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机械细胞破坏与非机械细胞破碎的方法分别有哪些?
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
标签：细菌细胞壁 细胞破碎 细胞裂解 细胞学实验中，尤其是植物细胞实验，常常会遇到的细胞裂解的相关实验，目的是通过机械货非机械的方法打破细胞壁的束缚，从而在进行细胞质或细胞核内部完成DNA编辑相关操作的一种实验方法。细胞破碎的方法有哪些? 总结方法主要有以下8种： 一、细胞破碎的机械方法 机械细胞破坏实际上就是这样：通过固体或液体剪切的方式强行打开细胞壁并溢出内容物。机械破碎的优点是不会引入可能干扰您想要提取的物质的化学物质。然而，容易造成大分子内容物失活。 1.研钵和研杵 研磨破壁法通常是将植物组织样本放在置于冷冻液氮中，通过组织研磨器的研磨来完成的。当组织材料被破坏时，可以通过添加溶剂来提取代谢物。 2.珠磨法 珠磨法是指在等量的细胞悬液和涡旋混合器中加入玻璃珠或磁珠用于通过固体剪切的作用来使细胞裂解的方法。这种细胞裂解法的机械剪切力足够温和，可以保持细胞器的完整性，具有较高的细胞破碎率可大规模使用，适 用于各种细胞破碎。缺点是：大分子内容物较易失活，并且浆液分离较为困难。 3.超声波破碎仪 超声波均质器的工作原理是在浸入细胞溶液中的钛探针中引起振动。发生称为空化的过程，其中微小气泡形成并爆炸，产生局部冲击波并通过压力变化破坏细胞壁。这种方法非常适用于植物和真菌细胞，但有一个缺点：噪音较大，所以使用时，必须在额外的房间内进行。 4.均质机破碎法 均质器在细胞上使用类似于珠法的剪切力。可以通过将细胞挤压到比它们略小的管子中来进行均质化，从而剪掉外层（法压）或使用搅拌机中的旋转刀片（转子-定子处理器）。 5.冷冻破碎法 冻融循环通过在解冻时形成冰晶和细胞膨胀来起作用，最终导致破裂。用于藻类和软植物材料。缺点是非常耗时。 6.高温（微波、高压釜）破碎法 高温（和压力）会破坏细胞壁内的键，也会使蛋白质变性。尽管速度很快，但如果您的应用受到热对电池其余部分的损害影响，您**找到另一种方法。 二、 非机械细胞破碎
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STR细胞鉴定的必要性及鉴定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
应用于生物医学研究领域的哺乳动物细胞被错误鉴定和交叉污染的问题，一直是一个普遍存在的突出问题。据统计，国外实验室有20%左右的细胞株被错误鉴定和交叉污染，NIH和ATCC近两年都对此发出呼吁，要求研究者对细胞进行鉴定。近年来，大量研究表明STR基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的有效和准确的方法之一，STR基因分型应用于细胞鉴定已被ATCC等机构强烈推荐。 细胞STR鉴定的必要性： 在过去的45 人类乳突状瘤病毒（人类乳头状瘤病毒18或HPV18）转型成癌细胞的，而且和正常子宫颈细胞有许多不同。 据估计，国外实验室已建株细胞有接近20％存在上述问题。 2008年，约瑟芬Nefkens研究所的分子生物学家Winand13株食管腺癌细胞系中，其中3株：SEG-1，BIC-1和SK-GT-5被污染，这些细胞株混合有其他癌细胞。这些细胞系已经被多家实验室应用在两个临床试验、并发表了超过100篇SCI文章，这一研究结果被发布在一期的Journal of the National Cancer Institute（JNCI）。 2007 年 NIH发布了通知，强烈建议在使用培养细胞的时候进行鉴定（authentication）。2008 年底，专家提议ATCC致力于人源细胞系的鉴定工作，并制定鉴定的标准程序。 近年来，大量研究表明 STR 基因分型方法是进行细胞交叉污染和性质鉴定的有效和准确的方法之一，STR基因分型应用于细胞鉴定已被ATCC等机构强烈推荐。美国的ATCC 细胞库、德国的DSMZ细胞库以及日本的JCRB细胞库等为STR 分型提供了各细胞株的数据供比对。 2011年初，美国菌种保藏中心（ATCC）制定了人源细胞系STR鉴定标准，旨在约束因细胞交叉污染和错误辨识所导致的无效科研数据的不断扩增。更重要的是，细胞系的鉴定在研发基于细胞下的医学产品时起到至关重要的作用，它能避免将人体细胞暴露于错误鉴定细胞中的风险。 细胞STR鉴定方法 要求能提供细胞的一般和特殊的生物学性状指标。一般特性指标包括：细胞的一般形态、特异性结构、细胞生长曲线和分裂指数、
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Omentin-1基因敲除小鼠与慢性炎症性疾病的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
今天和大家见面的是Omentin-1基因敲除小鼠。 Omentin-1基因 Omentin-1是一种由内脏脂肪组织分泌的脂肪因子，在人内脏脂肪组织和小鼠小肠中高度表达。这种蛋白质在血浆中也非常丰富，并且已发现循环中的omentin-1浓度与促炎因子的水平呈负相关，例如血糖调节受损和慢性动脉疾病的个体中的白细胞介素 （IL）-6和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。 近年来的研究表明，Omentin-1通过AMP活化蛋白激酶/Akt/核因子-κB/丝裂原活化蛋白激酶（ERK、JNK 和 p38）信号传导具有抗炎、抗动脉粥样硬化和心血管保护作用。临床研究表明，omentin-1可作为肥胖、代谢紊乱（包括胰岛素抵抗、糖尿病和代谢综合征）、骨代谢、炎症性疾病、癌症、睡眠呼吸暂停综合征、先兆子痫和多囊卵巢综合征以及动脉粥样硬化心血管疾病的生物标志。因此，研究Omentin-1信号通路显得尤为重要。 图1. Omentin-1是连接器官与脂肪组织的重要成分，在生理和病理过程中通过各种细胞信号通路发挥广泛的保护作用 [1]。 Omentin-1基因敲除小鼠 Rao SS, Hu Y, Xie PL等人通过在小鼠omentin-1基因的外显子4中插入一个碱基（A），导致移码突变，从而获得全身性Omentin-1基因敲除小鼠（赛业生物构建）。基因测序分析和Western Blot实验表明，一个碱基（A）成功插入到Omentin-1基因的序列中，导致小肠（小鼠中Omentin-1表达最高的器官）中Omentin-1蛋白的缺失。 图2. Omentin-1基因敲除小鼠的鉴定。a. 来自Omentin-1敲除小鼠及其野生型同窝小鼠鼠尾的基因组DNA通过DNA测序进行基因分型。b. Omentin-1敲除小鼠中Omentin-1的缺失通过对Omentin-1敲除小鼠及其野生型同窝仔鼠小肠中Omentin-1蛋白的Western Blot实验得到证实[2]。 1●Omentin-1敲除 导致小鼠炎症反应失调 免疫染色显示，与野生型小鼠相比，Omentin-1敲除小鼠骨组织中促炎介质（包括 IL-1β、IL-6 和 TNF-α）的阳性染色区域急剧增加（图3c-h）。与此一致的是，酶联免疫吸附测定 （ELISA） 所确定的，Omentin-
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习得性无助实验模型的建立与检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
起源： 习得性无助现象最早在20世纪60年代初由Mowrer博士的一名研究生Richard L. Solomon观察到的，当时他在测试经典巴甫洛夫条件作用和工具学习这两个过程在原则上是否可以分离和独立。他观察到，适度延长不可控的创伤事件经历会导致后来意想不到的行为变化。之后，Overmier和Seligman于1968年开展了著名的实验：起初把狗关在笼子里，只要铃声一响，就对它进行电击，狗关在笼子里逃避不了电击，多次实验后，铃声一响，还没进行电击，狗就伏倒在地开始呻吟和颤抖，即使把笼门打开，狗也不会逃走了。他们得出结论：将受试动物数小时内暴露于一个无法控制的创伤刺激事件中3-5分钟，会导致受试动物行为应对、联想学习和情绪表达方面的显著缺陷，他们将这些现象称为习得性无助。 应用： 习得性无助是常见的抑郁模型，常用于转基因、行为干预和药理学研究的抗抑郁的有效性验证 关键因素： 习得性无助源于厌恶刺激（如电击）的不可控或不可避免的性质，而不是厌恶刺激本身。为此在有些文献中，会将实验动物分为三组[1]，分别为可回避电击组、不可回避电击组、非电击组 ，实验数据表明只有不可回避电击组的老鼠会出现习得性无助的行为表现。根据电击可回避的方式不同，可分为穿梭回避电击、压杆停止电击等。有相关文献报道，小鼠实验中，穿梭逃避的数据更好[2]。 常用的习得性无助模型有2种[3]： 急性习得性无助(acute learned helplessness)，通过让动物遭受不可避免和不可预测的电击而诱发； 先天性习得性无助症(congenital learned helplessness)，通过挑选急性习得性无助的动物品系选择性繁育而来。 以急性习得性无助模型为例，分别介绍两篇高分文献中的大小鼠实验方案。 实验材料： 动物若干（实验成功率约为60%，所以需要提前计算造模动物数量）、Panlab穿梭箱系统（包含隔音箱、电击发生器、检测软件等） 实验流程： 整个完整的习得性无助实验分为造模时期和检测时期，研究表明在造模结束后的24-48h内
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共聚焦原理解析（一）：针孔几何形状-完美的四边形
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
共聚焦成像的光学切片要求在光路发射部分的场共轭平面上有一个小孔。在最简单的情况下，这个孔径为圆形，允许透射出照亮孔径的艾里衍射图案的中心部分。孔径大小应该刚好可以通过该图案（“艾里斑”）的内圈。因此，孔径的正确大小取决于波长和物镜的数值孔径，因为这些参数也定义了中间像平面中的（放大）衍射图案。 为了适应不同的颜色和分辨率，检测针孔应该可变。要获得精确的圆形孔径，这意味着在机械设备上提供一组孔径，以便在需要时可以改变大小。大多数共聚焦显微镜使用一种可调谐针孔代替，通常为双叶片“虹膜”。因此，孔径不是圆形，而是矩形（正方形）。 有人认为，六角形针孔（使用三枚叶片）在传递焦点信息方面会更有效，因为它可以覆盖较大部分的圆形[1,2]。 不同几何形状的面积 可以通过孔径的光量显然取决于孔径本身的大小。举例来说，对于圆形孔径，如果半径增加，就会透射更多光线。然后，该透光量取决于由半径r定义的面积Ac： 如果孔径为方形，则面积As的计算取决于边长a： 最后，通过边长s给出六边形的面积Ah： 所有这些计算只需具备中学知识即可。然而，如何比较不同尺寸并无明确规定：例如，你可以比较内接于圆形的六边形。这种情况下，这些面积的比率为Ac：Ah：As = 100：83：64。正方形的面积比六边形小大约30%。这一结果被用来证明使用六边形孔径时，与正方形光圈相比，“亮度提高了30%”。这一声明来自官方，甚至出现在公开网站上。 同样的，人们可以使用带内接圆形的多边形比较。这种情况，这些面积的比率为Ac：Ah：As = 100：110：127，由此我们可以得出结论，使用方形孔径时，亮度可以提高大约15%。 很明显，这两种论述在科学上都站不住脚，会让读者陷入迷惑，当然这可能就是这种陈述的目的。 由于通过孔径的光量取决于面积，因此比较不同尺寸的正确参数是各种几何形状的面积。通过非常简单的数据运算，你可以知道： 必须要获得面积与半径为r的圆形孔径相同的多边形。这一共识
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发现代谢组学-亲水版技术介绍与应用案例分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
「发现代谢组学-亲水版」是代谢组学核心研究手段之一，可高效完成样本中亲水性代谢物的检测定性，即通过液质联用(LC-MS)方法检测生物体受外界刺激前后体内大多数小分子代谢物的动态变化，重点寻找在实验组和对照组中有显著变化的代谢物，进而研究这些代谢物与生理病理变化的相关关系，其研究对象大都是分子量1500Da以内的小分子物质。 技术优势 • 较高的灵敏度、分辨率 • 较宽的动态范围 • 适合于生物样本中复杂代谢产物的检测和潜在标志物的鉴定 • 适合对标本中未知代谢物的探索研究 • 定性准：6D质控体系 技术路线 技术参数 样本要求 血清、血浆：200 μL/sample 尿液：1 mL/sample 组织：200 mg/sample 粪便、肠道内容物：200 mg/sample 细胞、微生物：1X 107 cells/sample 培养液：200 μL/sample 生物学重复 样本数量：植物和微生物n≥6，动物样本n≥10，临床样本n≥30，所有重复样本独立分析 其他种类的样品在收集之前请联系我司销售工程师 检测平台 UHPLC-QE-MS(Thermo Vanquish UHPLC-Thermo Q Exactive HFX) 常规项目周期 17个自然日，含基础数据分析 应用方向 • 表型和生理功能研究 • 疾病病理研究 • 临床诊断及** • 药物研究 • 中医理论研究 • 食品科学与营养学研究 • 畜牧与农林业研究 • 环境毒理研究 案例分析 标题：IgG4相关性硬化性胆管炎和原发性硬化性胆管炎中粪便微生物组和代谢组的改变 研究对象: 硬化性胆管炎 期刊: Gut 影响因子: 23.059 时间: 2021年 研究背景 IgG4相关硬化性胆管炎(IgG4-SC)与原发性硬化性胆管炎(PSC)有多种临床相似之处，但皮质类固醇**对大多数 IgG4-SC 患者有效，而对 PSC 患者存在无效性，且两种疾病的预后也不同，PSC发生肝硬化、 胆管癌和结直肠癌的风险高于IgG4-SC。这两种硬化性胆管炎的发病机制目前尚不清楚。虽然在PSC中肠道菌群失调已被广泛研究，但肠道菌群在IgG4-SC中的作用机制仍不清楚。 研究结果 IgG4-SC和PSC具有不同的宿主—微生物相互作用，可能
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共聚焦原理解析（二）：激发
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
从滤光片转轮到声光可调滤光器（AOTF） 荧光的激发需要特定颜色的光：既要有效地激发探针（波长接近探针激发光谱的最大值），又要留下足够的空间收集发射光而不会进入检测器的光路中。在共聚焦显微镜中，通常使用多谱线激光器或激光电池作为激发光源，这需要设备既能够自由选择适合当前实验所用荧光团的激发谱线又能够控制该激发谱线的强度因为直接在光源处控制强度时，大多数激光器会出现噪音增强的现象。AOTF（声光可调滤光器）的引入简化了滤光过程，同时显着提高了实验的灵活性。AOTF对于耦合白激光源是唯一的明智选择。 滤光片转轮-早期的滤光工具 共聚焦显微镜中荧光的激发光源是激光或不同颜色的激光组合。出于技术原因共聚焦选择激光作为光源[2]。但是传统激光器通常只发射一条或几条单一波长的激光谱线（现代化解决方案是白光激光器[3]）。然而，生物医学成像所使用的荧光染料的激发光谱从近紫外到近红外的都有。大多数情况下，为了同时检测几种不同荧光染料的发射情况，需要通过二向色镜结合一系列激光谱线来实现。在这种情况下，与在荧光照明中分离激发和发射光的“分光镜”相比，反射镜以反向模式使用。 由于通常激光器的低频噪声频带相对较窄，因此不建议直接通过激光功率控制强度。因此，需要一种设备来单独减弱激光强度。同样，如果关闭和打开光源次数过多，激光器寿命也会缩短。特别是气体激光器，在关闭后仍处于高温状态而未冷却时，不适合马上再次开启。 “激光电池”满足以上所有要求，它由一系列激光器（通常为3-5个）组成。所有激光器均配有光闸，光闸由机电驱动并由软件控制。所有激光器都需要一个用于减弱强度的伺服控制设备（一个带有一系列灰度滤片滤光片转轮或滑块）多谱线激光器还需要另一个滤光片转轮或滑块，它包含一系列边缘滤片和带通滤片，以便选择单谱线或组合谱线。 显然，整个设置可能会变得略微复杂低效，容易出现错位和漂移问题，可能在滤片选择切换过程中引发机械振动。若改变激发
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红外测油仪与紫外测油仪的区别
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
随着国家对于环境保护工作的加强，对于水质污染检测的指标要求越来越高。作为环境监测中的水中油的检测也受到了相当的重视程度。今天就和大家聊聊红外测油仪和紫外测油仪在测定水中油时有什么区别？ 红外测油仪 红外分光测油仪根据HJ637-2018标准，用四氯乙烯萃取样品中的油类物质测定总油，然后将萃取液用硅酸镁吸附，除去动植物油类等极性物质后，测定石油类。总油和石油类的含量均由波数分别为：2930cm-1(CH2基团中C-H键的)、2960cm-1(CH3基团中C- H键的伸缩振动)和3030cm-1(芳香环中C-H键的伸缩振动)谱带处的吸光度A2930。A2960和A3030进行计算.动植物油的含量按总萃取物与石油类含量之差计算。 工作原理： 大多数物质的分子官能基能吸收红外光，利用光谱能量的吸收与转换进行内部成分的定性分析和定量计算。红外测油仪以此为基本原理，采用红外光度测量，经过对样品进行光谱扫描可显示样品光谱及吸收峰的波数位置，能迅速、准确地测量水体中油分浓度的含量。 应用范围： 广泛应用在环境监测系统、石油化工、水文水利、自来水公司、污水处理厂、 火力发电、钢铁企业、高校科研教学、农业环境监测、铁路环境监测、土壤中石油类(矿物油)、动植物油及总油含量的监测，以及烟气(饮食行业油烟)含油量监测的使用。目前红外测油仪主要分为便携式红外测油仪、触屏台式红外测油仪。仪器可实现水体、气体、固体中含油量的测量。 紫外测油仪 紫外测油仪依据国家环境水质监测紫外分光光度测油法，结合我国环境污染状况及各环境监测部门需要，而研发出的一种准确快捷的测油仪器。仪器用正己烷萃取剂替代红外法中已被禁用的四氯化碳萃取剂，符合新国标《HJ970-2018水质石油类的测定紫外分光光度法》的要求。该产品操作简单，精密度好,灵敏度高,性能稳定，能满足客户的各种应用要求。 工作原理： 在pH≤2的条件下，样品中的油类物质被正己烷萃取，萃取液经无水硫酸钠脱水，再经硅酸镁吸附除去动植物油类等极性物质，于紫外区测
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斑马鱼视觉神经信号研究进展及方法深度解析
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
斑马鱼是一种原产于南亚地区的小型热带淡水鱼，成鱼体长只有3厘米左右。斑马鱼发育速度快，受精后3天左右主要组织器官发育已经完成，5天左右开口进食，约3个月达到性成熟，寿命可达2年以上。由于斑马鱼是体外受精发育并且胚体透明，因此其组织器官的发育和变化、血流、心跳等都可以在显微镜下直接进行观察。 斑马鱼跟哺乳动物相比，具有饲养密度高（100㎡可养殖2-3万尾成年斑马鱼、养殖成本低（小鼠的1/10）、实验通量高（可在96孔板中进行高通量分析）、所需要的样品量少（100mg以内）、便于活体观察、实验周期短（大部分实验5天以内可以完成）、繁殖能力强（每队亲本一次可繁殖200枚左右胚胎）等显著优势。 由于斑马鱼和人类基因有着87%的高度同源性，作为模式生物的优势很突出，是重要的实验动物，堪称“水中小白鼠”，其实验结果大多数情况下适用于人体。 目前斑马鱼模式动物常用于以下研究领域： 1. 癌症发病机理研究和抗癌药筛选 2. 神经系统疾病研究 3. 代谢性疾病研究 4. 药物毒性评价 5. 免疫学研究 在高级神经活动中，斑马鱼实验模型在学习与记忆中的应用比果蝇、海兔等更加广泛。斑马鱼的学习可以在很多行为中得到体现，如社会交流、觅食、航行及捕食逃避等。在斑马鱼的学习行为实验中，可以使用T迷宫，条件位置偏爱等来探讨年龄对斑马鱼学习与记忆功能的影响。 （斑马鱼T迷宫，条件位置偏爱箱行为实验图） 除此之外，作为一种白昼活动的鱼类，斑马鱼有明显的昼夜节律，体内的激素水平也会有一个周期性的变化。斑马鱼也会发生昼夜节律性的睡眠，对于睡眠时期的行为观察，一般常用的手段是使用具有红外线感应功能的照相机，分析其呼吸频率、心跳频率和腮动频率，再结合电生理方面的知识，从而对斑马鱼的睡眠有一个较全面的了解。 野外条件下，当斑马鱼在下雨天或是在浑浊的水中游动时，其视觉感知功能十分有限，因此除了嗅觉可能在这其中起作用外，斑马鱼具有的磁场感知功能也会发挥作用
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共聚焦原理解析（三）：光路
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
共聚焦显微镜是指一类可以记录光学切片的特殊光学显微镜。 通过照亮和观察单个衍射极限点，在激光共焦系统中实现光学切片。这需要两个光束段焦点一致，因此是“共焦的”。与宽场图像相反，共聚焦图像没有散焦模糊情况。这本身就是一个优势，因为样品深层的图像显示清晰，细节丰富。然而，最重要的优势是其具有微观特征的三维可视化潜力。沿三维（z-stack）采集图像序列后，由计算机重建和显示三维物体。 共焦照明 ，通过将光源聚焦在小孔径（针孔）上，然后聚焦到样品中，实现点光源照明。当孔径足够小时，照明点仅受衍射限制，不受光源和孔径几何参数的限制。普通光源是大的面光源，是不可能将其聚焦到衍射极限的光点上。因此，尽管透过率非常低，这种聚焦照明光仍然是十分必要的（对于传统光源）。 图1：用于共焦成像的照明。来自光源（Ls）的光聚焦于照明针孔（Pi），然后进入样品S。 激光作为光源具有非常高的准直度（良好激光中的光“极度平行”）。因此，在不应用针孔的情况下，激光可以通过单个透镜聚焦到衍射限制的光点上。因此，大多数共聚焦显微镜没有照明针孔。光点的质量取决于激光的光束质量。如果质量不佳，也可以插入照明针孔。激光通常通过光纤耦合到共聚焦显微镜上。这些光纤本身也起针孔的作用。 激光的可聚焦性和高能量密度使其成为共聚焦显微镜的理想光源。激光的相干性不是共焦性能所需的特征。相反，这对光学设计师来说是一个挑战，因为它会引起假的干扰图案，因而需要谨慎的设计策略。 此外，传统激光器仅发射单一颜色（激光-“线”），这一事实本身也有局限，在多荧光成像和测量时，就需要复杂的多激光排列。白激光很巧妙地解决了多色成像的问题。 图2：共焦（右侧区域）和非共焦成像的比较。在Feulgen染色的小鼠滋养层中。非共焦图像的很多信息并非来自焦平面。共焦光学消除了所有模糊的因素，使结构变得清晰。 共聚焦检测 大多数探测器具有相当大的敏感区域（光电倍增管通常为几平方厘米
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手持式藻类荧光测量技术-通过调控质体醌的合成重编程集胞藻新陈代谢
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
易科泰手持式藻类光合-荧光测量技术应用案例-通过调控质体醌的合成重编程集胞藻新陈代谢 质体醌（PQ）是光合和呼吸电子传递链中非常重要的载体，虽然PQ含量及其氧化还原状态对光合微生物的生理和代谢有重要影响，但目前在光合微生物中关于PQ的合成及其相关代谢调控机制研究相对较少。2021年华东理工大学的科研人员，在Synthetic and Systems Biotechnology发表了 “Reprogramming the metabolism of Synechocystis PCC 6803 by regulating the plastoquinone biosynthesis”，通过引入外源基因竞争质体醌合成途径和添加外源化合物促进PQ积累等“开源节流”手段，探索了质体醌含量变化对集胞藻代谢的影响。 研究人员通过易科泰藻类光合-荧光测量技术检测了PQ含量变化对光系统Ⅱ的影响，结果发现，当PQ含量降低时，集胞藻的快速荧光动力学曲线（OJIP）基本形态没有发生改变，OJIP初始斜率(Mo)和j阶荧光相对变量 (Vj)分别下降了7.95%和7.55%，说明对羟基苯甲酸多异戊烯转移酶（lePGT）的过表达促进了QA和QB间的电子传递；通过添加外源低浓度4-羟基丁酸（4-HB），发现随着4-HB浓度的增加，OJIP初始斜率(Mo)和j阶荧光相对变量 (Vj)逐渐升高，说明低浓度4-HB抑制了QA和QB之间的电子传递。 同时通过藻类光合-荧光测量技术测量了PQ含量变化对呼吸作用的影响，结果发现lePGT过表达的集胞藻呼吸速率比野生型（WT）高27.35%，这可能是因为光系统过度还原，需要光合和呼吸之间的代谢合作提供更多ATP；添加低浓度4-HB都能增加PQ含量，当添加1 mM 4-HB时呼吸速率提高了20.08%，添加2 mM 4-HB时呼吸速率降低了54.90%，结合叶绿素荧光参数分析说明PQ不仅是氧化还原的中间体，还可以通过其他途径影响集胞藻的生理状态。因此，PQ含量的变化将对集胞藻的光合和呼吸作用产生重要影响。 本研究探索了电子传递链核心PQ的合成调控及对生长代谢的影响，通过胞内PQ含量的变化实现对其生长代谢的精确调控，为发
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技术分享“荧光原位杂交技术全攻略”
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
原位杂交（in situ hybridization）是指将特定标记的已知顺序核酸为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交，从而对特定核酸顺序进行精确定量定位的过程。基本原理是两条核苷酸单链片段，在适宜的条件下，能过氢键结合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或 RNA-RNA 双键分子的特点，应用带有标记的（放射性同位素、荧光素生物素、地高辛等非放射性物质）DNA或RNA片段作为核酸探针，与组织切片或细胞内待测核酸（RNA或DNA）片段进行杂交，然后可用放射自显影等方法予以显示，在光镜或电镜下观察目的 mRNA或DNA 的存在并定位。 荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization，FISH）是以荧光标记取代同位素标记而形成的一种原位杂交方法。因为不需要放射性同位素标记，因此经济安全；还可以通过不同标记的探针，在同一个样品中同时检测多种序列。 荧光原位杂交探针的荧光标记可以采用直接和间接标记的方法。间接标记是采用生物素标记DNA探针，杂交之后用荧光素亲和素或者链霉亲和素进行检测，同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物，将荧光信号进行放大；直接标记法是将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合，或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法检测步骤简单，但由于不能进行信号放大，因此灵敏度不如间接标记的方法。 原位杂交探针分类 染色体特异重复序列探针，主要用于检测染色体数目异常； 全染色体或染色体区域特异性探针，主要用于检测染色体数目或结构异常； 特异性位置探针，用于检测染色体的易位、缺失等。此外，还有用于特定RNA检测的人工合成或体外转录的探针。 荧光原位杂交实验的步骤 探针变性：将探针在75℃恒温水浴中温育5min，立即置0℃，5～10min，使双链DNA探针变性。 切片置于65℃下过夜烘烤。 二甲苯中室温脱蜡2次，每次10分钟，随后浸入100%乙醇中5分钟。 切片依次室温置于100％乙醇、85％乙醇和70％乙醇中各两分钟复水。
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艾本德5810r离心机使用方法指导简要步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
艾本德的大容量离心机已经被广大国内用户认可，但是英文的操作手册很不方便， 我给朋友们一份简单的手册，建议使用者把它打出来贴在机器边上以便学生正常操作。 eppendorf离心机5810R操作步骤： 1． 连接电源，打开仪器旁边的开关。 2． 根据盛放样品的离心管的大小，安放转子，用六角扳手按顺时针方向上紧，将离心管平衡放入，盖上转头盖（大转头的盖子应该旋紧），正确关上离心机盖子，使“Open”键上的指示灯变亮。 3． 通过Speed键、Time键、Temp键和▲、▼键来调整离心的参数。以Speed的设定为例， 按Speed键使速度值呈现闪烁状态，再用▲、▼键来更改数值；如果要设定离心力（rcf），重复按Speed键直到离心力符号（*）出现在速度值的左边，便可进行设定。 4． 参数设定完后，按Start键开始运行程序，运行过程中，屏幕显示当前速度或离心力、 样品温度及剩余时间。 5． 运行结束或按Stop键终止运行后，转子逐渐减速直至停止，当Open键上的指示灯亮起时，可按Open键打开机盖。 eppendorf离心机5810R使用注意事项： 1. 所离心样品应严格配平，单对样品质量差不应超过0.5g，不得超过1g;多对样品累计质量差不应超过 2g，不得超过3g;如离心时用到管架也需严格对称放置。不同型号管子离心时，需用天平称量，重量相等以后才可对称放入离心。 2. 根据离心的样品选择合适的转子，使用前检查转子有无裂缝和变形，如有不得继续使用;检查转轴有无问题，将转子轻放到转轴上，用配套的六角扳手拧紧（以正常力道拧不动为准，不可太紧或太松）。 3. 离心机会自动识别转子并限制转速，但仍要注意设定转速不要超过该转子的最大转速;当本次使用的转子和上一次不同时，应先空转一次，让离心机先识别转子。 4. 离心管中的样品量不能超过离心管体积的2/3，以免离心时样品溢出，离心管管盖应盖紧，并拧上转子盖。 5. 离心开始后不要急于离开，需等到转速升到设定转速并平稳运行后放可离开，提速过程中如有异常声响或震动，应立
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共聚焦原理解析（四）：荧光寿命-一个适当的选择
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
SP8 FALCON-即时产生荧光寿命成像（FLIM） 我们经常听到别人抱怨荧光寿命测量：“寿命分析太复杂了！”但这种情况即将改变！新技术和新概念的发展促进了数据评估，意味着荧光寿命成像(FLIM)的速度提高了10倍，可以媲美标准共聚焦成像，且操作简单。 图为小鼠胚胎的寿命图像。722个视野拼接，拟合出4个独立的特征寿命。采集时间约1小时-传统方法约1天。 荧光成像远超您的想象！ 荧光过程提供了两个用于成像的测量参数：强度和荧光寿命。荧光寿命是指分子停留在激发态的时间。可以通过观察足够大量的激发-发射事件集合来测量荧光染料的典型寿命。我们可以测量图像中所有像素的典型寿命，并将这些数字记入数组元素。那就是荧光寿命成像[1](FLIM，也称为τ-映射）。典型的荧光寿命范围在0.2到20纳秒之间。 荧光寿命与荧光染料的浓度无关。无论样品结构仅有零星荧光染料还是载满荧光染料：寿命信号始终相同，并表明在同一环境中存在相同的荧光染料。因此，荧光寿命不受光漂白的影响。样品深处的图像将比表面图像暗得多——但寿命并没有改变。这是寿命测定的主要优势。 如果分子环境刺激激发态衰变而不发射光子，则荧光强度会降低（淬灭）。荧光淬灭是一条单独的发射路径，因此在动力学上与荧光过程形成竞争关系。激发态存储现在可以通过一个以上的过程衰变，从而缩短荧光寿命。这种寿命的改变可用于收集分子环境的信息。 一种特殊类型的淬灭是将激发能量以非辐射的方式传递到相邻的不同荧光染料中：“荧光共振能量转移”[2]，FRET。此时，不仅第一个荧光染料（供体）变暗，寿命变短，而且第二个荧光染料（受体）在“错误的”激发颜色下开始发光。由于这种效果的产生需要两种荧光染料（小于10 nm）的密切接触，因此将其用作研究分子相互作用的“分子标尺”。它也是许多现代FRET生物传感器的基础，专门用于测量活体样本中的各种细胞内参数：Ca2+或其他离子浓度追踪、酸碱度、极性和电位测量、蛋白质相互作用等。 FLIM-标准 FLIM的黄金
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实验结果可重复性关键因素：细胞培养中的氧含量
作者：德尔塔 日期：2022-04-13
哺乳动物细胞培养是生物医学研究的基础，科学研究结果的重复性越来越受到关注。在一般生物医学文献中对影响氧输送的因素的报道就很有必要体现这一点。 细胞耗氧率与氧扩散之间互相影响的因素有：培养基的深度、细胞的种类。有研究人员通过对200份文献的研究分析发现，绝大部分文献至少欠缺上述提到因素的其中一个，因此根本无法保证实验结果的可重复性。 因此，我们强烈建议必须把“明确地报告这些数据”纳入发表文献的其中一个要求。 研究分析 简介 1.实验结果可重复性的重要性； 科学实验的可重复性是知识可靠性、真实性的必要保证。要想保证实验的可重复性，要完善各项管理制度，规约研究科研人员、实验人员、科研机构、监管机构等各主体的责任及实验过程的标准化等方面，才能确保实验活动的正常顺利开展。 2. 细胞培养里的氧浓度值不能完全反映真实人体生理环境的氧浓度值； 3. 氧合的变化对细胞有显著的影响。 讨论 1. 影响氧扩散的关键因素： 细胞耗氧率、细胞密度、氧分压、氧气溶解度、温度、培养基扩散特性、培养皿/培养瓶内培养基的深度。 以上这些因素的改变，均会影响培养基中的氧浓度变化 研究发现，全球科学类杂志中关于哺乳类动物细胞培养相关的文献，完全或部分提到细胞氧合因素的只占了极少数 其他的影响因素 2. 影响氧合的变量在文献中没有充分的记录； 3. 在所有使用哺乳动物细胞培养的手稿中，应记录影响氧合的变量； 4. 细胞氧合情况在诠释实验时必须纳入考量。 总结 1. 研究证明，氧浓度的变化对细胞培养形状有着举足轻重的影响. 2.实验结果的可重复性差不能完全只归咎于对氧合状态研究的缺乏，却能有效提高实验结果的可重复性！ 3. 编辑科学期刊者必须保证所有发表与哺乳类动物细胞培养相关的文章必须详细介绍4个关键氧合参数！ 4. 实验人员应定期评估他们细胞实验培养系统中的氧合条件，并在他们的研究分析中把这些条件作为影响
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