割成大小不同的片段之后才能用于杂交分析，通常用限制酶消化DNA。一般选择一种限制酶来切割DNA分子，但有时为了某些特殊的目的，分别用不同的限制酶
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德尔塔：MAPK信号通路大图
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
MAPK,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类MAPK,丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。研究证实，MAPKs信号转导通路存在于大多数细胞内，在将细胞外刺激信号转导至细胞及其核内，并引起细胞生物学反应（如细胞增殖、分化、转化及凋亡等）的过程中具有至关重要的作用。研究表明，MAPKs信号转导通路在细胞内具有生物进化的高度保守性，在低等原核细胞和高等哺乳类细胞内，目前均已发现存在着多条并行的MAPKs信号通路，不同的细胞外刺激可使用不同的MAPKs信号通路，通过其相互调控而介导不同的细胞生物学反应。 www.shxfbio.com elisa试剂盒,elisa kit,西安elisa实验代测,SOD试剂盒,IgG试剂盒,IgM试剂盒,WB实验代做,免疫组化实验代做,放免实验代测,GIBCO,AMRESCO-德尔塔 原创作者：德尔塔
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德尔塔：IPTG诱导蛋白表达的原理及方法步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
E.coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶，此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白，后者与O序列结合，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解（代谢）物基因激活蛋白（CAP）结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动。当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导。在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞，经b－半乳糖苷酶催化，转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。 材料 1、诱导表达材料 （ 1 ） LB （Luria―Bertani））培养基 酵母膏 （Yeast extract） 5g 蛋白胨 （Peptone） 10g NaCl 10g 琼脂 （Agar） 1-2% 蒸馏水 （Distilled water） 1000ml pH 7.0 适用范围：大肠杆菌（Escherichia coli） （ 2 ） IPTG 贮备液：2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中，0 . 22 μm 滤膜过滤除菌，分装成1 mL /份，－20 ℃ 保存。 （ 3 ） l× 凝胶电泳加样缓冲液： 50 mmol / L Tris -CI （ pH 6 . 8 ） 50 mmol / L DTT 2 % SDS （电泳级） 0.1 ％ 溴酚蓝 10 ％ 甘油 2、大肠杆菌（Escherichia coli）包涵体的分离与蛋白纯化材料 1 ）酶溶法 （1）裂解缓冲液： 50 mmol / L Tris-CI （ pH 8 . 0 ） 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI （2）50 mmol / L 苯（PMSF ）。 （3）10 mg / mL 溶菌酶。 （4）脱氧胆酸。 （5）1 mg / mL DNase I。 www.
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南京德尔塔：聚合酶链式反应(PCR)技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
原理 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction PCR)是一种体外扩增特异性DN段的技术。它可以在体外特异地对目的基因进行大量扩增，其巧妙之处在预先设计合成二段分别与待测目的基因二端互补的引物，以起到指向定点的作用；再借助于DNA聚合酶催化的若干次扩增反应后，即可使特定的基因片段成百万倍的扩增。扩增反应分三步： ①变性：当通过加热使DNA双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA。 ②褪火：当温度突然降低时由于模板分子结构较引物要复杂得多，而且反应体系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互补的模板在局部形成杂交链，而模板DNA双链之间互补的机会较少。 ③延伸：在DNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物，以及Mg2+存在的条件下， 以引物为起始点，从5′→3′催化的DNA链延伸反应。 以上3步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一循环的模板，若干次循环之后，介于两个引物之间的特异性DN段就得到了大量的复制，数量可达2×107～8拷贝，PCR的实验操作包括模板DNA(或RNA)的制备、引物的设计合成、酶促聚合反应、反应产物的检测等。 操作步骤 (一)模板DNA(靶序列)的制备 进行PCR扩增反应的模板可以是人体组织细胞的染色体DNA，微生物的DNA，或是由mRNA反转录而成的cDNA等。本实验用小鼠肝脏制备染色体DNA作为PCR扩增的模板。 1. 取肝组织0.5g加入2ml裂解液。 2. 冰浴匀浆。 3. 取匀浆液200μl加入裂解液200μl。 4. 加入蛋白酶k至终末浓度为100μg/ml。 5. 以上溶液在65℃保温数小时或过夜，不时震摇。 6. 加入75μl 8M KAC，混匀。 7. 在4℃放置15分钟。 8. 加入750μl氯仿。 9. 经充分震摇后5 000rpm、离心5分钟，将上清液转入一新的Eppenderf管，沉淀弃去。 10. 加入750μl无水乙醇，充分混匀，-20℃静置30分钟。 11. 12 000rpm、离心10分钟，弃去上清，沉淀用500μl 70%乙醇洗一次，10 000rpm、再离心5分钟，弃去上清，于室温将有DNA沉淀的Eppendorf管敞开15～30分钟，使痕量乙醇挥发。 12.
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