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高效分离外泌体的方法你找到了吗
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
关于分离外泌体的最佳方法，仍然众说纷纭，尚无定论。在诸多方法中，尺寸排除色谱法（size exclusion chromatography，SEC)因可分离得到高纯度和浓缩的样本，被广泛用来分离生物液体样本。SEC可通过离心或重力流进行。在重力流的作用下，一个样本可以收集到多组分离组分，并可分析得到高纯度外泌体 Exo-spinTM 技术介绍 Exo-spin™技术结合了沉淀法和SEC法，沉淀剂可以从样本中将外泌体富集出来，但是只使用沉淀剂方法，会导致外泌体和杂蛋白等杂质一起沉降，结合SEC纯化管柱，可去除蛋白等杂质，大大提高了外泌体纯度。 1.SEC原理介绍 SEC方法是一种根据尺寸大小分离溶液中颗粒的方法。色谱柱中装有稳定的聚合物珠（树脂），形成多孔基质。当将含有外泌体的溶液添加到SEC色谱柱中时，较小的颗粒将被捕获在孔中，而较大的颗粒则不会进入孔中并先洗脱。因此，不同阶段的洗脱液中会包含不同大小的颗粒，首先是大颗粒，其次是小颗粒。SEC方法是获得高纯度样品的理想方法，可以将外泌体与其他非外泌体成分分开，同时适用于大体积和小体积的起始样本。 2.Exo-spin技术操作步骤 1. 离心去除细胞和细胞碎片 2. 沉淀含有外泌体的部分（血液样本（血浆和血清）无需此步骤） 3. 将含外泌体的沉淀物添加到Exo-spin™mini-HD色谱柱中，以进行SEC纯化。 从人血清提取外泌体效果验证 方法： 将100 µl人血清样品添加到Exo-spin™mini-HD色谱柱中，然后添加100 µl PBS，并重复添加23次200 µl PBS，直至收集24次200 µl分离组分，分别检测24个组分的外泌体颗粒（下图蓝色曲线）和蛋白浓度（下图灰色曲线）。 结果分析： 使用Exo-spin™mini-HD的人血清分离谱 分离组分分析： 组分1-5，Exo-spin™mini-HD色谱柱未洗脱出外泌体，组分6和7包含外泌体，其中外泌体浓度在组分7中达到峰值，而且这两个组分中的蛋白质含量仍偏低。不需要的杂蛋白体积较小，则在随后洗出。 总结： 使
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STR鉴定报告看不懂，希尔博士来解忧
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
STR是什么意思？ STR（Short Tandem Repeats，短串联重复序列）分析已被国际细胞系鉴定协会（ICLAC：International Cell Line Authentication Committee )、ATCC、NIST（美国国家标准局）等权威机构作为金标准应用于细胞鉴定。由于目前使用错误细胞情况非常严重，越来越多的杂志要求在投稿时提供细胞STR鉴定报告。 今天就来分享STR的鉴定报告如何解读？ 1.STR检测流程 首先了解下STR检测流程，先提取细胞DNA, 然后进行PCR扩增及测序，最后进行结果分析。详细检测流程请看下图： ▲图1 STR检测流程 * Dr.Cell 采用的细胞STR鉴定方法完全符合美国国家标准局（NIST）颁布的细胞鉴定标准-ANSI/ATCC ASN-0002-2011, 并且在中国CMA认证与司法鉴定许可的实验室进行检测。 2.STR位点基因分型结果 完整的细胞STR检测报告请查阅（STR Report-Sample），报告上会列出受检细胞系STR基因分型结果附表（图2），表格中将列出所有实际检测位点信息。第2列“Sample”为样本检测得到的STR位点信息, 该结果是根据实际PCR扩增后检测到的片段长度得到的数据信息。第3列为ATCC、DSMZ等数据库中标准细胞STR位点信息。数据库中常规提供9个位点信息，即 Amelogenin, CSF1PO, D13S317, D16S539, D5S818, D7S820, THO1, TPOX, vWA。 ▲图2 STR基因分型结果 STR位点基因分型结果峰图： 在报告中会给出受检细胞系的STR检测结果峰图（图3），该峰图是实际PCR扩增后检测到的片段长度和分型信息。位点信息与表1（图2）相同。 ▲图3 STR基因分型结果峰图 *STR: 短串联重复序列（short tandem repeats，STR）也称微卫星DNA（microsatellite DNA）, 通常是基因组中由1~6个碱基单元组成的一段DNA重复序列，由于核心单位重复数目在个体间呈高度变异性并且数量丰富，构成了STR基因座的遗传多态性。 ▲图4 STR 短串联重复序列 * 纯合子：Homozygote，指同源染色体在同一基因位点上的两个等位基因相同。即显示单个峰。 * 杂合子：Heteroz
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人胃癌细胞实验要点及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
人胃癌细胞实验要点及说明： 1．本方法适用于贴壁细胞培养，而不适用于悬浮细胞培养，悬浮细胞可使用滴片法； 2．所使用的盖玻片应该为优质玻璃制造，并经过铬酸洗液处理； 3．盖玻片非常薄，易碎，取放盖玻片时动作要轻； 4．如果需要更多生长状态一致的细胞，可以使用较大的培养皿，但不宜过大，以避免培养液的浪费和增加污染机率； 5．如果细胞贴壁生长能力较差，可将盖玻片在0.5%多聚赖氨酸溶液中浸泡5-10分钟并自然晾干。 注意事项： 实验进行前，无菌室及无菌操作台（laminarflow）以紫外灯照射30-60分钟灭菌，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10分钟后，才开始实验操作；每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70%ethanol擦拭无菌操作抬面； 操作间隔应让无菌操作台运转10分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作；无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70%ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作； 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。
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希尔博士关于外泌体保存的常见问题的解答
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
希尔博士在接受外泌体NTA检测的技术咨询时，经常会被问到外泌体保存相关的问题。 譬如： →我的外泌体已经在4度放了一周，还能做检测吗？ →我是1个月前提取的外泌体，一直放在-80度冰箱，还能做粒径检测吗？ →我的样本放在-80度冰箱两个月了，还能提取外泌体做检测吗？ →我在沈阳，寄样本去上海做检测，可以用冰袋寄送吗？ 诸如此类……… 目前并没有定论来回答以上问题， 我们应该去文献中寻找可参考的信息， 抑或——最科学的方式——自行做对照实验去探究。 Example 1 数据来源：Influence of Storage Condition on Exosome Recovery , DOI: 10.1007/s12257-015-0781-x 实验目的：探究不同温度下长时间保存对外泌体样本的影响 实验方法：对HEK 293的细胞培养上清提取分离外泌体，将外泌体样本分成4组，分别保存在-70℃、-20℃、4℃和室温下10天后，进行Western Blot检测，选择的marker为HSP70、CD63、CD9。 实验结果：结果显示，在-20℃和-70℃下保存的外泌体比较完整无损，而4℃和室温下CD63已基本没有表达，室温保存条件下HSP70的表达量也有所降低。 相较于4℃、-70℃和新鲜样本，室温存放的外泌体蛋白和RNA浓度的降低程度较明显。 本例说明，-20℃或更低温度是比较可取的外泌体长期存储条件。 Example 2 数据来源：Effects of storage temperature on airway exosome integrity for diagnostic and functional analyses ，DOI: 10.1080/20013078.2017.1359478 实验目的：探究不同温度下保存对外泌体样本的影响 实验方法：提取分离小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中的外泌体，将外泌体样本分为三组——新鲜提取组和分别保存在-80℃、4℃ 4天的两组，通过DLS、TEM和zeta电位观察外泌体的变化。 实验结果：结果显示，相较于新鲜提取的外泌体样本，低温储存4天的样本粒径有一定程度的增大，电位数值降低，颗粒有团聚倾向；从TEM图片看，-80℃保存的外泌体有多层结构产生。 另外，该实验也通过无标记的LC-MS/MS评估了外泌
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植物膜运输系统抗体介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
在细胞生物学中，膜转运是指调节诸如离子和小分子之类的溶质通过生物膜的机制的集合。生物膜是脂质双层，其中嵌入了蛋白质。穿过膜的调节归因于选择性膜的渗透性，这是生物膜的一种特征，使它们能够分离具有不同化学性质的物质。换句话说，它们可能对某些物质具有渗透性，但对其他物质则不具有渗透性。 大多数溶质通过膜的运动是由膜转运蛋白介导的，该膜转运蛋白在特定分子的转运中具有不同程度的特异性。膜运输方式有被动扩散和主动扩散。被动扩散是一种自发现象，运输过程受运输物质特性和脂双层性质的影响。在主动运输中，溶质逆着浓度或电化学梯度移动，转运蛋白会消耗ATP。主动转运的主要特点是，即使对梯度也能干预，其动力学和使用ATP的选择性高，选择性药理抑制容易。 为了助力广大科研工作者对植物膜运输系统的研究，艾美捷科技作为专业的生命科学领域解决方案供应商，为您推荐Agrisera品牌的植物膜运输系统相关抗体。Agrisera提供了全面的经过验证的高质量抗体，在许多植物物种中具有反应性，并在许多科学文章中被引用。 内膜系统： 产品名称 产品货号 应用类型 ARF1 | ADP-ribosylation factor 1 AS08 325 WB，IF，免疫胶体金 AtArf2 | ADP ribosylation factor 2 AS09 476 WB，ELISA BiP | Lumenal-binding protein (rabbit antibody) AS09 481 ELISA，IF，WB，免疫胶体金 Clathrin heavy-chain 1,2 AS10 690 WB，IF，免疫定位 CNX1/2 | CALNEXIN HOMOLOG 1/2 AS12 2365 WB GPXh | Glutathione peroxidase AS15 2882 WB HDEL | Endoplasmic reticulum retention signal (clone 2E7) AS10 683 WB，IF，免疫胶体金 PIP (PIP1;1, PIP1;2, PIP1;3, PIP1;4, PIP1;5) | Aquaporins AS09 487 WB Sar1 | Secretion-associated and Ras-related protein 1
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药物活性测试技术—AlphaScreen
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
近年来在生命科学领域中兴起的新技术——Alpha，是一种基于增强的化学发光的均相免疫技术，已广泛用于各项生物实验的研究，包括应用于药物活性测试。Alpha技术包括AlphaScreen和AlphaLISA技术， 两种方法都使用同一种供体微珠，但使用不同的受体微珠。 AlphaScreen技术是基于生物分子物质的相互作用的原理发展起来的，如抗原抗体反应、蛋白DNA相互作用、蛋白相互作用等，通过分子之间的相互作用形成供体微珠、受体微珠和相互作用分子的复合物。使用680nm的激光激发供体微珠导致单线态氧分子释放，引发能量转移级联反应，受体微珠发射520~620nm的光波， 具有较强的抗淬灭能力。若生物分子不存在特异的相互作用，单体氧将无法扩散到受体微珠，则不会有信号的产生[1]。 Alpha技术既可以用于检测细胞内的各个生物标志物，也可以进行各类分子相互作用研究，近年来Alpha技术也可以应用于药物活性检测。药物活性测试在药物质量控制中较为重要，目前对药物的活性分析方法主要是体外检测。上海美迪西的生物部在体外生物学领域有丰富广泛的经验，通过酶水平测定、细胞水平测定、细胞生物学、生物化学、体外同位素测定、稳定细胞株建立、基因敲除、RNAi和MicroRNA技术等，提供一套完整的生物学服务。 AlphaScreen技术应用于药物研发领域，其主要优势在于待测物质的范围宽泛，包括从小分子到大型复合物；均相体系、快速、稳定，灵敏度更高。而且AlphaScreen检测也不需要荧光标签的引入，避免了空间位阻影响生物分子的相互结合。AlphaScreen技术也可以用于检测诸如细胞裂解物、血清、血浆、体液等生物学粗提取，而不会影响测读效果。 然而AlphaScreen技术主要的限制在于反应体系对于强光或是长时间的室内光敏感；某些化合物对于单体氧分子的捕获会降低光信号；供体珠光漂白效应使得信号检测以单次为佳。与ECL、FMAT技术相似，AlphaScreen也需要高能激光器；同其他技术相比，AlphaScreen对于检测仪器平台有要求。 AlphaLISA技术是在Al
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如何选择蛋白晶体结构
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
在使用殷赋云计算平台的时候，有不少用户对于如何选择蛋白晶体结构存在疑问。本篇就这个话题做一些经验分享。任何标准都有一个适用范围。我们在这里只讨论用于分子对接的蛋白晶体结构的选择原则和方法。 1. 确定蛋白种属 在实验当中，研究人员通常使用动物模型（如小鼠）来研究人源蛋白。这样做有许多原因，比如： 1） 无法获得（提纯分离）人源蛋白； 2） 需要在体内考察蛋白的功能，但无法直接进行人体临床试验； 3） 使用动物蛋白更方便、更便宜； 4） 其他限制因素。 而计算模拟则便利很多。如果我们真正的研究对象是人体，则一般情况下应当使用人源蛋白。但是，如果需要根据对接计算的结果去指导实验或解释实验现象，或者开展后续实验（如定点突变）对计算结果进行验证，那么，原则上应当让计算用的蛋白种属与实验一致，否则氨基酸序列可能对应不上。 比如，在UniprotKB数据库（https://www.uniprot.org/）输入基因名1DH1，得到以下结果。然后，根据我们确定的种属查询相应的蛋白。 （UniprotKB数据库蛋白查询结果） 假设我们要研究人的蛋白，那么，可以在RCSB Protein Data Bank数据库中搜索它的Entry name（1DHC_HUMAN）。另一方面，PDB数据库也会给出每个晶体结构的种属信息。 （PDB详情页的蛋白种属信息） 2. 了解更多关于蛋白功能/结构的信息 做任何研究都应当对研究对象有充分了解。UniprotKB数据库为我们整合了蛋白的相关知识，我们可以通过它获得重要的信息。比如，了解蛋白的功能是什么，序列有多长，结合位点在哪里，有哪些蛋白结构。 （UniprotKB蛋白详情页，了解蛋白功能与结构信息） （蛋白的结合区域信息） 3. 选择口袋完整的晶体结构 对于某些蛋白，RCSB PDB数据库可能存在许多晶体结构。这种情况下，应当选择包含完整口袋的晶体结构。比如，当我们寻找1DH1基因的蛋白（Isocitrate dehydrogenase [NADP] cytoplasmic，Uniprot AC: IDHC_HUMAN）时，找到许多晶体结构。以4UMX和4UMY为
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影响RT-PCR的因素和反转录引物的选择
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
反转反转，改变一点点，实验大反转！ 科研党们整天都在为提取RNA而烦恼，费尽九牛二虎之力，终于！RNA质量完美！可是。。。qPCR/PCR结果依然不好，咋整?！ 在做qPCR/PCR实验之前，必不可少的一步就是反转录。别小看它哦，它在整个实验流程中发挥着重要作用！ 反转录（Reverse transcription ）是以RNA为模板合成DNA的过程，即RNA指导下的DNA合成。反转录PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）是将RNA的反转录反应和PCR反应联合应用的一种技术（图1）。 图1 影响RT-PCR的因素主要可以概括为以下几点： 1） RNA的质量 反转录必须保证实验使用的RNA质量（如图2所示）：琼脂糖电泳胶图包括28S和18S两条清晰明亮的条带（真核样品），且28S/18S≈2:1，A260/280≈2.0，泳道无弥散区、无基因组、蛋白污染等。 图2 思科捷货号：AC0307，样本：玉米种子 2） 反转录酶的热稳定性 常规反转录酶发挥作用的最佳温度在42℃左右，但常规温度很难打开复杂模板中的二级结构，直接阻碍cDNA的继续合成；选择热稳定性高的反转录酶，可以在高温打开复杂模板中二级结构的同时发挥作用，极大的提高了复杂模板的反转录效率（图3）。 图3 3） 反转录引物的选择 反转录实验可供选择的引物主要包括3种，其各自特征及优缺点如下表所示。可见，根据后续实验的不同要求，需要选择合适恰当的引物进行反转录实验，这同样也是反转录PCR中重要的一环。 表1 引物类型 特征 优势 劣势 Oligo dT或 锚定Oligo dT Oligo dT引物适用于识别mRNA末端的Poly A尾； 锚定Oligo dT在3’端包括G、C或A残基。 可从含Poly A尾的mRNA合成全长cDNA; 锚定碱基保证了引物结合在Poly A 5’端。 只能扩增含有Poly A尾的mRNA，对RNA样品的质量要求较高。 随机引物 含6-9个碱基，可随机识别并在退火时结合在模板RNA上。 可同所有类型的RNA结合；适合于含有二级结构RNA，或微量样本；得率高。 产物来自所有RNA模
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外泌体检测-sapphire多重荧光检测助力您的高分文章
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
· 姓名：外泌体 · 英文名：Exosome · 出生年月：1983年 · 籍贯：细胞（包括肿瘤细胞在内几乎所有类型的细胞） · 现住址：生物体液常年存在于血液、尿液、唾液、母乳和细胞培养基 · 身高：由于我是个泡，得算直径，约为30-200 nm · 家族特征：群居生活，密度在1.13-1.21g/mL · 面貌特征：具有杯状形态、双层膜结构 1983年，我于绵羊网织红细胞中被星探发现，并把我介绍给了大家。1987年Johnstone给我取了一个英文名叫“Exosome”。 我体内含有与细胞来源相关的蛋白质、rRNA和microRNA等，可通过细胞膜受体直接激活受体细胞，也可运输蛋白质、mRNA、miRNA、lncRNA、circRNA，甚至细胞器进入受体细胞，参与细胞间通讯。 我在免疫应答、炎症反应、血管生成、凋亡、凝血和废物处理等生理过程发挥关键作用。 我还可作为多种疾病的早期诊断标记物，也能作为靶向药物的载体进行疾病**。 目前我主要活跃于各大科学研究实验室，还经常会登上主流期刊和杂志等。 不知道看了我的个人简历后，您有没有对我多了一些了解呢？ 如果您想对我有更加深入的了解，您可以选择多种方法联系我，比如通过电镜，Western Blot，ELISA，流式细胞术等。我推荐您使用Western Blot联系我，简单方便，我身体表面的CD63、 CD9、TSG101等被标记后可通过 Western Blot进行鉴定，这样您就可以联系到我了呢！ 2018年，美国Azure Biosystems公司推出全球首款双模式多光谱激光成像，市场上唯一一台同时具有激光近红外荧光，可见荧光，化学发光，可见光，磷屏成像功能的扫描成像系统-Sapphire。 如果您也需要研究外泌体， 快来选择 Azure系列分子成像系统吧！
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肿瘤免疫领域的天后--TNFR2靶点
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
在这个元气满满的周三，百奥赛图知识拓展课堂如期而至，大家是不是早已经压抑不住自己熊熊燃烧的学习之魂啦？今天小编给大家带来了TNFR2靶点，下边就让我们一起来了解一下这个在肿瘤免疫领域牢牢占据着一席之地的靶点吧~ TNFR2基因功能简介 TNFRSF1B（TNF receptor superfamily member 1b） 为TNF受体超家族成员, 也称为TNFR2，主要表达在肿瘤微环境中的Treg细胞和多种肿瘤细胞中（如卵巢癌和肠癌）。其配体TNF主要识别TNFR1进行凋亡，依赖TNFR2进行与T细胞存活相关的功能——通过NF-κB信号促进pro-survival基因的转录，从而促进细胞增殖和生存。许多实验表明阻断型抗体可以特异性杀伤肿瘤微环境中的Treg细胞和肿瘤细胞，用于**多种肿瘤；而激活型抗体可以激活Treg细胞，进而抑制Teff细胞，从而**自身免疫疾病，为免疫**提供了新的靶点。 图1 TNFR1和TNFR2介导了不同的信号和作用[1] 百奥赛图自主研发了TNFR2人源化小鼠，助力抗体药物研发。 基本信息 表型分析 1、B-hTNFR2小鼠mRNA表达分析 通过RT-PCR对WT和B-hTNFR2小鼠中TNFR2基因表达进行品系特异性分析。 在C57BL/6小鼠中可检测到mTNFR2 mRNA，而hTNFR2 mRNA仅在B-hTNFR2纯合鼠中检测到。 2、B-hTNFR2小鼠蛋白表达分析 通过流式细胞术对野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠中TNFR2蛋白表达进行分析。 用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠B细胞表面检测到mTNFR2，在B-hTNFR2纯合鼠B细胞表面检测到hTNFR2。 用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2抗体进行流式细胞术分析。结果显示：在C57BL/6小鼠T细胞表面检测到mTNFR2，在B-hTNFR2纯合鼠T细胞表面检测到hTNFR2。 用抗小鼠CD3ε抗体体内刺激野生型C57BL/6和B-hTNFR2纯合鼠，收集脾细胞，并用种属特异性抗TNFR2
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定量western blot实验为什么需要用验证抗体
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
验证抗体对于WB结果的一致性和重复性是至关重要的，即确认抗体能特异性识别感兴趣的蛋白，抗体与其他蛋白的交叉反应性情况。在您的论文提交给期刊发表之前，经常需要验证抗体的特异性，但并非所有人都花时间进行验证。或者很多人都认为他们使用抗体进行了免疫共沉淀验证，因而不需要再通过蛋白质印迹进行验证。然而，抗体与抗原的亲和性高度依赖于实验条件，因此，验证您的试验方法中的条件适用于抗体与抗原的结合是十分重要的。在《JBC》杂志中关于抗体验证信息如下： 定义所有使用的抗体的来源和种类，包括目录/批号。 描述如何产生新抗体，包括表位/抗原的制备和纯化。 描述支持抗体特异性的数据，包括翻译后修饰或新表位。 证明对抗原进行遗传或其他分子修饰后免疫反应性降低。 定量western blot尤其适用于确认获得的信号仅来自感兴趣的蛋白。如果没有进行抗体验证（并且验证荧光信号与蛋白质的量呈线性关系），将无法获得下游定量分析所需的准确度和精确度。 为确保实验质量，国际抗体验证工作组提供了五种不同的抗体验证方法，其中四种方法适用于western blot，他们建议至少使用其中两种方法进行抗体验证。 遗传策略 用CRISPR-Cas9或RNA干扰（RNAi）在实验组和对照组中进行敲除或敲低实验，然后使用特异性抗体测定目标蛋白的荧光信号。处理后的目标蛋白质的表达很少甚至没有，所以观察到的任何信号都表明抗体存在交叉反应性。 如下图所示，将具有特定蛋白质的细胞裂解物进行western blot，分别使用两种不同siRNA分子敲低目的蛋白的表达，如泳道1和泳道2，与泳道C的对照组相比，我们可以看出siRNA脱靶带来的影响。 正交策略 不依赖于抗体的方法（质谱法）来量化几个蛋白样品的靶信号，然后使用基于抗体的方法（western blot）同样量化相同蛋白样品的靶信号，最后将他们的信号值进行比较。例如，有几种靶向蛋白质组学方法可以量化不同样品中的蛋白质表达。当对抗体进行标记时应参考这些相关的定量数据。 下图
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生物医药领域的黑马：CRISPR/Cas9 技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
优秀的基因编辑技术 CRISPR/Cas9基因编辑技术深受研究人员的喜爱，那么它为什么如此优秀呢？ CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromicrepeats）规律成簇间隔短回文重复；Cas9（CRISPR associated nuclease）是CRISPR相关核酸酶，CRISPR/Cas9是一种由RNA指导的，利用Cas9核酸酶对靶向基因进行编辑的技术。CRISPR系统是一种原核适应性免疫系统，当gRNA 和Cas9在活细胞中表达时，CRISPR-Cas9/sgRNA复合物通过gRNA与基因组DNA的互补碱基配对被招募到靶序列，一旦复合物定位到靶DNA，Cas9蛋白就会极其精确地切割所需区域，导致双链断裂(DSB)，然后，Cas9产生的DSB被细胞自身的细胞内源性DNA修复机制修复：非同源末端连接(NHEJ)DNA修复途径或同源定向修复(HDR)途径。 图1 CRISPR-Cas9介导的基因编辑机制[1] CRISPR/Cas9技术操作简单，基因编辑效率较高，无物种限制，实验周期短，故在生物学领域方面得到了广泛的应用，该系统在精确基因打靶和纠正某些疾病中不需要的突变方面具有巨大的应用前景，基于CRISPR的基因组编辑技术已经成为多种疾病的重要潜在**工具。接下来小编带大家简单了解下CRISPR/Cas9技术的相关应用。 疾病**领域应用 小试牛刀--肺癌**中的应用 肺癌是全球最常见的恶性肿瘤，其发生发展涉及多个基因和信号通路，肺癌的**方法一直是临床研究的热点，化疗和靶向药（如EGFR、ALK、KRAS等靶点）**的耐药性越来越成为令人担忧的问题。肺癌细胞基因组修复和特异性蛋白表达沉默已成为研究和**肺癌的重要手段。利用CRISPR/Cas9 技术全面分析肺癌患者个体，可以在该平台上快速识别基因型特异性缺陷；这种方法还可以模拟给予患者的**，以迅速揭示特定抗癌药物的耐药机制，并帮助确定有效的**方法，以永久纠正癌症相关基因突变。 CRISPR/Cas9 也可用于基因工程免疫细胞，开发更好的肿瘤免疫**方案。CRISPR/Cas9 在许多方面推动了癌症研究的进展，成为精准癌症**的有利基因编辑工具[2]。
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逍鹏小课堂之细胞消化基础问答
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
欢迎大家来到---细胞培养知识小课堂 第二课 细胞培养实验中不可或缺的除了培养基，胰酶也是非常重要的一个角色，虽然细胞培养试验基本技术大同小异，每种细胞的培养条件各不相同，但是，在细胞传代过程中都少不了这个步骤—胰酶消化。 细胞消化使用胰酶时需要了解哪些问题？ 一、 细胞培养过程中为什么要使用胰酶呢？胰酶的作用是什么？ 胰酶是一种蛋白酶，酶切位点是肽链的Lys或Arg两个残基的羧基端肽链，通过在特定位置上降解蛋白，使细胞膜上与培养皿壁结合处蛋白降解，从而使两者分离。这时，细胞由于自身内部细胞骨架的张力以及培养液表面张力可成为球形。 图1.胰酶酶切位点 二、 使用胎牛血清培养细胞，在使用胰酶消化时发现血清可以终止此过程，这是何原因？ 血清终止的原理其实是竞争抑制，就是用过量的牛血清中含有的蛋白和胰酶结合，使胰酶失去消化细胞蛋白的机会。 三、 为什么使用了胰蛋白酶消化，细胞还是成团的，这可能是什么原因导致的？ ① 消化时间不够 ② 吹打力度不够 ③ 胰酶消化液浓度不够 ④ 细胞密度过高之后才消化传代 ⑤ 胰酶存储不当，或者使用了过期胰酶 四、 胰酶分装冻存时要注意什么？ 胰酶分装时尽量分装成多瓶，并遵守3次左右用完和只装2/3体积的原则。因为冷冻保存时体积会膨胀，多次使用同一瓶胰酶反复冻融会降低消化效果并增大污染的可能性。 五、 怎么才能判断胰酶消化完全？ 注意：不是细胞全部成间隔分布很离散的单个圆形才表示消化好了。 一般肉眼观察贴壁细胞层，只要能移动了，多半呈沙状移动就可以了，就应该停止消化。 六、 胰酶适用于哪些细胞消化？它的消化效果与哪些有关呢？ 胰酶适用于消化细胞间质较少的软组织和传代细胞，如胚胎、上皮、肝、肾等组织，但对纤维性组织和较硬的癌组织效果较差。胰酶的消化效果主要与pH值、温度、胰酶浓度、组织块大小和硬度有关。 七、 胰酶中的酚红有哪些作用？ 酚红在培养基中被用来作为pH指示剂，中性时为红
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逍鹏小课堂之细胞培养基础问答
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
您有一封感恩节的信，请注意查收 HAPPY THANKSGIVING DAY ……结束了？ 当然没有 正餐之后还有甜点~ 知识永远都不会迟到 为感谢大家的支持 BI 专门为大家总结了系列问题的解决方案 下面跟小编一起进入细胞培养知识小课堂吧~ 第一课 欢迎大家来到---细胞培养知识小课堂 细胞培养实验中用量最多的就是细胞培养基，虽然细胞培养试验基本技术大同小异，但是每种细胞的培养条件却相差甚远。若偏离某种细胞所需的培养条件，则会导致细胞表达不同的表型 因此，在实验前，需要熟悉自己所使用的细胞系，并在实验中严格遵守所有产品的操作说明。 在实验过程中，作为实验小白，我们应该如何应对相关问题呢？ 来，大家看黑板啦~ 首先，我们要如何挑选适合自己细胞生长的培养基呢？ 选择培养基没有确切的标准，有几点建议可供参考： 建立某种细胞株所用的培养基应该是培养这种细胞适合的培养基。可以查阅 ATCC 或在购买细胞株时咨询供应商。 根据细胞株的特点、实验的需要来选择培养基。如小鼠细胞株多选 RPMI1640。 其他实验室惯用的培养基不妨一试，许多培养基可以适合多种细胞。 也可用多种培养基培养细胞，观察其生长状态，可以用生长曲线、集落形成率等指标判断，根据实验室结果选择最佳培养基，这是最客观的方法，但比较繁琐。 如何正确地保存培养基？ 普通的培养基放置在 2-8℃ 冰箱避光保存，若已开封建议3周内使用。未开封的培养基，一般可稳定保存1年。 培养基中酚红的作用是什么？导致培养基颜色变化的原因有哪些？ 酚红在培养基中被用来作为 pH 值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。 培养基颜色变黄，原因有：培养基中细胞代谢产物为酸性，培养瓶受污染，细菌代谢产酸等导致。 培养基颜色偏暗红色，原因有：培养基保存在 4℃ 冰箱中，培养基内的二氧化碳逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性，而培养基中的酸碱指示剂酚红会随着碱性增加而更
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蛋白分离纯化方法之疏水相互作用层析法
作者：德尔塔 日期：2022-04-18
由于在自然界生命活动中起重要作用的蛋白质在机体细胞内的浓度比较低，并且存在于细胞的各个机构中的蛋白质几乎都是以复杂的混合形式存在的。为了在不破坏蛋白质的空间结构及一级结构，和不影响其生理功能的情况下，把蛋白质分离、纯化出来，需要使用一些技术，如重组蛋白纯化技术。疏水相互作用层析法是蛋白分离纯化的一种方法。 制备高纯度的药用蛋白，必须依靠先进的分离技术，层析技术具有分离效率高、条件温和、选择性强、操作方便等优点，是生物大分子分离纯化最有效的手段之一。蛋白质具有蛋白表面疏水性的特性，蛋白表面疏水性对于维持蛋白质的稳定构象及生物活性有着重要作用，同时又是疏水作用为主的层析分离蛋白质方法的重要依据。疏水相互作用层析法，可以根据生物分子的疏水性强弱差异而实现分离纯化，己经被广泛地用于重组蛋白分离和重组蛋白纯化等。 疏水相互作用层析法（HIC法）的进行重组蛋白纯化的机理如下：生物分子表面的疏水基团在高盐浓度下逐渐暴露，通过疏水相互作用与介质的疏水配基结合；盐浓度下降，分子表面水化程度增加，导致疏水相互作用减弱，从而实现洗脱。 在蛋白质的整体结构中，疏水性氨基酸残基往往存在于蛋白质的内部，少数的也出现在蛋白质的表面，而疏水相互作用层析是根据蛋白质亲水疏水的性质进行分离的。高浓度盐的水溶液中蛋白在柱上保留，在低盐或水溶液中蛋白从柱上被洗脱，因此特别适用于浓硫酸铵溶 液沉淀分离后的母液以及该沉淀用盐溶解后含有目标产品的溶液直接加样到柱上，也适用7 mol/L 盐酸胍或8mol/L 脲的大肠杆菌**蛋白提取液直接加样到柱上，在分离的同时也对其进行了复性。疏水层析具有较少使多肽变性的特点。美迪西提供重组蛋白纯化服务，可以为客户在蛋白表达纯化方面提供多种选择，包括从方案设计、基因优化、表达条件优化到纯化的技术体系，以提高客户的目的蛋白表达水平。 不同类型盐离子与蛋白质作用时释放水分子的情况不同，不同盐类在疏水层析中增
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