-
德尔塔：AAV-293细胞的传代心得
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
AAV-293细胞较喜欢成团生长，比较娇嫩，怕冷，传代时不要一次从二氧化碳培养箱拿出很多瓶，一次只要拿2-3瓶出来传就可以了，否则细胞很容易死掉。细胞在50-60%传代，细胞生长状态。用D-Hank＇s液配制成0。25%的胰酶消化半分钟左右，弃去胰酶。观察培养瓶是否有针孔样缝隙，如有就可以加入培养液吹打细胞。消化过久，对细胞损害很大，而且成团很难吹打成单个细胞。然后加入含有10%小牛血清的DMEM。轻轻放入二氧化碳培养箱中培养。注意哦，拿细胞时一定要动作轻柔哦!www.shxfbio.com elisa试剂盒,elisa kit,西安elisa实验代测,SOD试剂盒,IgG试剂盒,IgM试剂盒,WB实验代做,免疫组化实验代做,放免实验代测,GIBCO,AMRESCO-德尔塔 原创作者：德尔塔
-
德尔塔：中科大合作揭示癌症发展重要通路
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
来自中国科技大学、中山大学肿瘤防治中心、中科院等机构的研究人员证实在营养不足的情况下cMyc介导的丝氨酸生物合成信号通路激活对于癌症进展起至关重要的作用。这一研究发现发布在3月20日的《细胞研究》(Cell Research)杂志上。 众所周知，在不同的压力条件下癌细胞采用了代谢转换策略来获得快速增殖必需的能量供应以及构件。葡萄糖和谷氨酰胺是支持Warburg效应的两个至关重要的能量物质，增殖癌细胞不仅贪婪地利用它们来提供了蛋白质、核酸和脂质生物合成所需的ATP以及碳源和氮源，还提供了还原能力等。 尤其是在缺氧条件下，葡萄糖可通过高水平的糖酵解维持快速的癌细胞分裂，或是为PPP信号通路提供代谢中间产物来合成生物大分子，而谷氨酰胺则促进了多个生物合成信号通路，控制了氧化还原平衡，并通过分解为α-酮戊二酸(α-KG)支持了三羧酸循环和脂肪生成。因此，癌细胞高度依赖于葡萄糖和谷氨酰胺来维持生存及增殖，剥夺它们可导致严重的细胞死亡。然而，葡萄糖和谷氨酰胺的代谢非常的复杂，目前对于它们的调控机制仍未充分地理解。尤其是，还不清楚当剥夺葡萄糖或谷氨酰胺时癌细胞将会发生什么特异的、复杂的代谢反应。 哺乳动物的两个非必需氨基酸：丝氨酸和甘氨酸对于细胞增殖也至关重要，众所周知，它们在中枢神经系统的磷脂合成以及胱硫醚形成中发挥功能。有趣的是，近期有研究报告称这两个氨基酸也在癌症进展中发挥了重要作用。 在许多重要转录因子中，众所周知cMyc上调了10-15%的与细胞周期、发育、凋亡和代谢相关的人类基因。近期，有人提出cMyc放大了所有表达基因的活性。另有一些新的证据揭示cMyc选择性微调了许多细胞生长和癌症进展必需的重要基因。所有这些结果指出了还有必要进一步阐明在发育或致癌情况下cMyc的神秘角色以及潜在机制。cMyc已被广泛地证实调控了葡萄糖、谷氨酰胺和核苷酸代谢，但目前还不清楚cMyc是否也控制了丝氨酸/甘氨酸代谢，尤其是在营养不足的条件下。 由于癌细胞通常要经历涉
-
德尔塔：常用免疫组化染色方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
(一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行) 1.切片经二甲苯Ⅰ 5分钟。 2.切片经二甲苯Ⅱ 5分钟。 3. 无水酒精Ⅰ 30秒。 4. 无水酒精Ⅱ 30秒。 5. 95%酒精Ⅰ 30秒。 6. 95%酒精Ⅱ 30秒。 7. 90%酒精 30秒。 8.80%酒精 30秒。 9. 70%酒精 30秒。 10.自来水洗。(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10) 11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 12.水洗。 13.抗原修复。 14.PBS洗3次，1分钟/次。 15.加入血清孵育20分钟。 16.摔干血清，加入一抗60分钟。 17.PBS洗3次，2分钟/次。 18.加入二抗孵育30分钟。 19.PBS洗3次，2分钟/次。 20.加入ABC复合物，孵育30分钟。 21. PBS洗3次，2分钟/次。 22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。 23.PBS洗，水洗。 24.Harris苏木素染核5-10分钟。 25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。 (二)、LSAB法。(SP法)(Labelled streptavidim biotln) 1.切片脱蜡至水。 2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。 3.水洗。 4.抗原修复。 5.PBS洗3次，1分钟/次。 6.加入血清孵育10分钟。 7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。 8.PBS洗3次，每次2分钟。加入二抗，孵育20分钟。 9.PBS洗3次，每次2分钟。 10.加入SP复合物孵育20-30分钟。 11.PBS洗3次，每次2分钟。 12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 13.PBS洗，水洗。 14.Harris苏木素染核5-10分钟。 15.水洗，分化 ，蓝化，脱水，透明并封固。 (三)真空负压LSAB法 1.切片脱蜡至水。 2. 0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min. 3. 水洗。 4.如果需要，可进行抗原修复。 5.PBS洗3次，每次1分钟。 6.加入正常血清真空负压处理5min。 7.摔干血清，加入抗体，真空负压处理5分钟。 8. PBS洗3次，每次2分钟。 9. 加入二抗(即连接抗体)真空负压处理5分钟。 10.PBS洗3次，每次2分钟。 11.加入链卵蛋白复合物，真空负压处理 5分钟。 12.PBS洗3次，每次2分钟。 13.DAB-H2O2孵育5-10分钟。 14.PBS洗，水洗。 15
-
德尔塔：毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展及应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
摘要巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统作为一个日臻完善的外源蛋白真核表达系统由于它所具有的一些其它表达系统不可比拟的优势而得到越来越广泛的应用。分别从该表达系统的优点、外源基因整合及调控机理、表达蛋白糖基化及翻译后修饰等方面综述了其在外源蛋白表达中的研究进展及应用。 关键词巴斯得毕赤酵母外源基因糖基化 中图分类号Q786 巴斯得毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统是上世纪80年代初期发展起来的一种新型的外源蛋白表达系统［1］，它既具有原核表达系统操作简易、易于培养、生长速度快、表达量高、成本低等优点，还具有原核生物表达系统所不具有的对外源蛋白的翻译后修饰等特点，如糖基化、蛋白磷酸化等。同时它还避免了酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）分泌效率差、表达菌株不够稳定、表达质粒易丢失等缺陷［2］。除此之外，由于它在蛋白质表达方面还具有以下几个其它表达系统所不可比拟的优点而使得该系统成为目前研究*多、应用*广泛的真核表达系统：(1)它所具有的aox启动子是一种强有力的启动子，受甲醇严格诱导调控而表达，所以可严格调控外源蛋白的表达；(2)由于它可以对表达蛋白进行糖基化、蛋白磷酸化、折叠、信号序列加工、脂类酰化等一系列的翻译后修饰，从而使其表达的蛋白具有生物活性；(3)表达量高，迄今为止，已有300多种异源蛋白在该表达系统中获得了高效表达，如破伤风毒素片段C可达12g/L［3］，而明胶的表达量甚至达到了14.8g/L［4］，已有报道其胞内表达量惊人，甚至达到了22g/L；(4)外源基因的表达产物既可存在于胞内，又可通过其特有的信号肽α因子或天然蛋白本身的信号肽分泌至细胞外，同时，该系统自身分泌的蛋白非常少，这大大简化了纯化过程，如表达的重组水蛭素（HIR），仅经过二步层析纯化就可达到97％以上的纯度；(5)整合入外源基因的重组子表达系统十分稳定。有文献报道通过同源重组整合入外源基因的重组子表达系统可连续培养50代却未见外源基因丢失的现象
-
德尔塔：Western Blot原理、试剂配制、操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
western免疫印迹(Western Blot)是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western blot技术: 一、原理 二、 分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECF iv.底物DAB呈色 三、 主要试剂 四、 主要步骤 五、 实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 5.marker的相关疑问6.染色的选择 7.参照的疑问 8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、 原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。 三、主要试剂 1、 丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至 100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个
-
德尔塔：体外培养细胞
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
细胞培养（Cell Culture）专题： http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cellculture.htm 一、所谓细胞培养(Cell culture)是指细胞包括单个细胞在体外条件的生长。 组织培养的发展史已有近百年，*初的组织培养是胚胎学和微生物学的引申，建立于无菌原则上，用天然体液（如胎汁、血浆）来维持从整体切下的组织块，对细胞进行形态和功能的观察。 通过许多学者大的改进和革新，培养基由天然动物血浆改为合成培养基，促进细胞生长物质从胎汁改为动物血清。现在全世界贮存的细胞约有万种以上。组织培养不仅是细胞生物学必需的技术，也是分子生物学、肿瘤学、遗传学和免疫学等学科必要的方法。 二．基本原理和方法 体外培养细胞的生存条件： (一)营养。 体外培养细胞所需的营养物质与体内相同，主要有糖、氨基酸和维生素三大类。目前市面上销售的合成培养基如1640、199等所含的氨基酸已足够，但在使用合成培养基时，仍需加入一些天然成份，如人或动物的血清、血浆和胎汁等。目前主要使用血清，以牛血清为主。血清的生物效应早已证明，它含有多种促细胞生长因子、促贴附因子及其它活性物质等。不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞作用不同。以小牛血清，成年牛和马血清次之。合成培养基中不加血清也能维持细胞生存，但不能很好生长，加入5%的血清，对大多数细胞来说，能维持细胞不死和缓慢生长，要使细胞正常生长，一般需加10～15%的小牛血清。每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每个批号血清使用前要加热处理，一般灭活于56℃水浴中30分钟，每5分钟摇一次。10%血清营养液能促进细胞增殖称为生长液，2～5%血清培养液不能使细胞增殖而只能维持其生存称为维持液。添加血清，虽利于细胞生长，但增加了不明成分，给分析实验结果带来了困难。因此，人们正在探索不用血清的无血清液并已取得了一定进展。 （二）环境 1．无菌：无菌是保证培养细胞生存的首要条件。培养液不仅对细
-
德尔塔：美国科学家揭示新型的细胞信号传导的刹车机制
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
阳光等外部条件触发的细胞信号传导，允许生物适应当前的环境条件。在需要做出应答的时候，机体会激活一系列的化学信号。通常这种信号一开始是很强的，一段时间之后会受到限制，信号减弱甚至完全被关闭。这样的限制机制是非常关键的，但迄今未知人们对它们的了解还很有限，科学家们大多更关注一开始的激活过程。现在，加州大学伯克利分校和卡内基科学研究所的研究人员对拟南芥进行了研究，他们发现这种植物可以通过特定机制减弱外部信号的强度，拟南芥是一种常用的模式生物。这项研究发表在六月六日的science杂志上。研究显示，拟南芥幼苗从黑暗环境转到阳光下时，会引发一个“快速而广泛”的基因表达重置，进而长成我们常见的绿色幼苗。这一过程需要一个限制性的机制，帮助细胞重新稳定以达到新的平衡。研究人员发现，这种机制位于细胞核中，而且与加速机制直接相连。对于拟南芥而言，阳光诱导的信号传导过程包括，一个活化的感光分子(光敏色素)结合到转录因子PIF上。这种结合会摧毁PIF，关闭它的目标基因。然而研究人员发现，光敏色素在使PIF摧毁的同时，也判下了自己的死刑，这一指令被立即执行导致信号强度减弱。“理解植物对光的应答动态，解析其背后的分子机制，有助于我们对作物进行基因工程改造，使其能够更好的适应环境波动，”文章的共同作者，卡内基的王志勇教授说。研究人员用相互确保摧毁MAD(mutually assured destruction)来形容这种同归于尽的信号减弱机制(MAD本是一种相互威慑的冷战策略)。自然界通过这种机制为关键性的功能保驾护航，而它将为人们提供广泛的启示(从农业到癌症研究)。 原创作者：德尔塔
-
德尔塔：千年基因外显子组测序技术手册
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
一、技术简介随着社会生活水平的提高，人类健康问题也越来越多的受到社会各界的关注。传统的遗传疾病研究模式是采用显带分析、核型分析、FISH、遗传标记、PCR-DNA测序等传统试验方法来寻找与疾病相关的DNA变异，这些方法各有各的特点，但都存在工作量大、效率低、分辨率低等一系列的限制。新一代高通量测序技术的出现，为遗传疾病的研究提供了全新的思路。2009年，基因组定向捕获工具的出现使外显子组测序成为可能。2009年9月，篇关于外显子组测序的原理验证文章于Nature杂志上发表。来自华盛顿大学的Jay Shendure通过对四名Freeman-Sheldon综合征患者的外显子组测序，找到了已知的致病基因MYH3。随后，该团队将这种技术应用于米勒综合征的研究，通过对患者编码区序列的捕获及深度测序，鉴定出单个候选基因DHODH，并经Sanger测序验证其他患者中存在该基因的突变。外显子组的序列仅占全基因组序列的1%左右，但大多数与疾病相关的变异位于外显子区。通过外显子组测序可鉴定约8万个变异，全基因组测序可鉴定300万个变异，因此，与全基因组测序相比，外显子组测序不仅费用较低，数据阐释也更为简单。外显子组测序技术以其经济、有效的优势广泛应用于孟德尔遗传病、罕见综合征及复杂疾病的研究，并于2010年被Science杂志评为十大突破。近两年外显子组研究相关的SCI文章已发表千余篇，已对数百种疾病展开了深入研究，研究结果推动了人类医学的研究。二、技术优势• 直接对蛋白编码序列进行序列测定，找出影响蛋白结构的变异。• 高深度测序，可发现常见变异及频率低于1%的罕见变异。• 针对外显子组区域测序，约占基因组的1%，有效降低费用、周期、工作量。elisa试剂盒,elisa kit,西安elisa实验代测,SOD试剂盒,IgG试剂盒,IgM试剂盒,WB实验代做,免疫组化实验代做,放免实验代测,GIBCO,AMRESCO-德尔塔 原创作者：德尔塔
-
德尔塔：酶联免疫吸附检测法
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
一、原理 植物激素（planthormone）免疫定量主要有放射免疫分析（RIA）和酶联吸附免疫分析（ELISA），由于前者操作上欠安全等原因，目前常采用后一种类型。在ELISA中，抗原抗体反应的检测依靠酶标记物来实现，常用的酶有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酯酶。酶可直接标记激素分子，称为酶标植物激素，也可标记于第二抗体（识别抗激素抗体Fc片段的抗体或金黄色葡萄球菌A蛋白），称为酶标二抗。这两类标记物分别用于固相抗体型和固相抗原型ELISA。A.固相抗体型ELISA：将抗激素的单克隆抗体（Mab）与已吸附于固相载体上的兔抗鼠Ig抗体（RAMIG）结合，然后加入激素标准品或待测样品，使其与固相化的Mab结合， 再加入辣根过氧化物酶（HRP）标记激素（酶标激素）。通过测定酶标激素的被结合量，可换算出未知样品中激素的数量。B.固相抗原型ELISA：将“激素-蛋白”复合物（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）包被于固相载体，加入待测激素（样品或标准品）和抗IAA多克隆抗体（Pab）反应，进行竞争反应。然后让HRP标记羊抗兔Ig抗体（HRP-GARIG）与结合在固相上的Pab反应，通过测定与固相结合的酶量，换算出未知样品中激素的含量。 二、材料、仪器设备及试剂 （一）材料：高等植物、真菌、藻类等组织或器官。 （二）仪器设备：1. 酶联免疫检测仪；2. 高速冷冻离心机；3. 恒温箱；4. 连续进样器；5. 涡旋仪；6. 96孔微孔板；7. 离心管；8. 研钵或匀浆器；9. 试管。 （三）试剂1. 洗涤缓冲液：0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液（PBS），含0.05％Tween-0；2. RAMIG溶液，或“激素-蛋白”复合物；3. 0.1％封闭蛋白（该蛋白应不同于免疫原中的载体蛋白）；4. 抗激素Mab，或Pab；5. 激素标准品母液，及参比系列溶液（按双倍或四倍系列稀释）；6. HRP标记激素，或HRP-GARIG；7. 邻苯二胺（OPD）基质液：5mgOPD溶于12.5ml0.01mol/L pH5.0PBS，用前加入30％H2O212.5μl。 三、实验步骤 固相抗体型elisa。 1. 用方阵法滴定选择各反应物*适工作浓度
-
德尔塔：电泳原理及电泳设备要求
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
电泳原理 阳极电泳用水溶性树脂是一种高酸值的羧酸盐，在水中溶解后以分子和离子平衡状态存在于直流电场中，通电后，由于两极的电位差，离子定向移动，阴离子沉积在阳极表面，而阳离子在阴极表面获得电子还原成胺，它是一个电化学反应，包括电泳、电解、电沉积和电渗四个同时进行的过程。 1.电泳：在直流电压作用下，分散在介质中的带电胶体粒子在电场作用下向与其所带电荷相反的电极方面移动，叫电泳。 2.电沉积：阴离子树脂放出电子沉积在阳极表面，形成不溶水的漆膜，此过程叫电沉积。 3.电渗：电泳逆过程，当阴离子树脂在阳极上，吸附在阳极上的介质在内渗力的作用下，从阳极穿过沉积的漆膜进入漆液，称电渗。 4.电解：电流通过漆液时水便发生电解阴极放出氢气，阳极放出氧气，此过程即为电解。 电泳涂料 有人说，电泳涂料可划分为三代，代为环氧树脂涂料，第二代为丙烯酸树脂涂料，第三代为聚氨酯涂料。由于环氧涂料主要应用于汽车底盘，第三代主要用于阴极电泳漆，涂覆于首饰表面，故目前主要介绍第二代，即丙烯酸树脂涂料。此树脂如一团乱麻，羧基藏于里，胺基接于外，其中*先的羧基有 70%被胺基取代，因其树脂中存在 -COONHR，使树脂成为水溶性。铝型材表面涂覆的丙烯酸树脂多采用胺基树脂为固化剂进行交联固化，同时，涂料分子均匀性对工艺操作有很大影响，一般说，乳化越好，分子越均匀。 涂装工艺流程 1 除油：如有酸回收装置，推荐采用碱性除油，因碱性除油后，铝型材表面比较光亮，且不会与后面的碱蚀发生副作用，如用碱性除油，其主要成份是Na 2 CO 3 和NaOH。 2 水洗：自来水洗去前道工序的酸或碱。 3 蚀：加入碱蚀剂的碱蚀工序，会降低型材表面光亮度，但效果并不十分明显主要应注意不可使槽中Al 3 含量过大，温度过高，否则易产生洗不去的花斑，涂漆烘干后呈黄色。 二道水洗：有喷淋或加大溢流，以保证清洗彻底。 除灰：用 HNO 3 效果较好，但要注意加强水洗（*少二道+喷淋）。 水洗：自
-
德尔塔：人VI 型胶原蛋白α1 链的克隆——我的RT-PCR实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
首先引物设计 引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应（即错配）。 具体实现这3 条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度（primer length），产物长度 （product length），序列Tm 值 （melting temperature），引物与模板形成双链的内部稳定性（internal stability, 用ΔG 值反映），形成引物二聚体（primer dimer）及发夹结构（duplex formation ａnd hairpin）的能值，在错配位点（ false priming site ） 的引发效率， 引物及产物的GC 含量（composition），等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料[24]，引物设计应注意如下要点： （1）引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。 （2）引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加。 （3）引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 （4）引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC 含量不能相差太大。 （5）引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件*佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4（G+C）＋2（A+T），在Oligo 软件中使用的是*邻近法（the nearest neighbor method） 。 （6）ΔG 值是指DNA 双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当
-
德尔塔：动物细胞大规模培养工艺进展与相关专利介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
动物细胞大规模培养已成为生物制药领域*重要的关键技术，并以其研究的深入和进展推动生物技术产业的迅速发展。专家预言：蛋白**药物如糖蛋白、抗体和多肽药物仅仅只是刚刚开始进入市场，预计在下一个10年或20年会有更为快速的发展。届时，蛋白**药物的迅速增长和市场需求将远远超过全世界的生产能力。 动物细胞规模化生产重组蛋白和抗体的工艺选择可考虑使用当前较成熟的工业化支持技术平台，以缩短产品工艺研发的时间，加快工业化进程。当前已获FDA批准的生物技术产品以及公开发表的生产工艺中，占有主流优势的是搅拌式生物反应器悬浮培养，工艺设计是流加或灌注培养。其大规模细胞培养生产所面临的挑战是获得生产力的同时注重维持产品的质量；去除所有培养环境中外源因子的污染；更为精确有效的工艺控制手段；规模化培养中氧气的限定与溶解CO2浓度累积的控制等。 1996年1月至2002年12月美国获得成功批准的不同的**剂和诊断剂产品共31种，其中用哺乳动物细胞培养生产的就有21种。动物细胞培养技术已经成为一个受到普遍信任的产业化生产技术，并逐步形成商业化操作水平。现将1996~2000批准的18种产品分为重组**药物、疫苗、组织培养产品和诊断试剂连同它们的生产形式列于下表： 表 BLA哺乳动物细胞培养系统来源产品 （1996~2000）BLA产品名厂商批准日期产品形式细胞系方法培养液重组蛋白Tenecteplase/TNKase 急性心肌梗死Genentech6/2/00重组糖蛋白CHO无报道无报道抗血友病因子genetics Institute3/6/00重组糖蛋白CHO连续灌注无血清Trastuzumab/Herceptin 转移性乳腺癌Genentech9/25/98嵌合抗体CHO搅拌生物反应器,悬浮无血清Infliximab/RemicadeCrohn’s diseaseCentocor8/24/98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮灌注培养无血清Palivizumab/Synagis预防呼吸道病毒MedImmune6/19/98嵌合抗体NS0搅拌,悬浮灌注培养无血清Basiliximab/Simulect预防急性器官排斥NovartisPharmaceuticals5/12/98嵌合抗体鼠骨髓瘤搅拌,悬浮灌注培养无血清Dacli
-
德尔塔：免疫组化的方法和优点
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
一、免疫组化技术的基本原理 应用免疫学及组织化学原理，对组织切片或细胞标本中的某些化学成分进行原位的定性、定位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免疫细胞化学技术。 众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。免疫组化正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某些化学物质提取出来，以其作为抗原或半抗原去免疫小鼠等实验动物，制备特异性抗体，再用这种抗体(抗体)作为抗原去免疫动物制备第二抗体，并用某种酶(常用辣根过氧化物酶)或生物素等处理后再与前述抗原成分结合，将抗原放大，由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来(常用显色剂DAB显示为棕黄色颗粒)。通过抗原抗体反应及呈色反应，显示细胞或组织中的化学成分，在显微镜下可清晰看见细胞内发生的抗原抗体反应产物，从而能够在细胞或组织原位确定某些化学成分的分布、含量。组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。 二、免疫组织化学染色方法 1、按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶(主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶)、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。 2、按染色步骤可分为直接法(又称一步法)和间接法(二步、三步或多步法);与直接法相比，间接法的灵敏度提高了许多。 3、按结合方式可分为抗原—抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶(PAP)法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物(ABC)法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(SP)法等，其中SP法是*常用的方法。 三、几种常用免疫组织化学方法的原理 1、免疫荧光方法 是*早建立的免疫组织化学技术。它利用抗原抗体特异性结合的原理，先将已知抗体标上荧光素，以此作为探针检查细胞或组织内的相应抗原，在荧光显微镜下观察。当抗原抗体复
-
德尔塔：ConA刺激小鼠胸腺细胞检测IL
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
(一) 原理 小鼠胸腺细胞在丝裂原刺激下表达IL-1受体，在有IL-1同时存在的条件下，IL-1可协同丝裂原促t细胞的增殖作用。根据加入IL-1后增殖水平(３H-TdR掺入率)的增加可计算出样品中IL-1的活性单位，或计算出刺激指数。 (二) 操作步骤 取6～8周龄C57BL16小鼠，拉颈处死，无菌取胸腺 置不锈钢网筛上，用注射器针蕊研磨成细胞悬液 调整细胞数为1.5×10７／ml ↓ 细胞悬液内加入ConA，使终浓度为3μg／ml，在96孔 培养板中加100μl(1.5×10６细胞) ↓ 加入不同稀释度待测样品和IL-1标准品 100μl／孔(ConA终浓度为1.5μg／ml) ↓ 37℃ CO２孵箱 66h 每孔加３H-TdR 0.5μci ↓37℃ CO孵箱 6h 多头细胞收集仪收获于9999型玻璃纤维纸上 ↓ 烤干，移入液闪瓶中，加适量闪烁液，于液闪仪上测β计数 计算: 1. 从IL-1标准曲线上测得IL-1的活性单位 2. 也可用刺激指数(SI)表示 实验组cpm SI＝────── ×100％ 对照组cpm (三) 试剂和器材 1. 10％ FCS RPMI1640，96孔培养板，CO孵箱 2. 标准IL-1， ConA 3. ３H-TdR，PPO、POPOP，二甲苯 4. 9999型玻璃纤维滤纸，细胞收集仪 5. β液闪计数仪 (四) 注意事项 1. 不同品系小鼠对IL-1的反应性有差异，据国内资料报道以C57BL为好。 2. 不同周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应性不一，一般选用6～8周龄，小于5周或大于10周龄小鼠胸腺细胞对ConA反应不稳定。
-
德尔塔：科学家新研发一种靶向性蛋白质检测法并且证实其可行性
作者：德尔塔 日期：2022-04-11
一个研究团队新研发一种可以检测大量蛋白质的方法，并且证实了其可行性。这种靶向性蛋白质检测方法具有具有系统地、可靠地检测人类蛋白质组的潜力。这项研究是由美国弗雷德哈钦森癌症研究中心蛋白质组学专家Amanda Paulovich博士所带领的。相关文章发表于2013年12月08日的《Nature Methods》杂志上。 Nature子刊：科学家新研发一种靶向性蛋白质检测法并且证实其可行性 新方法证实 采用自身开发的这项技术，Paulovich和同事们可同时及准确地检测许多不同样本中成百上千种蛋白质的丰度。来自西雅图、波士顿和韩国不同研究小组的研究人员，重现了人类乳腺癌细胞中319种蛋白质的检测结果，证实这种方法可跨越实验室和国界实现标准化。 Paulovich说：“这种方法有潜力彻底改变我们检测人类蛋白质的方式。利用全球资源对所有人类蛋白质进行标准化定量设立一些新标准，无疑将能提高临床研究的可重现性，其将对转化新型**和诊断带来巨大的影响。” 蛋白质功能及检测方法缺点 作为所有生物功能的执行分子机器，蛋白质掌控着早期疾病和疾病进程的信号传导。探求癌症生物标记物——细胞中的蛋白质指纹有可能促使开发出一些测试方法，更早期地检测疾病，早在癌症形成之前鉴别出个体的特殊风险，以及更好地指导患者的**。然而没有标准化和可重现的方法来检测它们的水平，验证新发现的候选生物标记物是一件不可能的事情。 每个有前景的生物标记物都必须在临床试验中开展进一步的研究，这就要求研究人员能够检测数百到数千个患者样本中每个候选标志物的丰度。由于将任何一种候选标记物转化至临床应用的机率都极其的低，鉴别一种具有临床价值的生物标记物必须对大量的蛋白质进行测试。 Paulovich说：“现在，你还不能对大多数的人类蛋白质进行大规模检测。在我们完成人类基因组测序，获得DNA分子全目录10多年之后，仍然不能够采用一种标准化定量方法在各种通量模式下对人类蛋白质组开展研究。” 新方法研发及新旧方法比较 为了解决这
咨询热线
18133906270
德尔塔官方微信