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大豆分离蛋白的提取方法（借鉴）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、大豆分离蛋白的提取方法简介 大豆的蛋白含量较高而且营养丰富，一般含蛋白30%——50%。大豆蛋白含有8种人体必需氨基酸，且比例比较合理，只是赖氨酸相对稍高，而蛋氨酸和半胱氨酸含量较低。目前大豆蛋白已成为一种重要的蛋白资源，特别是大豆分离蛋白含蛋白质90%以上，是一种优良的食品原料。 大豆分离蛋白主要由11S球蛋白（Glycinin）和7S球蛋白（β-con-glycinin）组成，大约占整个大豆籽粒贮存蛋白的70%。这两种球蛋白的组成、结构和构象不同，大豆分离蛋白的功能特性也不同。大豆分离蛋白在提取、加工和贮运过程中会发生物理和化学变化，这些适当的改变可以提高大豆蛋白在食品中应用的功能特性。 二，大豆分离蛋白的提取方法 2.1 大豆分离蛋白的提取碱提酸沉法 大豆分离蛋白的传统提取方法是碱提酸沉法。将脱脂豆粕与蒸馏水以1:10的比例混合，用NaOH调整混合物的pH为7——9，充分搅拌浸提碱溶大豆蛋白，离心分离，用稀HCI调整上清液的pH值为4.5— —4.8，沉淀出蛋白质，离心分离，沉淀重新溶于pH7.0——8.0的NaOH溶液中，喷雾或冷冻干燥即得大豆分离蛋白，其蛋白含量可达90%以上，得率24%—— 38%。 2.2 大豆分离蛋白的提取膜分离方法 聂幼华等研究了用膜分离技术制取大豆分离蛋白。先用Ca(OH)2的稀溶液浸提脱脂大豆粕，蛋白浸出率可达80%左右。将浸提液进行循环超滤分离，截留液的浓度可达13%左右。把截留液喷雾或冷冻干燥，即得大豆分离蛋白产品，其蛋白含量可达95%以上。与传统的碱提酸沉法比较，产物得率高，质量好，能耗少，废水排放污染也一定程度上得到解决。 2.3 大豆分离蛋白的提取双极膜电解法（Bipolar Membrane Electroacidification） 这种方法是在电渗析的基础上发展而来的。双极膜由3层组成：阴离子交换膜和阳离子交换膜以及阴阳离子交换膜中间的亲水层。在电流作用下，水分子在双极膜上电离为H+和OH-，由于膜选择透过阴离子或阳离子，导致溶液的pH值降低，达到大豆蛋白质的等电点而使蛋白质沉淀。这种方
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TUNEL法检测细胞凋亡（实验简介,实验步骤,所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、TUNEL法检测细胞凋亡实验简介 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA的断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。由此，TUNEL成为了检测DNA片段化（细胞凋亡）的最常用方法。 二、TUNEL法检测细胞凋亡实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、蛋白酶K、苏木素、甲基绿、甘油 三、TUNEL法检测细胞凋亡实验步骤 1.用二甲苯浸洗2次，每次5min； 2.用梯度乙醇（100、95、90、80、70％）各浸洗1次，每次3min； 3.PBS漂洗2次； 4.用蛋白酶K工作液处理组织15-30 min 在21–37°C或者加细胞通透液8min； 5.PBS漂洗2次； 6.制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT＋450μl 荧光素标记的dUTP液混匀；而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在室温～37℃×10～30min，后面步骤同处理组。 7. 玻片干后，加50μl TUNEL反应混合液（阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液）于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×60min。 8.PBS漂洗3次； 9.可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞（激发光波长为450～500nm，检测波长为515～565nm） 10.玻片干后加50μl converter-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。 11.PBS漂洗3次； 12.在组织处加50～100μlDAB底物，反应15～25℃×10min； 13.PBS漂洗3次； 14.拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。 15.加一滴PBS或甘油在视野下，用光学显微镜进行计数并拍照。 四、TUNEL法检测细胞凋亡
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SP法做免疫组化实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、SP法做免疫组化实验简介 SP法，即链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法。 按标记物质的种类，如荧光染料、放射性同位素、酶（主要有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶）、铁蛋白、胶体金等，可分为免疫荧光法、放射免疫法、酶标法和免疫金银法等。按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接法（二步、三步或多步法）；按结合方式可分为抗原-抗体结合，如过氧化物酶-抗过氧化物酶（PAP）法和亲和连接，如卵白素-生物素-过氧化物酶复合物（ABC）法、链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等，其中SP法是最常使用的方法。 二、实验所需材料 二甲苯、乙醇、PBS、0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）、苏木素 三、实验步骤 1、烤片，68℃，20分钟 2、常规二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水；二甲苯20min⇒二甲苯20min⇒100%酒精10min⇒100%酒精10min⇒95%酒精5min⇒80%酒精5min⇒70%酒精5min 3、阻断灭活内源性过氧化物酶：3%H2O237℃孵育10min，PBS冲洗3X5min； 4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温，PBS冲洗3X5min。 5、正常羊血清工作液封闭，37℃10min，倾去勿洗。 6、滴加一抗4℃冰箱孵育过夜，PBS冲洗3X5min（用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照）； 滴加生物素标记二抗，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min； 7、滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS冲洗3X5min； 8、DAB/H2O2反应染色，自来水充分冲洗后，苏木素复染，常规脱水，透明，干燥，封片。 四、实验所需试剂清单 序号 产品名 货号 CAS 备注 1 PBS缓冲液 HC2031 2 乙醇 JT26000 64-17-5 3 二甲苯 JT24017 1330-20-7 4 苏木精 SX0217 517-28-2 5 枸橼酸盐缓冲液 HC1486
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凝胶迁移（实验简介,实验原理,实验操作步骤，所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
凝胶迁移实验简介 凝胶迁移实验有称凝胶阻滞实验或电泳迁移率实验（EMS electrophoretic mobility shift assay），是一种用于蛋白与核算相互作用的技术。最初是用于转录因子与启动子相互作用的验证性实验，也可应用与蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。 一、凝胶迁移实验原理 EMSA主要基于蛋白-探针复合物在在凝胶电泳过程中迁移较慢的原理。根据实验设计特异性和非特异性探针，当核酸探针与样本蛋白混合孵育时，样本中可以与核酸探针结合的蛋白质与探针形成蛋白-探针复合物；这种复合物由于分子量大，在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时迁移较慢，而没有结合蛋白的探针则较快；孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后，蛋白-探针复合物会在膜靠前的位置形成一条带，说明有蛋白与目标探针发送互作。 二、凝胶迁移实验操作步骤 1、实验前准备 （1）合理的实验方案：根据研究目的合理设计特异性探针实验组以及非特异性探针对照组，如有必要还可以添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等 （2）样本制备 可以选择提取样本的总蛋白、核蛋白或者使用纯化好的目的蛋白。对样本蛋白进行定量，实验中等量加入蛋白。 （3）探针制备 根据实验要求设计不同的探针并添加标记，可以合成核酸后自行添加，部分已知蛋白有商业化的抗体也可以直接购买。现在大多数实验室已经不再使用放射性标记，生物素使用相对较多。 三、实验所需的试剂列表 序列 产品名 货号 CAS号 备注 1 TEMED HC1303 2 Binding Buffer JT2113 7786-30-3 3 Agarose SF0014 9012-36-6 4 TBE FMK19848 936475-62-6 5 1000ul蓝吸头 FT-1000 6 200ul黄吸头 FT-200 7 2ml圆底连盖离心 F-EP020 8 96孔无裙边PCR板，透明（灭菌） F-PCR-96W-H
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Western(实验简介,实验所需材料及试剂,实验步骤,注意事项)
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、Western实验简介： Western是用于蛋白质分析的常规技术，在电场的作用下，通过电泳分离的蛋白质从凝胶转移到固体支持物上，然后使用抗原-抗体特异性反应从蛋白质混合物中检测出来，靶蛋白，用于在正常或实验条件下定量或定性确定靶蛋白在细胞或组织中的表达，Western印迹法还可用于蛋白质-蛋白质，蛋白质-DNA和蛋白质-RNA相互作用的后续分析，作为廉价，方便，可靠的研究工具，它将与蛋白质组学和质谱技术等技术一起在蛋白质组学时代起重要作用。 影响免疫印迹成功的主要因素是抗体识别的抗原分子中表位的性质，由于抗原样品的变性，只有那些识别耐受性表位的抗体才能与抗原结合，大多数多克隆抗体或多或少都包含此类抗体，因此多克隆抗体通常用于免疫印迹，第二个影响因素是蛋白质储液中抗原的浓度，在免疫印迹之前，需要通过免疫沉淀和亚细胞分离来富集一些低表达水平的蛋白质。 二、Western实验所需材料及试剂： 丙烯酰胺、SDS凝胶上样缓冲液、培养皿、双丙烯酰胺、SDS-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE） 三、Western实验步骤 （一）、样品制备 对于Western Blotting实验，样品处理是关键步骤之一，获得的蛋白质样品必须是均质的，可溶的并解离为单个多肽亚基，并且必须使彼此之间的聚集最小化，从而使其最终取决于自身的分子量，当靶蛋白的含量非常低时，有必要选择靶蛋白含量高的组织或细胞器（例如核提取物），或通过免疫沉淀富集，通常样品包括重组蛋白，细胞和组织。 1.样品采集 1）培养细胞 收集粘附细胞和悬浮细胞的方法不同，细胞裂解物的类型也不同。建议裂解含SDS的凝胶上样缓冲液并煮沸。 2）动物组织 与细胞不同，组织块由于体积大而必须预先压碎并匀浆。 2.样品定量 电泳前需要确定蛋白浓度，以确保样品体积一致，这有利于后续的定量或半定量分析。有许多常用的测量蛋白质浓度的方法。它们的灵敏度和所需时间不同，并且不同的干扰物质会影响不同的方法。实验者可以根据样品的制备方法（裂解液组成，去污
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液相色谱柱的清洗
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、液相色谱柱的清洗简介： 迄今为止，反相色谱法是高效液相色谱法中使用最广泛的技术，主要是因为它适用于分析大多数非极性物质以及许多可电离和离子化的化合物，使用反相方法时，必须考虑可能的基质相互作用，当色谱柱被污染时，其色谱行为将与未污染的色谱柱略有不同，污染的色谱柱会产生反压问题。 必须清洁并重建被污染的反相色谱柱，以恢复原始操作条件，通常，样本中包含分析师不感兴趣的内容，盐，脂质，含脂质的物质，腐殖酸，疏水性蛋白质和其他生物物质是一些在使用过程中可能与HPLC色谱柱相互作用的物质，这些物质的保留值小于或等于分析人员的目标。 二、液相色谱柱的清洗所需材料及试剂： 甲醇、氯乙烷、四氢呋喃 三、液相色谱柱的清洗步骤 再生受污染的HPLC色谱柱的关键是了解污染物的性质并找到合适的溶剂进行去除。如果在重复进样过程中由于强保留物质的积累引起污染，则使用简单的步骤去除这些污染物通常可以恢复其色谱行为。有时，在多次操作后，会用90％到100％的溶剂B（双溶剂反相系统中的较强溶剂）冲洗色谱柱，以冲洗20体积以除去污染物。 例如，塔中剩余的脂质可与非水溶剂（如甲醇，氯乙烷和四氢呋喃）一起使用。 四、液相色谱柱的清洗注意事项： 如果使用缓冲液系统，请勿直接切换到强溶剂，突然切换到高浓度有机溶剂可能会使HPLC流动系统中的缓冲液沉淀，这可能引起更大的问题，例如柱头堵塞，管道堵塞和泵堵塞，泄漏，活塞损坏或喷射阀轴故障，应首先使用无缓冲流动相（即，将缓冲液更改为水），冲洗5至10体积后，更换强溶剂。 五、实验所需试剂清单： 1 甲醇 JT25999 2 氯乙烷 LSH57971 3 四氢呋喃 JT11423
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ABO血型鉴定方法
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原理： 血型（blood group）就是红细胞上特异抗原的类型。在ABO血型系统，根据红细胞膜上是否含有A、B抗原而分为A、B、AB、O型。血型鉴定是将受试者的红细胞加入标准A型血清（standard serum A）（含足量的抗B抗体）与标准B型血清（standard serum B）（含足量的抗A抗体）中，观察有无凝集现象，从而测知受试者红细胞上有无A或／和B抗原。 交叉配血（cross-match test）是将受血者的红细胞与血清分别同供血者的血清与红细胞混合，观察有无凝集现象。为确保输血的安全，在血型鉴定后必须再进行交叉配血，如无凝集现象，方可进行输血。若稍有差错，就会影响受血者的生命安全，千万不可粗心大意。 二、实验材料与试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 碘酒 7553-56-2 JH0093 2 生理盐水 7732-18-5 FS0033 3 乙醇(95%) 64-17-5 JT26000 人;显微镜、 离心机、采血针、玻片、滴管、1ml吸管、小试管、 试管架、牙签、消毒注射器及针头、碘酒、棉球、消毒棉签;标准A、B型血清、生理盐水、75％酒精。 三、实验步骤 1.玻片法 （1）将标准A型与B型 血清 各一滴，滴在玻片的两侧，分别标明A与B。 （2）用75％酒精棉球消毒左手无名指端，用消毒采血针刺破皮肤。滴1滴血于盛有 lml生理盐水的小 试管 中，混均制成红细胞悬液（浓度约5％）。 （3）用滴管吸取红细胞悬液，分别滴一滴于玻片两侧的血清上，用两支牙签分别混匀（注意严防两种血清接触）。 （4）15分钟后用肉眼观察有无凝集现象。根据图40判定血型。 2. 试管法 取小试管 2支，分别标明 A、B字样。分别加入A、B型标准血清与受试者的红细胞悬液各1滴，混匀后离心1分钟（100转/min）。取出试管后用手指轻弹试管底，使沉淀物被弹起，在良好的光源下观察结果。轻弹管底时，若沉淀物成团漂起，表示发生凝集现象，若沉淀物边缘呈烟雾状逐渐上升，最后使试管内液恢复红
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PCR法检测支原体实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、PCR法检测支原体实验介绍 PCR法是20世纪80年代中期建立起来的一种体外DNA扩增技术，其基本原理是酶促DNA合成反应，即在DNA模板、引物和脱氧核糖核酸存在下，经DNA聚合酶的作用，使DNA 链扩增延伸。该方法具有灵敏度高、特异性强、快速的特点，但其对实验环境的要求严格，实验成本较高，有时还有假阳性的现象出现。 二、PCR法检测支原体实验仪器设备与试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 dNTP 2 TapDNA聚合酶 9012-90-2 SS1358 3 AMV/MMuLV反应缓冲液 HC1315 4 琼脂糖 9012-36-6 SF0012 5 矿物油 8020-83-5 SF0015 6 去离子水 7732-18-5 SS1456 7 0.5ml离心管 F-EP005 超净工作台、PCR仪、电泳仪、凝胶成像分析系统、台式离心机、旋涡混悬器等。 选用美国Stratagene公司生产的支原体检测试剂盒（内有引物、阳性对照、内对照、StrataClean resin、缓冲液），dNTP，TapDNA聚合酶，缓冲液，琼脂糖，矿物油。 三、PCR法检测支原体实验操作 PCR反应的前期操作应在无菌环境中进行。 （1）样品的收集：待测细胞用无双抗培养基培养7d，用无菌容器取上清液500ul，4℃保存待测。 （2）模板的制作：在无菌的条件下，取细胞培养上清100ul于一无菌的0.5ml塑料离心管内，盖好盖子，95℃水浴加热5min。 （3）打开盖子，向管内加StrataClean resin10ul，盖好盖子，旋涡混悬器混合，离心5—10s，吸取上清至一新的塑料离心管中，模板制作完毕，4℃保存。 （4）PCR反应：反应体系最适条件为：10mmol/lTris-HCL（pH8.38）；50mmol/lHCL；1.5-2.5mmol/lMgCL2；200umol/ldNTP；2UDapDNA聚合酶。总反应体系为50ul，反应用去离子水均需用12000uw/cm2紫外灯照射。反应如下表： 程序 循环 温度/℃ 时间/min
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测定苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）的活性
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原则 苯丙氨酸氨裂合酶（PAL）催化苯丙氨酸的脱氨基反应，使NH 3释放形成反式肉桂酸。该酶在植物次生生物质（如木质素等）的代谢中起重要作用。根据其产品，反式肉桂酸在290 nm处的吸光度变化可以确定酶的活性。 二、实验材料，仪器和试剂 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 硼酸 10043-35-3 JT0008 2 四硼酸钠 1330-43-4 JT0599 3 苯丙氨酸 PYJH50891 4 胆固醇 57-88-5 JT0008 5 巯基乙醇 60-24-2 JT27316 6 聚乙烯吡咯烷酮 9003-39-8 CG0277 7 石英砂 14808-60-7 JT0062 8 乙醇 64-17-5 JT26000 （1）材料：马铃薯块茎 （2）设备：1.紫外分光光度计； 2.离心机； 3.砂浆； 4.吸滤瓶； 5.红灯装置； 6.打孔器。 （3）试剂：1. 0.05mol / L硼酸盐缓冲溶液（pH8.8）； 2. 0.02mol / L苯丙氨酸（用0.1mol / L pH8.8硼酸缓冲液制备）； 3. 5mmol / L胆固醇基硼酸乙醇缓冲液。 三、实验步骤 1.准备马铃薯薄片洗净马铃薯块茎，将其削皮，用冲头（直径1.5cm）取下圆柱体，切掉表皮附近的两端，将中间部分切成2mm厚的圆盘。首先用自来水冲洗，用蒸馏水冲洗一次，然后用纱布吸干表面。 2.光感应：将光盘放在装有湿滤纸的培养皿中，并在20?30℃的红光下放置24小时以诱导PAL（也可以接种病原体的感应）。 3.粗制酶提取物5g土豆片经诱导处理，再加10ml含5mmol / L巯基乙醇的硼酸缓冲液，0.5g聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或PolyclarAT（去除酚类中毒，防止颜色干扰，研磨少量石英砂）通过抽吸过滤匀浆，以10,000rpm离心15分钟，上清液为粗酶提取物，在0?4℃下进行上述操作。 4.活性测定与计算1ml酶溶液加1ml 0.02mol / L苯丙氨酸，2ml蒸馏水，总体积为4ml。作为对照，不加入底物，并加入1ml蒸馏水。将反应
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病毒斑实验知识解答
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验介绍： 问：我要进行病毒斑块实验。我不知道如何配置甲基纤维素以覆盖培养基。 答：1.我这样做： 二、实验步骤 序号 产品 CAS号 货号 备注 1 甲基纤维素 9004-67-5 HC1131 2 甲醛 100-52-7 JT12059 3 结晶紫 548-62-9 SX0037 4 碘液 7553-56-2 HC0408 5 乙醇95% 64-17-5 JT26000 6 中性红 553-24-2 FF0018 7 琼脂 9002-18-0 SW0006 24孔板VERO，HSV1 1）24孔板预板 2）24小时后，弃去培养液，并用汉克斯溶液清洗一次 3）接种病毒溶液0.1ml /孔 4）放入37度5％CO2培养箱中1h，在此期间每15分钟缓慢摇动以充分吸收病毒 5）加入1％甲基纤维素（1ml /）覆盖培养基，将其放入37度5％CO2培养箱中以继续培养 6）3天后，吸出培养基 7）加入5％甲醛1ml /孔4min，弃去甲醛，加入结晶紫0.8ml /孔染色20min 8）用自来水缓冲液洗涤缓冲液以计算孔点的数量 2.我的老师也使用甲基纤维素进行菌斑测试，但浓度为2％。配置方法为：甲基纤维素：3克溶于150ml蒸馏水中，终浓度为2％;染色用碘溶液：将25g溶于500ml 95％乙醇。最终浓度为5％非常好。但是，甲基纤维素应预先放置较长时间，约2周，高压后放入冰箱，使用前请无菌添加培养液，混入冰箱中，一天后取出，剧烈摇动。 ，使纤维素食主义者达到均匀状态后，静置直至起泡完全消失。可以将染色液与0.1％（w / v）中性红色培养箱孵育2-3小时。如果是6孔板，则每孔加1ml。倒数后。 三、实验遇到的问题： “ 1％甲基纤维素（1ml /）孔覆盖培养基，并将其放入37度5％CO2培养箱中以继续培养”是指将1％甲基纤维素直接添加到已放置培养基的孔中，或者甲基纤维素是否与培养基混合并添加到细胞中？配方比例是多少？甲基纤维素应提前很长时间准备，为什么要约2周？我什么时候可以数？标
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替卡格雷合成路线及中间体
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、替卡格雷合成路线简介： 替卡格雷(ticagrelor,1),化学名为(1S,2S,3R,5S)-3-[7-[(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺基]-5-(丙硫基)-3H-[1,2,3]三唑[4,5-d]嘧啶-3-基]-5-(2-羟基乙氧基)环戊烷-1,2-二醇,是一种口服选择性小分子抗凝血药,能可逆性地作用于血小板上P2Y12受体,对腺苷二磷酸(ADP)引起的血小板聚集有较强抑制作用,且口服后迅速起效,因此可明显改善急性冠心病患者的症状。本品与氯吡格雷不同,不需要通过代谢激活,自身具有抗血小板活性，除结构中五元碳环的4个手性中心外,其侧链部分还有2个手性中心需在合成中构建。 二、替卡格雷合成路线步骤 一、经由2-丙硫基-4,6-二氯-5-硝基嘧啶合成替卡格雷 2-丙硫基-4,6-二氯-5-硝基嘧啶与(1S,2R,3S,4R)2,3-O-亚异丙基-4-氨基环戊烷-1,2,3-三醇在N,N-二异丙基乙胺作用下缩合,后经铁粉/乙酸还原、亚硝酸异戍酯(i-AmONO)环合、氨化得8-氮杂腺嘌呤类衍生物，然后在丁基锂作用下与2-三氟甲磺酰氧基乙酸甲酯反应后,再经溴代、与手性中间体缩合,最后经二异丁基氢化铝(DIBALH)还原酯基、酸解脱除亚异丙基保护得替卡格雷。 二、经由硫代巴比妥酸合成替卡格雷 硫代巴比妥酸经烷基化、与对甲苯胺重氮化缩合、三氯氧磷氯化及催化氢解反应制得2-丙硫基-4,6-二氯-5-氮基密啶，在三乙胺作用下与中间体(1S,2R,3S,4R)-1-羟乙基-2,3-O-亚异丙基-4-氨基环戊烷-1,2,3-醇缩合，后经亚硝酸钠/乙酸环合得8-氮杂嘌呤类衍生物，最后与(1R,2S)-2-(3,4-二氟苯基)环丙胺经缩合、酸解脱除亚异内基保护制得替卡格雷。 三、替卡格雷合成路线杂质： 序列 产品名 货号 CAS 备注 1 Ticagrelor Impurity 103 YPZZ60774 1487958-68-8 2 Ticagrelor Impurity A (Ticagrelor Enantiomer) HCC348401 2096989-55-6 3 Ticagrelor Impurity
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DNA连接（试验简介,实验步骤,实验方法,实验所需试剂）
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、DNA连接试验简介： DNA分子的体外连接是一个生化过程，其中DNA连接酶在一定条件下催化与两个双链DNA片段基团相邻的5'-端磷酸和3'-端羟基之间的磷脂键的形成，它是基于酶消化反应获得相同酶的互补序列。 必须将具有相同末端（平末端或粘性末端）的外源DNA片段克隆到具有匹配末端的线性质粒载体中，但是在连接反应过程中，外源DNA和质粒都可以被环化，或形成串联寡聚物。因此，必须仔细调节连接反应中两个DNA的浓度以优化“正确的”连接输出量，但是碱性磷酸酶仍经常用于去除5'磷酸基团以抑制载体DNA本身。 T4 DNA连接酶用于在目标DNA片段和载体之间进行体外连接反应，即在5'磷酸双链DNA和相邻的3'胆固醇之间形成新的共价键，如果载体的两条链都带有5'磷酸（未脱磷），则可以形成4个新的磷酸二酯键；如果载体DNA已被去磷酸化，则只能形成2个新的磷酸二酯键，当时产生的重组DNA具有两个单链缺口，可将其引入感受态细胞后进行修复。 二、DNA连接试验所需材料及试剂： 1.苯酚、氯仿、TE（pH 7.6）溶液。 2.10×T4 DNA连接酶缓冲液（该缓冲液应分成小部分，并在-20°C下保存）：200mMTris-HCl（pH 7.6）；50mMMgCl2; 50mM二硫代苄糖醇。 3.500μl/ ml BSA（可用或不可用）。 4.5mMATP。 5.混凝剂：聚乙二醇、六氯化铵。 三、DNA连接试验步骤 （一）、预处理 1.将以下溶液添加到无菌的离心管中： 1）在体积为10μl的反应系统中：取50-100 ng的载体并添加一定比例的外源DNA分子（通常线性载体DNA分子与外源DNA分子的摩尔数为1：1至1 ：5）组成ddH2O至8μl。 2）轻轻混合，离心一点，然后在45°C水浴中融化重新连续的粘性末端5分钟，然后迅速将其转移到冰浴中。 3）加入1μl含ATP的10x缓冲液（T4 DNA连接酶的适当单位），并用ddH2O补足至10μl。 2.盖上管盖，混合均匀，并在台式离心机上离心五秒钟。 3.在12℃下碳化连接反应。 4.反应后储存在-20℃。 5.建立另外两个对照反应，其中仅包含（1）个质粒载体； （2）仅外源DNA片段。如果外源
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逆转录PCR实验
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
逆转录RT-PCR实验是通过将RNA反转录(RT)和cDNA聚合酶链式扩增(PCR)相结合的一种生物技术。 一、实验步骤 ①、实验器具与材料： 1、移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2μl 2、吸头：1ml、200μl、20μl 3、匀浆管：5ml 4、吸头台：放置1ml吸头的一个，放置20μl吸头的一个 5、EP管：1.5ml、0.2ml、100μl 6、试剂瓶：2个60ml的棕色试剂瓶（广口，带盖）；1个125ml的白色试剂瓶（放无水乙醇） 7、量筒：50ml、250ml、500ml 8、容量瓶：250ml、500ml、1000ml 9、试管架：5ml、1.5ml、20μl 10、盐水瓶：250ml、500ml各2个备用，一个装无水乙醇，另一个装DEPC水 11、铝制饭盒：4个 12、塑料小饭盒：1个 13、大瓷缸：2个 14、锡泊纸：一卷 15、卷纸：2卷 16、三角烧瓶：带盖，稍大 ②、实验器具的处理与准备 1、塑料制品：（包括枪头、EP管、匀浆管等） 先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中，其中小枪头需要吸管打入DEPC水，过夜，然后高压，再烤干备用，实验前将枪头等放入吸头台，再高压一次（EP管） 2、玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，蒙锡纸烤干备用（DEPC水泡）（洗净后先泡1‰DEPC过夜，再烤干） 3、匀浆器：（包括剪刀、镊子）先洗净后，再高压（不需要泡DEPC） ③、试剂配制： 1、DEPC水：吸出1ml放在1000ml双蒸水中配成1‰DEPC水，放在1000ml容量瓶中静置4小时备用。 2、75%乙醇：用无水乙醇 DEPC水配，然后放-20℃保存（其中DEPC水需先高压） 3、异丙醇：放入棕色瓶中 4、氯仿：放入棕色瓶中 5、琼脂糖 ④、几种缓冲液的配制： 1、电泳缓冲液：Tris 54g、硼酸 27.5g、0.5M EDTA 20ml pH8.0、蒸溜水 1000ml、5×TBE （贮存液）再将5×TBE稀释10倍成0.5TBE就可以在电泳时使用（即工作液浓度），如取50ml贮存液 450ml水--→500ml工作缓冲液 2、上样缓冲液： 0.25%溴酚蓝、0.25%二甲苯青FF、30%甘油、6×缓冲液，4℃保存 ⑤、琼脂糖凝胶的配制： 1、1.0%： 1.0g琼脂糖 100ml电泳缓冲液，微波炉中火30秒至沸腾，熔化的
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原位杂交技术
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、实验原理： 原位杂交技术应用于染色体、细胞和组织切片等样品中进行核酸特异性检测，与免疫组化技术的结合应用，能将DNA、mRNA和蛋白水平上的基因活性与样品的显微拓扑信息结合起来。1969年Pardue和Gall将放射性标记的探针直接应用于纯化核酸的杂交，此后得益于分子克隆技术的发展，及不同探针标记系统和检测系统的应用，大大增加了原位杂交检测的应用灵活性和检测灵敏度。 二、原位杂交检测步骤： 1. 玻片的准备和样品固定 对于染色体涂片，1：1的乙醇/醚处理的载玻片已能符合要求。对于组织切片的原位杂交，为了在实验过程中不丢失组织样品，可使用多聚赖氨酸或铬矾明胶包被的载玻片。（为了保持样品的原有形态学。样品固定是原位杂交中必不可少的步骤，从化学反应角度来看，固定剂的使用和选择对后续杂交的影响不会太大，因为核酸杂交的功能分子基团被安全地包裹在DNA双螺旋结构中，而交联剂的使用对RNA基本没有影响。对于染色体涂片，常使用甲醇/醋酸溶液固定；石蜡包埋的组织切片用福尔马林固定。冷冻切片可通过在4%的甲醛溶液中国定30min。) 2. 样品预处理 ①在待测样品中，DNA或RNA通常都是被蛋白包裹缠绕，根据不同的细胞和组织样品的应用，可选择合适的预处理方法将靶核酸暴露： ②内源性酶灭活：如果探针的检测是通过酶促法进行的，则样品内相应的内源性酶必须被灭活。如内源性的POD可通过含1% H2O2的甲醛溶液处理30min。如果检测酶为AP，可在底物溶液中加入左旋咪唑，AP检测的内源性背景一般来说比POD检测的低得多，因为在杂交过程中，样品中内源性AP酶的活性基本都丧失了。 ③RNase处理：在DNA-DNA杂交实验中，RNase的处理可去除内源性RNA，增加实验的信噪比。在进行mRNA为靶标的检测时，RNase处理的样品也可作为质控对照。通常的处理方式是将DNase-free的RNase溶解于2×SSC (100μg/ml)，样品在溶液中37℃处理60min。SSC=150mM NaCl, 15mM 柠檬酸钠溶液(pH7.4) ④HCl处理：对样本进行20-30min的200mM HCl处理
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分析青蛙心脏灌注实验结果
作者：德尔塔 日期：2022-03-30
一、青蛙心脏灌注实验介绍： 1.做青蛙心脏灌注实验时用0.65％Nacl溶液灌注时青蛙的心脏变弱钙离子排泄触发心肌收缩。由于心肌细胞的肌浆网不发达，因此心肌收缩的强度与细胞外Ca2 +浓度成正比。用0.65％NaCL溶液灌注心脏。由于灌注液中Ca2 +的缺乏，心肌细胞动作电位的流入Ca2 +减少，细胞质Ca2 +浓度降低，心肌的收缩活性也减弱。如果青蛙的心脏长时间用0.65％NaCL溶液灌注，心脏最终将停止收缩，但心肌仍可产生动作电位（即兴奋）。这种现象称为兴奋收缩解耦，这是缺少心肌细胞的现象。 Ca2 +处理后的性能。 2.当青蛙的心脏充满高K +仁溶液时，心跳减弱当青蛙的心脏充满高K + Ren溶液时，心跳明显减弱，心脏甚至在舒张状态下停止。由于当细胞外K +浓度增加时K +和Ca2 +具有竞争性拮抗作用，因此K +可以抑制Ca2 +通过细胞膜的运输，从而减少Ca2 +进入人体细胞，并且心肌兴奋与收缩的耦合过程减弱了心肌。收缩力。当细胞外K +浓度显着增加时，膜内外K +浓度梯度降低，静息电位的绝对值过度降低，Na +通道失活，心肌的兴奋性完全丧失，无法激发心肌并收缩，并停留在舒张状态。 3.下降2％CaCL2后，离体青蛙心脏的收缩力增加用高Ca2 + Ren溶液灌注青蛙的心脏，增加了青蛙心脏的收缩力，但舒张期未完成，因此收缩基线上升。在高Ca2 +浓度的情况下，心脏将处于收缩状态。这种现象称为“钙硬度”。心肌的舒张和收缩活性与心肌肌浆中Ca2 +的浓度有关。当Ca2 +的浓度升高到10-5M时，作为钙受体的肌钙蛋白会结合足够的Ca2 +，从而导致肌钙蛋白的分子构型发生变化，从而触发肌肉细丝的滑动和肌肉纤维的收缩。当肌浆中的Ca2+浓度降至10-7时，Ca2Ren's溶液会灌注青蛙的心脏，导致肌浆中Ca2 +的浓度继续增加，与肌钙蛋白结合的Ca2 +的量继续增加，甚至达到结合水平但没有解离水平此时，心肌将继续收缩，并出现“钙质僵硬”。 4.滴下肾上腺素后，青蛙的心脏收缩增加将肾上腺素滴到青蛙的心脏后，可以看到青蛙的心脏收缩增加，心脏完全放松
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