-
磷酸化多肽及其修饰方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
蛋白质磷酸化是生物界最普遍，也是最重要的一种蛋白质翻译后修饰，20世纪50年代以来一直被生物学家看作是一种动态的生物调节过程。在细胞中，大概有1/3的的蛋白质被认为是通过磷酸化修饰的。蛋白质的磷酸化修饰与多种生物学过程密切相关，如DNA损伤修复、转录调节、信号传导、细胞凋亡的调节等。磷酸化蛋白质及多肽的研究可以帮助人们阐述上述过程的机理，进一步认识生命活动的本质。近年来随着蛋白质组技术的不断发展，蛋白质磷酸化的研究越来越受到广泛的关注。 蛋白质磷酸化在细胞信号转导中的作用 磷酸化多肽主要指肽链中的Ser、Tyr和Thr残基的侧链羟基被修饰成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白质磷酸化过程的必不可少的工具，因此研究蛋白质及多肽的磷酸化反应并确定成熟简便的合成路线就变得非常重要。目前为止，多肽的磷酸化修饰主要有后磷酸化法和单体法两种合成方法。后磷酸化法是多肽序列在树脂上合成完后，再对其中的Ser、Tyr或Thr的侧链羟基进行磷酸化；单体法则是将适当保护的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，这种方法较后磷酸化法操作更为简便，已经成为多肽磷酸化修饰的主要方法。 单体法修饰时，磷酸化的氨基酸由于侧链修饰的较大基团产生的位阻而导致难以与肽链缩合，并且之后的氨基酸引入都会比较困难，尤其在含有多个磷酸化位点修饰时，合成将变得异常困难，并且最终产物成分复杂，难以分离，产率极低。因此，当肽链中多个位点进行磷酸化时，可以考虑采用后磷酸化法，其合成过程主要就是在多肽合成结束之后，选择性的脱去要标记氨基酸的侧链保护基，对于Tyr，Thr可以直接使用侧链不保护的氨基酸进行反应。侧链保护基在1%TFA/DCM条件下可以定量的脱除。后磷酸化时，可以采用双苄基亚磷酰胺，四氮唑生成亚磷酰胺四唑活性中间体，连接到羟基上，然后在过氧酸条件下氧化生成磷酰基，完成反应。 我们提供多肽进行两个，三个，四个，五个磷酸化位点修饰的高质量多肽。拥有成熟的合成纯化技术，不
-
使用FT-IR对传统的中药红花油进行快速的质量控制
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
红花油中最重要的化学成分是水杨酸甲酯（来自鹿蹄草油）、丁香酚（来自丁香 或肉桂 皮）和α-蒎烯（来自松节油）。这已经是被中华人民共和国卫生部的WS3- B-2699-97[1]出版物所公认，并且卫生部强调，在红花油成品被批准公开销售之 前，这三种组分的含量必须通过气相色谱（GC）的方法进行定量。根据这份文件 规定，水杨酸甲酯和丁香酚的最低含量分别是33.5% v/v和38% v/v。质量差的 红花油典型的是含有较少丁香酚，因为丁香和肉桂皮必须油比鹿蹄草贵很多，并 且鹿蹄草天然油很容易用工业的水杨酸甲酯取代。另一种质量差的可能来源是 通过添加过量的惰性植物或者石蜡油对红花油进行掺杂。 在这篇文献中，我们将通过可视化的红外光谱图来展示关 于红花油质量的重要信息，并且总的分析时间只有几分钟， 甚至更少。另一篇文献中[2]，我们将对这三种主要成分建立 精准的定量校正曲线。 实验部分 我们使用PerkinElmer公司的Spectrum Frontier傅里叶变换 红外光谱仪采集样品红外光谱，且该红外光谱仪与9次反 射金刚石/硒化锌晶体的衰减全反射（ATR）采样附件搭配 使用。光谱采集分辨率为4cm-1，累积扫描时间60s。 图1. The Frontier FT-IR 结果和讨论 纯化合物和一些商业化样品的红外谱图 如图2是水杨酸甲酯、丁香酚和α-蒎烯的分子结构和红外 谱图，以及两种商业化红花油样品的红外谱图，样品A和样 品B，O-H和C-H键的伸缩振动信息量尤其的大。虽然水杨 酸甲酯和丁香酚都含有酚羟基，但是水杨酸甲酯的伸缩振 动频率大约出现3300cm-1以下。这是因为酚羟基与邻近的 羰基上的氢结合形成分子内氢键，这样就使得这两种物质 很容易地通过可视化的红外谱图区别开来。α-蒎烯可通过 非常强C-H伸缩振动谱带识别出来，尤其是在2916 cm-1，尽 管该处谱带与丁香酚有所重叠，但是并不能从其它的的碳 氢化合物中区别出来。 图2. 红花油中主要组分的分子结构和红外谱图（O-H和C-H伸缩振动区域）以及来自不同供应商的两个商
-
使用Avio 500 ICP-OES根据伦敦金属交易所要求测定纯镍中杂质
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
镍（Ni）由于其高温和低温下的耐腐蚀性和强度，是最广泛使用的金属之一。 它最常用于钢的生产，也是各种其他合金中的重要成分。还用于电子，电镀和可充电电池中。 这些不同的用途需要不同纯度的镍，在某些应用中需要高纯度的镍，而对于其他应用领域低等级的镍就能满足需求了。 伦敦金属交易所（LME）就不同金属杂质的镍发布了不同规格的要求。 本文的重点是利用 PerkinElmer Avio ® 500 ICP 发射光谱仪（ICP-OES）对镍中的杂质进行分析，使用“原料镍要求”作为待测元素和所需浓度的指南。 实验部分 样品 所有分析在 1％ Ni 溶液中进行，以模拟纯 Ni 消解液（介质为 5％硝酸（v /v））。为了检查方法准确性，按照“镍标准规范”（99.80％），“原料镍要求”中规定的含量，进行加标回收实验。检测使用外标法进行，浓度水平为0.25,0.5 和 1.0ppm 混合标准溶液，介质为 5％硝酸。 仪器 使用 Avio 500 ICP-OES 进行测试，标准进样系统配置和参数用于所有分析。 炬管位置设置为-4。 在考虑氩气成本时，Avio 500 的同步双向观测功能和低氩消耗（总共 9 升 /分钟）可大大节省成本。 结果与讨论 表 3 显示了 99.80％（wt%）的镍的 ASTM 标准规范，以及 1％ Ni 溶液中各元素的浓度（相当于 100 倍稀释）。将混合标准溶液加入到 1％ Ni 溶液中后的所有回收率在 ±10％内，表明仪器能够在低浓度下准确测量这些元素。Bi 和 Sn 受到 Ni 基体明显的光谱干扰。使用多谱线拟合 （MSF）建立模型可将干扰的影响去除，从而满足测量准确度。 结论 本文证明了PerkinElmer Avio 500 ICP-OES可对高纯Ni （1%Ni 溶液模拟）的杂质进行准确分析，符合伦敦金属交易所规定的纯镍要求。通过使用 MSF 克服了高基体样品的光谱干扰，所有元素检出限都在规定的范围以内。 参考文献 1. "Special Contract Rules for Primary Nickel", The London Metal Exchange. 2. "Multicomponent Spectral Fitting"”, Technical Note, PerkinElm
-
细胞冻存和复苏要点详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细胞冻存和复苏 细胞冻存及复苏的基本原则是“慢冻快融”，这样可以最大限度的保存细胞活力。目前细胞冻存多用二甲基亚砜（DMSO）作为保护剂，这两种物质能提高细胞膜对水的通透性；缓慢冷冻可使细胞内的水分渗出细胞外，减少细胞内冰晶的形成，从而减少冰晶对细胞的物理损伤。复苏细胞采用快速融化的方法可以保证细胞外结晶在很短的时间内融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损伤。 一、细胞冻存操作要点： ⒈细胞冻存前12~24h，换新鲜培养基，使细胞一直处于对数生长期。 ⒉待细胞长至80%汇合时胰酶消化，用新鲜培养基吹打后制成细胞悬液，1000rpm离心10min。悬浮细胞则直接离心。 ⒊弃上清，加入冻存液重悬细胞沉淀，调整细胞浓度为3×106~1×107cells/mL。将细胞悬液分至冻存管内，每管1~1.5mL，拧紧盖子。在管壁上做好标记，标明细胞名称、冻存日期等。（细胞冻存液配方可为胎牛血清：培养基：DMSO=4：5：1或胎牛血清：培养基：DMSO=1：8：1或胎牛血清：DMSO=9：1，可根据各实验室实际条件调整） ⒋按下列顺序依次降温：室温→4℃ 20min→-20℃ 30min→-80℃过夜→液氮保存。也可使用程序降温盒更为方便，细胞冻存管放入程序降温盒内可直接放入-80℃过夜，再转至液氮罐内。注意程序降温盒内异丙醇的量必须高于最低刻度线；冻存5次后异丙醇需要跟换一次，以免影响冻存效果。 ⒌细胞冻存后应取出一管复苏，检测细胞的存活率。理论上细胞可在液氮内长期保存，为稳妥起见可在细胞冻存半年后复苏培养，观察细胞生长情况，再继续冻存。 二、细胞复苏操作要点： ⒈将培养基在37℃水浴锅预热；准备一个15mL无菌的离心管，加入8mL预热培养基。 ⒉将冻存细胞从液氮罐中取出，快速放入37℃水浴锅中复温（可准备一洁净的烧杯，装满37℃的水，细胞冻存管取出后迅速放入烧杯内，再逐步转移到水浴锅中）。轻轻晃动冻存管，使细胞能在1~2min内完全解冻，使细胞能尽快通过最易受损的温度段（-5~0℃）。注意
-
2table+1figure得一篇12分文章：DIA蛋白质组检测补体系统异常与精神疾病的关系
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Less is more：DIA技术，2table+1figure，得一篇12分的Molecular Psychiatry文章 Nature旗下的Molecular Psychiatry（IF=11.64）是精神疾病领域的top期刊。 在19年1月发表了一篇题为“Complement pathwaychanges at age 12 are associated with psychotic experiences at age 18 in alongitudinal population-based study: evidence for a role of stress”的文章，文中利用了DIA技术，研究补体系统与精神异常的关系。 Complement pathway changes at age 12 are associated with psychotic experiences at age 18 in a longitudinal population-based study: evidence for a role of stress IF=11.64 补体级联是免疫系统的重要组成。越来越多的证据表明，补体系统异常与精神疾病有密切关系。为了进一步证明两者之间的关系，研究者对来自于UK avon longitudinal study of parents and children (ALSPAC)队列中的血液样本，进行了DIA蛋白质组检测，重点关注其中29个补体级联相关蛋白的表达水平。结果显示，6个蛋白的表达水平与精神异常相关。利用大鼠慢性应激模型，该研究结果进一步表明：慢性应激可能引起补体通路异常，与精神异常有显著相关性。（小编：如果进一步研究一下他们的肠道菌群，可能会有更多的发现） 对于为什么采用DIA技术进行血浆蛋白质组研究，作者在文中给出了说明：DIA技术避免了非靶向蛋白质组学研究中会遇到的许多问题，比如缺失性，原文如下： 作者对于文章中图表和结果的展示采取的是“less is more”原则，2 table+1 figure，Results全文也仅有3段话： 1个table和1个figure：列出所检测的几个补体通路相关的表达水平。 虽然话少，但作者为保证数据的严谨性，特意在进行数据分析时，剔除了两个样本的信息，原因是因为该样本的色谱信息不好，原文如下： 跟本平台一样，对DIA的数据有着严格的质控，色谱的评价是非常重要的，但是却被大家所忽视（中科新生命的DIA数据从3个维度评
-
《Cell》重磅！全转录组测序技术揭示circRNA新的调控机制！
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
2月7日，加拿大多伦多大学的Paul C. Boutros教授和Housheng Hansen He教授团队对144例前列腺癌样本进行全转录组测序，结合后续的功能机制研究，揭示了前列腺癌circRNA新的调控机制！该研究成果以题为“Widespread and Functional RNA Circularization in Localized Prostate Cancer”发表在著名学术期刊《Cell》(IF 31.4)上。接下来，就一起来看下研究人员是如何利用高通量测序技术RNA-seq和大规模shRNA文库技术揭示circRNA在局限性前列腺癌中表达特征和生物功能的。 文章导读： 前列腺癌是人类特有的疾病，在欧美是男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国前列腺癌发病率占第1位，死亡率仅次于肺癌。加拿大多伦多大学的研究者首先选取了144例有详细临床信息的前列腺癌样本，进行全转录组测序（RNA-seq），共识别鉴定了7千多个circRNA分子，经生物信息学分析显示，这些circRNA的表达特征与前列腺癌侵袭转移特性密切关联，随后采用大规模shRNA文库技术进行敲除验证，发现其中约11.3% circRNA是前列腺癌细胞增殖特性密切相关，并且这些circRNA来源基因的线性转录本不影响细胞增殖，表明circRNA特殊的功能。最后研究人员重点关注前列腺癌显著相关的circCSNK1G3，揭示circCSNK1G3可以与miR-181相互作用调控细胞增殖发挥，有别于现阶段研究较多的circRNA海绵机制，该circRNA在前列腺癌中稳定了miR-181的活性，这一发现提供了circRNA全新的研究思路。 研究内容： 1. 局限性前列腺癌的表达谱分析 作者通过全转录组测序（云序生物提供此项服务）技术，对144例前列腺癌标本进行转录组分析，以图片的形式展示总RNAs (n=38,359) 和高丰度技术，对144例前列腺癌标本进行转录组分析，以图片的形式展示总RNAs (n=38,359) 和高丰度RNAs (n=18,152)在各样本中的分布，并且对每个样本中高丰度的RNA进行聚类分析，以展示个样本间的差异。通过融合基因分析，大量的融合基因转录本被识别，超过10%的SU2C转移性转录组发现复发融合，揭示了融合基
-
国自然冲刺：打通菌群多样性与功能的研究策略
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
近几年，肠道微生物可以说是最热的研究热点，频繁登上在CNS期刊的封面，不仅相关主题的学术论文表现强势，而且国自然资助的肠道微生物项目数也呈显著增长的趋势，其中2018年一共资助了近180项研究，资助金额高达7600万。由此可见肠道微生物一直是科研领域的研究热点，相信2019年肠道微生物仍是国自然申请的热点。总之，紧跟这个热点，不仅容易发文、发好文，申请基金也更加容易。 现有常用研究策略的不足 16S测序或宏基因是最常用的肠道微生物研究手段，主要侧重研究肠道微生物的多样性与生理、疾病之间的相关性。尽管这样的研究方法能够有助于了解生物过程中的菌群迁移情况以及找出潜在的参与疾病发生的菌株，在此基础上可进一步借助动物模型采用粪便移植或者特定菌株的灌胃实验等技术，可以相对直接地揭示肠道微生物或特定菌株与疾病之间的因果关系，但是对菌的功能与作用机制却知之甚少，也就是说仅仅采用16S测序或宏基因测序难以实现对菌群功能的探究。因此，从国自然申请标书的研究方案完整性与创新性上来看，这是需要大家关注的问题。 肠道菌群功能研究的切入点 目前大量研究发现肠道微生物对食物或外源性物质代谢过程中产生的一些小分子是有功能和活性的，如SCFAs，胆汁酸，TMA/TMAO，神经递质，氨基酸等物质对肠上皮组织乃至整个机体的物质代谢、免疫调节以及中枢神经系统的调节发挥着重要的作用。肠道菌群正是通过这些活性小分子与宿主进行相互作用的。因此为了更好的理解肠道微生物-宿主之间的相互作用关系，不仅需要了解肠道菌群的多样性变化，还需要进一步研究肠道菌群功能的变化，即对肠道菌群代谢产物的变化进行研究。所以如果从代谢物作为菌群功能研究的切入角度，相信会给申请国自然的项目的完整性、创新性加分不少。 打通多样性+功能的研究策略——16S+代谢组 菌群的多样性分析最常用的方法是采用16S rDNA扩增子测序方法（以下简称16S），其低成本快速高效，且方法成熟。而菌群功能则可以通过代
-
在线分析仪器的定义和分类
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
成都久尹科技自主研发生产的在线分析仪器有：在线氧分析仪、在线湿度分析仪、在线防爆氧分析仪、在线露点分析仪、在线微量氧分析仪、在线高含量氧分析仪，在线氧气浓度检测仪、在线氧气监测仪、在线湿度仪、在线烟气湿度仪、在线烟气水分仪、在线烟气水分测定仪等等种类繁多那么该如何选型？答案就在成都久尹科技，本公司为您提供全套技术方案帮您解忧！本文将详细介绍在线分析仪器的定义和分类 1.1在线分析仪器的定义 在线分析仪器（on-line analyzers）又称过程分析仪器（process analyzers），是指直接安装在工业生产流程或其他源流体现场，又被测介质的组成成分或物性参数进行自动连续测量的一类仪器。在线分析仪器不仅广泛应用于工业生产实时分析，在环境质量和污染源排放连续监测中，也有广阔的应用前景。 1.2在线分析仪器的分类 分析仪器的种类繁多，用途各异，分析方法的发展迅速，现有的分析方法已达200多种，从不同的角度出发可以有不同的分类方法。 按照测量原理和分析方法，可以把在线分析仪器大略地分为如下几类。 （1）光学分析仪器 包括采用吸收光谱法的红外线气体分析器、近红外光谱仪、紫外-可见分光光度计、激光气体分析仪等；采用发射光谱法的化学发光法、紫外荧光法分析仪等。 （2）电化学分析仪器 包括采用电位、电导、电流分析法的各种电化学分析仪器，如PH计、电导仪、氧化锆氧分析器、燃料电池式氧分析器、电化学式有毒性气体检测器等。 （3）色谱分析仪器 采用色谱柱和检测器对混合流体先分离、后检测的定性、定量分析方法叫做色谱分析法。与其他分析仪器相区别的显著特点，是它采用了色谱分离技术，由于使用量较大，所以单独划为一类。 （4）物性分析仪器 在分析仪器中，把定量检测物质物理性质的一类仪器叫做物性分析仪器。物性分析仪器按其检测对象来分类和命名，如水分仪、湿度计、密度计、黏度计、浊度计以及石油产品物性分析仪器等。鉴于石油产品物性分析仪器的多样性与
-
多肽合成方法及难题解决
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
多肽合成方法是把不同的或相同的多个氨基酸按指定顺序连结起来构成肽链(含多个肽键-CONH-)化合物的合成方法。由德国化学家费舍尔(E.Fischer)所首创。 进行多肽合成，必须首先解决两个问题： 1.要将氨基酸两个官能团中的一个(通常选氨基)封闭，即用保护基团保护起来，只让没被保护的那个基团(羧基)去同另一个氨基酸分子反应。采用的保护基团不仅要易于同被保护基团发生反应，还须在肽键形成后易去除。 2.要活化没被封闭的官能团，使之能在较温和的条件下发生反应。可作为氨基保护试剂的有氯甲酸苄酯和叔丁氧甲酰氯等，用来活化羧基的方法则是将羧基变成酰氯、酯、混合酸酐等衍生物或加缩合剂(失水剂)二环已基碳酰二亚胺，使氨基和羧基结合起来。 1962年梅瑞费尔德(R.Merrifield)引入了一个新的多肽合成方法——固相多肽合成法。其原理是让第一个氨基酸附在一种不溶性高聚物分子上，然后再逐一同别的氨基酸连结，增长的肽链连结在不溶性高聚物上，这样可大大地减少每次分离操作的损失，简化提纯手续，省去纯化个别中间体的麻烦。并能使加料处理机械化和自动化，缩短了多肽合成周期。当完成多肽连接后，用还原性断裂法把多肽同高聚物分离，再用色层法提纯。固相法的建立和应用大大地促进了多肽合成研究。 多肽合成方法分类 多肽的合成主要分为两条途径:化学合成多肽和生物合成多肽。 化学合成主要是以氨基酸与氨基酸之间缩合的形式来进行。在合成含有特定顺序的多肽时，由于多肽合成原料中含有官能度大于2的氨基酸单体，多肽合成时应将不需要反应的基团暂时保护起来，方可进行成肽反应，这样保证了多肽合成目标产物的定向性。多肽的化学合成又分为液相合成和固相合成。 多肽液相合成主要分为逐步合成和片段组合两种策略。逐步合成简洁迅速，可用于各种生物活性多肽片段的合成。片段组合法主要包括天然化学连接和施陶丁格连接。近年，多肽液相片段合成法发展迅速，在多肽和蛋白质合成领域已取得了重大突破。在多肽片段合成
-
【Sci Rep IF5.228】iTRAQ技术研究植物胁迫
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Comparativeproteomic analysis of the shoot apical meristem in maize between aZmCCT-associated near-isogenic line and its recurrent parent. 文献来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27468931 研究背景：ZmCCT，是影响植物光周期反应非常重要的一个基因。对于玉米而言，长期光照会延迟其开花的时间。本篇文章是在蛋白质组学层面探讨一下玉米种光照周期性的分子机制。 样本来源：顶端分生组织（SAM），来源于ZmCCT-positive株系NIL-cml vs. ZmCCT-negative株系H4 技术路线：iTRAQ，三个生物学重复 研究结果: 1. 共鉴定出5259个蛋白质，386个差异蛋白质。这些差异蛋白与能源产生、光合作用、信号转导、抗压和防御、糖代谢、蛋白质代谢功能有关，也包含一些未知功能的蛋白。 鉴定蛋白质的GO功能分析 差异蛋白质的Venn图 2. 在长日照条件下，与H4株系正常的营养生长和生殖生长相比， NIL-cml株系推迟了营养生长和生殖生长。 营养生长状态到生殖状态蛋白表达分析 3. 挑选出52个差异蛋白（由ZmCCT直接或间接诱导，与碳水化合物代谢、信号转导、防御反应等功能相关）进行蛋白互作分析。 4. 蛋白层面进行验证。挑选出3个蛋白，进行WB验证。 5. 从转录层面进行研究。挑选出6个代表性基因：histone H2B，ribonucleoprotein A，glycine-rich RNA-binding protein，calmodulin-bindingprotein，malate synthase，14-3-3protein进行qPCR分析。 qPCR检测结果显示，H4株系中（V3-V6阶段）ZmCCT基因表达水平较NIL-cml株系低。同时发现蛋白层面和mRNA层面的表达模式并不完全一致，说明这些蛋白可能存在转录后修饰。 小编心得：本篇是一类很典型的利用蛋白质组学技术（iTRAQ）发表在Scientific Report上的文献，研究不同胁迫条件下植物组织在蛋白质层面的表达，通过目前常见的一系列生信分析（GO、聚类、互作）以及验证手段（WB，qPCR）获取可信度较高的特异性（或目标性）蛋白质，为进一
-
[MCP 5.912] 临床皮肤病的蛋白质组学研究——牛皮癣
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Proteomics of skin proteins in psoriasis: from discovery and verification in a mouse model to confirmation in humans. KC Lundberg,Y Fritz.Molecular & Cellular Proteomics,2015,14(1):109-119 文献来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25351201 研究背景：皮肤病是一种非常常见的慢性病，尤其统计发现，约2-3%的人群会患上牛皮癣这种由免疫反应介导的炎症性皮肤病，给病人的工作和生活带来极大的困扰。有研究证明，牛皮癣与抗原特异性的T淋巴细胞有关，但是参与其中的抗原并不为人所知。 样本来源：KC-Tie2牛皮癣小鼠模型 研究方法：基于LC MS/MS的Gel-Label free差异蛋白质组学 验证方法：qPCR，基于LC-MS/MS的Solution-Label-free（同样的蛋白经过两次label-free结果，倍数有所不同哦，大家可以学习一下如果遇到这种情况时，应该如何挑选结果） 研究结果： 1.筛选出模型鼠和正常鼠皮肤样本间的蛋白组变化情况。 Workflow summaries for the gel based label-free discovery and verification of target proteins approaches. 2. 利用RT-PCR，在mRNA水平对几个重点关注的差异蛋白质：Serpinb3b,KLK6,StefinA1,Slc25a5,Rab18等，进行了表达量的检测，发现差异具有显著性。 Candidate molecules identified from the gel-based label-free expression experiments are verified at the RNA level in control and KC-Tie2 mouse skin using qRT-PCR. 3. 利用临床上牛皮癣病人和正常人的皮肤样本（未展示），包括最初的角质细胞（见下图），对几个差异蛋白进行了表达差异的确证。 Human psoriatic keratinocytes express higher levels of candidate gene transcripts compared with healthy control keratinocytes. 4. 最后利用免疫组织化学的方法，对几个差异蛋白在组织内的分布情况进行了检测，进一步确定了差异的存在。 Candidate proteins identified from gel-based label-f
-
一种新型细胞划痕实验方法的简要介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一.传统细胞迁移实验技术—划痕实验 1.基本原理 细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上， 用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。 实验材料 细胞样品 试剂、试剂盒 无血清培养基 PBS 仪器、耗材 6孔板 maker笔 直尺 枪头 实验步骤 准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔等在操作前，需紫外照射30min（超净台内） 流程 1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2.在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。 4.用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。 2、操作步骤 （1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 （2）在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。 （3）第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间**使用同一只枪头)。 （4）PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 （5）放入37℃ 5% CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样
-
大分子量蛋白转印的5个技巧
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
做western blot印迹膜时，较大的蛋白质众所周知是难以处理的。 特别是，您可能很难实现良好的转印效率。 在某些方面，蛋白质难以朝着你想要的方向前进。 我们将给5点建议，帮助胶上大分子量蛋白的转印。 01 牺牲胶的韧性来提高效率 低浓度的丙烯酰胺凝胶可能难以操作。一旦手指触摸它就会撕裂？ 但是，与高浓度的凝胶相比，大蛋白将更有效地从较低浓度的凝胶中移出（分辨率更好）。因此，提高你的灵活性和耐心，尝试6-7.5％的凝胶。 或者可以尝试使用梯度凝胶，可以同时分辨小分子量和大分子量蛋白质。 02 去除去垢剂 较大的蛋白质可能在凝胶中沉淀，抑制转印。 在SDS-PAGE期间添加的SDS通常会解决这个问题，但较大的蛋白质可能需要更多的SDS。 您可以在转印缓冲液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的产生。因为SDS抑制蛋白质与膜的结合，因此请尝试从低浓度的SDS开始（例如0.0375％），然后逐步提高。 如果确实在转印缓冲液中添加了SDS，则需要重新优化其他转印条件，如转印时间和电流，以防止蛋白透过膜。 03 降低甲醇浓度 甲醇与SDS具有相反的作用。 虽然甲醇增加蛋白与膜的结合，但它从蛋白质中剥离SDS。 因此，降低转印缓冲液中的甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。 您可以将浓度降低到10％或更低。 如果您使用的是PVDF膜，则可以完全省去甲醇。 在使用之前，不要忘记用甲醇将膜激活！ 甲醇也会导致凝胶收缩，所以如果减少甲醇，你的凝胶会膨胀得更多。 这也有助于转移大分子量蛋白。 但您可能需要使用比正常情况稍大的滤纸和膜。 04 慢速转印大分子量蛋白 大分子量蛋白想要获得良好的转移效率可能需要更多时间。 快速移动那些大分子可能很困难。 尝试以较低的电压过夜转印。 只是不要忘记保持转印要在低温环境！ 05 使用湿转 虽然半干转印可能更适合设置并且需要较少的缓冲液，但它确实有其缺点。 半干转印通常比湿转移效率低，并且不能增加转印时间以适应更大的蛋白。 转移大蛋白时**坚持使用湿转
-
如何避免进口ELISA检测试剂盒出现假阳性的现象
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
进口ELISA检测试剂盒出现假阳性的现象一般是与错误的操作有关 进口ELISA检测试剂盒出现假阳性的现象一般是与错误的操作有关，本文与大家聊一聊如何避免假阳性现象。 1、加样 对于间接进口ELISA检测试剂盒标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的绝对误差，会导致较大的相对误差，使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。 2、洗涤 在进口ELISA检测试剂盒中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 3、 温育 每种试剂都有其*合适的反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。 4、酶标仪判读 作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，使用双波长，一个检测波长，一个参比波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外，在用酶标仪读数时先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书 由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化，尽管目前上以及我国有了部分标准血清或参比血清（血清盘）。但由于受方法学及技术条件的限制，在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性，但我们可以通过以上
-
C57/BL6 小鼠中的竞争性骨髓移植实验简述
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
造血干细胞 (HSC) 能够分化形成血液系统的全部细胞，是维持血液系统所必需的细胞。造血干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新的能力，并能够通过层次过程生成各种血细胞系统的中期细胞，从而再生成机体血细胞。 为研究干细胞龛，研究人员必须能够确定在受控条件下细胞群生成成体细胞系统的能力。实验中采用的典型策略是将富含 HSC 的骨髓移植到受体小鼠血液系统之中，而受体小鼠的血液系统经亚致死剂量照射后人为清除。在这些小鼠中，成体血细胞以及干细胞、前体细胞均将在 照射 2 周后死亡。经过移植的细胞可以分化新的血液系统，从而解救小鼠。HSC 可基于其短期 (ST- HSC)、长期 (LT-HSC) 以及中期 (IT- HSC) 重建能力实现再次分裂 。在大多数报告中，研究人员确定 LT-HSC 的方式是：在移植术后 16-44 周的不同时间点，对其生成循环单核细胞、粒细胞和淋巴细胞的能力进行测定。对移植后细胞进行的第一次竞争性分析应在移植术后 4-6 周予以完成。 在移植研究中，通常采用野生型近交 C57/BL6 小鼠，但前提是：这些小鼠携带Ptprcb 白细胞标记 (CD45.2/Ly5.2) 等位基因。Sloan Kettering 研究所 通过回交 SJL 小鼠与野生型 C57/BL6 小鼠的方式，培养出了一种被称为 C57BL/6-Ly5.1 的同类品系小鼠。这些小鼠携带 Ptprcb 白细胞标记 (CD45.1/Ly5.1) 等位基因。使用常用的抗 CD45.1 和 CD45.2抗体，研究人员可以轻松鉴定宿主和移植细胞，并确定 HSC 在竞争性实验中发挥的作用。 在本文中，我们概括性地描述了一项简单的实验，这项实验的具体内容是：对经照射小鼠进行移植后，对其外周血中Cd45.2- 供体与 CD45.1- 宿主白细胞进行测定。
咨询热线
18133906270
德尔塔官方微信