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CTLA-4/LAG3 双免疫检查点人源化小鼠助力肿瘤研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
2021年3月25日，百时美施贵宝（Bristol Myers Squibb，BMS）公司宣布其抗LAG-3单抗relatlimab联合抗PD-1单抗Opdivo（nivolumab）的组合疗法，在评估未经**的转移性或不可切除性黑色素瘤患者的II/III期临床试验RELATIVITY-047（CA224-047）中，相比 Opdivo单独用药可显著改善患者的无进展生存期（progression-free survival，PFS），试验达到主要终点。这是全球首个抗LAG-3抗体的临床III期数据。 该试验采用了随机、双盲设计：一共714位患者以1:1的比例随机分配，分别接受160 mg relatlimab和480 mg Opdivo组合药物，或480 mg Opdivo单独用药。每四周一次静脉注射给药。这次试验的次要终点——总生存期(overall survival，OS）和客观应答率（objective response rate，ORR）还未达到，试验还在进行中。在安全性方面，目前固定剂量的联合疗法耐受性良好，两个给药组中都未出现新的安全信号。 1 LAG-3简介 淋巴细胞活化基因3（Lymphocyte-activation gene 3，LAG-3），又称为CD233，由 Triebel及其同事于1990年发现。LAG-3是一个Ⅰ型跨膜蛋白，属于免疫球蛋白（Ig）超家族，主要表达在活化T细胞和NK细胞表面。 LAG-3是T细胞的一个抑制性免疫检查点。与PD-1和CTLA-4一样，LAG-3能负向调控T细胞的增殖、激活和稳态。在人CD4+细胞中封闭LAG-3能促进细胞增殖，并提高 IL-2、IL-4、IFN-γ和TNFα的表达水平。此外，有研究认为LAG-3参与了调节性T细胞（Treg）的抑制性作用[1]。当处于肿瘤环境或慢性感染时，长期的抗原刺激会导致LAG-3持续高表达，引起T细胞耗竭（exhaustion）。因此，阻断LAG-3信号通路能促进耗竭T细胞恢复功能。 此外，与CTLA-4和CD28不一样，研究表明LAG-3可能不是通过与CD4竞争配体MHC II来调控T细胞活性，而是通过其胞内结构域直接向T细胞转导抑制性信号[4]。 2 LAG-3结构 人体中，LAG3基因在第12号染色体上（12p13），与CD4（12p13.31）相近。此外，虽然LAG-3和CD4在蛋白质水平上只有约20%
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人检测试剂盒的注意事项及方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
人检测试剂盒注意事项 1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡 15-30 分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。 2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。 3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在 5 分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。 4.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD 值大于标准品孔*孔的OD 值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n 倍）后再测定，计算时请后乘以总稀释倍数（×n×5）。 5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。 6.底物请避光保存。 7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准. 8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。 人检测试剂盒操作步骤 1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。 2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样 50µl，待测样品孔中先加样品稀释液 40µl，然后再加待测样品 10µl（样品终稀释度为 5 倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。 3.温育：用封板膜封板后置 37℃温育 30 分钟。 4.配液：将 30 倍浓缩洗涤液用蒸馏水 30 倍稀释后备用 5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置 30 秒后弃去，如此重复 5 次，拍干。 6.加酶：每孔加入酶标试剂 50µl，空白孔除外。 7.温育：操作同 3。 8.洗涤：操作同 5。 9.显色：每孔先加入显色剂 A50µl，再加入显色剂 B50µl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色 15 分钟. 10.终止：每孔加终止液 50µl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。 11.测定：以空白空调零，450nm 波长依序测量各孔的吸光度（OD 值）。 测定应在加终止液后 15 分钟以内进行。
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小鼠杂交瘤细胞株DerP2操作流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
小鼠杂交瘤细胞株；DerP2操作流程： . 主要试剂与仪器：倒置相差显微镜（日本 olympus imt-43），co2孵箱（日本yamato it-6）。 .2 hek-293细胞的复苏培养传代及冻存： .2. 细胞的复苏培养 从液氮罐中取出冻存管,立即投入37℃水浴,并不断的摇动,使之迅速融化。 将溶解的细胞冻存管取出,用酒精消毒后打开,吸出溶有细胞的冻存液,加入事先装好培养液（37℃预热，8～0倍体积）离心管内,稍微吹打混匀,然后000rpm 5min,去除上清,加入适量培养液,吹打成细胞悬液, 以×05/ml密度接种于25cm2培养瓶内，在37℃、5％co2及饱和湿度下培养。 .2.2 细胞传代 原代培养的hek－293细胞48h换液次，细胞长至60%～70%融合时，用0.25%胰酶消化～2min，将培养瓶再用手掌轻轻敲打使细胞脱壁、悬浮、分散，为使细胞进一步分散可用吹打管轻轻吹打几次，获得细胞悬液，然后加入倍量的培养基，温和混匀，吸管分装混合液，传代扩增细胞。 .3 细胞形态的观察 在倒置显微镜下观察并记录细胞的生长情况及形态特征。 .4 细胞的计数 常规消化细胞，待细胞变圆、脱壁并浮起，加入少量培养基离心，再用pbs重悬并吹打制成细胞悬液。在细胞计数板盖玻片的一侧加微量细胞悬液，用0×物镜观察计数板四角大方格细胞数，按公式计算出细胞数。细胞数/ml原液＝(四方格细胞数之和/4) ×04。 .5 细胞的贴壁率 指数生长期的细胞，以0.25％胰酶消化成单细胞悬液，计数后分别接种于2个25cm2培养瓶中，每两小时随机取出3瓶细胞，吸除培养基及未贴壁细胞，加入胰消化酶消化、计数已贴壁细胞，取其平均值，按照公式：贴壁率(%)=(已贴壁细胞数/接种细胞数) ×00％，计算贴壁率。 .6 生长曲线 取指数生长期的细胞用胰酶消化制成单细胞悬液，以×04/孔接种于24孔板，每孔加入ml培养基。每天随机取3孔，计数每孔细胞的数目并计算平均值。连续计数0d，绘制细胞生长曲线。 运输和保存： 小鼠杂交瘤细胞株；DerP2视天气状况和运输距离远近，公司与客户协商后选择下述方式中的一种进行。 )mL
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纯净水和注射用水的总有机碳分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
摘要 在制药行业，水，特别是纯净水(PW)和静脉注射用水(WFI)对于药物制备是至关重要的。生产和确保这种水的清洁需要非常严格的质量控制和精确的分析测试方法。美国药典(USP)和日本药典(JP)已推广总有机碳(TOC)分析，作为验证PW 和WFI 不含TOC 的程序，因此可以用于制药目的。在USP 下，如果TOC 在一个0.5mgC/L 的1,4-苯醌标准品的系统下达到90%的回收率，则认为这个TOC 系统是合适的。JP 要求使用十二烷基苯磺酸标准与90%的回收率标准。 本文将提供符合这些严格标准的数据。此外，本研究将验证Teledyne Tekmar的TOC 分析仪(图1)在0.05 mgC/mL 条件下分析TOC 的适用性，而目前的标准为0.5 mgC/L。 图1. Teledyne Tekmar’s Fusion TOC 分析仪 简介 在制药行业，水，特别是纯净水(PW)和静脉注射用水(WFI)对静脉注射药物的制备至关重要。由于这些药物通常直接进入血液，用于制造它们的试剂需要尽可能洁净。美国药典(USP)和日本药典(JP)制定了严格的规定，要求用于制药的PW和WFI 不含总有机碳(TOC)。这些方法需要极为灵敏的仪器在需要的标准上检测TOC。 TOC 的JP 测试方法规定:“该仪器应能够检测有机碳含量的最低检测限至0.050 mgC/L。此外，当使用0.806 mg/L 的十二烷基苯磺酸溶液作为样品时，该系统应能够产生不低于0.450mgC/L 的有机碳，该溶液的碳浓度为0.500 mgC/L, JP 法规指定仪器必须能够氧化该溶液的90% (0.450 mgC/L)，才能作为被测样品。 这个应用说明将演示Teledyne Tekmar Fusion TOC分析仪满足日本药典关于总有机碳测试方法的两个要求的能力。 实验仪器条件 在本研究中，使用默认的日本药典方法在Teledyne Tekmar Fusion（紫外/过硫酸TOC分析仪）上进行了分析（表1）。 表1 Fusion 日本药典方法的参数设置 样品制备 以邻苯二甲酸氢钾(KHP)和十二烷基苯磺酸作为TOC的来源，在1 L容量瓶中配制1000mgC/L的KHP原液。从这个KHP原液中，连续稀释成0.500 mgC/L和5.00 mgC/L的样品溶液。将80.6 mg/L的十二烷
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技术干货 | 四血管阻塞全缺血模型的制作
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
四血管阻塞全脑缺血模型 缺血性脑损伤是目前中枢神经系统损伤性疾病研究的热点，建立稳定和易操作的动物模型是缺血性血管病研究的基础。目前研究最多的是 Pulsinelli大鼠全脑缺血四血管模型，是最经典的脑缺血动物模型之一，近年来被许多学者所使用。此方法能够有效地模拟临床中出现的因低血压休克及心肺脑复苏而导致的大脑缺血性损伤，且该模型具有较好可重复性，因此大批量用于基础实验。 1.动物选择 大鼠 对于四血管阻塞模型，比较理想的动物为 Wistar大鼠。品系好坏、是否为同一供应商和动物的周龄是影响实验成功率的几个重要因素。体重在250~300g的年轻大鼠成功率较高，而且四血管阻塞模型稳定性更好。由下表可知，一般选择Wistar大鼠作为实验动物。 小鼠 小鼠体型小，椎动脉分离阻塞困难，因此常采用蒙古沙土鼠。沙土鼠也是最早用于全脑缺血研究的动物。沙土鼠的优点是天生缺少两条后交通动脉，因此后循环不会代偿前循环，只需结扎两侧颈总动脉即可实现全脑缺血。但是，因为Willis环存在变异，只有30%-40%的小鼠能成功实现全脑缺血，而75%的沙土鼠在结扎一侧颈总动脉后就会造成心脏骤停。但沙土鼠比较难购买到。 2.手术操作步骤 基本的四血管阻塞模型 用异氟醚麻醉后，使大鼠平躺在手术台上，用呼吸麻醉维持动物的麻醉状态。 颈动脉周围放置阻塞设备 (1)颈部腹侧正中划开一伤口，使其皮肤分开。 (2)双手操作小弯镊将覆盖在颈部腹侧的肌肉及其他组织分开，暴露实验动物的颈总动脉。 (3)将迷走神经和颈交感神经链轻轻拨开，分离出颈总动脉，操作期间防止破坏神经。 (4)将阻断装置一根硅管(外径15mm，内径8mm，长10~15cm)分别松散地扣在颈总动脉上，并穿过纽扣的两个小洞。 (5)硅胶管两次穿过塑料管两端，将管子打结，系紧形成一个环。环的长度应该比塑料管的长度要小，这样就可以用来做阻塞装置了。因此，当硅管通过塑料管拉紧后，将和按钮共同阻断颈动脉血流。 (6)用1~2根手术线缝合伤口。 电凝
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NASH小鼠模型助力非酒精性脂肪肝的发病机制的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
非酒精性脂肪肝炎（nonalcoholic steatohepatitis, NASH）是由营养过剩引起的肝脂肪变性和慢性炎症导致的肝脏代谢性疾病，会逐步发展为肝纤维化、肝硬化甚至肝细胞癌，目前尚未有批准用于NASH**的药物。近来，有研究发现，通过激活AMPK通路，虫草素能抑制肝脏脂肪堆积，防止肝脏炎症损伤和纤维化的发生。该研究成果于2021年2月发表在Hepatology (IF=14.679，Q1) 杂志上。 虫草素（Cordycepin）是虫草的主要活性成分，具有广泛的生物活性，包括抗炎、抗氧化、抗纤维化、抗脂肪生成和抗肿瘤等。然而，虫草素对NASH进展的作用以及其中的潜在机制还不明确。因此，研究团队通过高脂饮食（HFD）和高脂高胆固醇饮食（HFHC）喂养建立NASH小鼠模型（这两种模型涵盖了人类NASH的代谢特征），探究虫草素对NASH发生发展的影响。 虫草素可减轻棕榈酸诱导肝细胞的脂质蓄积、炎症和脂毒性 为研究虫草素对代谢应激下肝细胞脂质堆积和炎症的影响，通过混合脂肪酸PO（棕榈酸，PA和油酸，OA）刺激LO2细胞。结果表明虫草素有效降低了细胞内的脂滴蓄积、甘油三酯（TG）和血清总胆固醇 （TC）含量、脂肪酸合成（FASN、SCD1、ACCα、PPARγ）和炎症（IL-6、TNFα、CCL5、CXCL10）相关基因的表达。为系统地评价虫草素对肝细胞的影响，进行了肝细胞RNA-Seq分析，结果表明组间的差异基因显著富集于炎症、脂代谢和凋亡相关通路，而且虫草素能够显著下调富集在上述通路的差异基因的表达。 图1. 虫草素对肝细胞脂质蓄积和炎症的影响。 虫草素可减轻高脂饮食引起的肝脂肪变性和炎症 探究虫草素能否减轻HFD引起的小鼠NASH疾病（雄性C57BL/6J小鼠HFD喂养共24周）。实验结果表明，虫草素显著降低了HFD引起的肝指数升高、肝脏脂质（TG、TC）含量增加、肝脏病理损伤（脂质蓄积、气球样变、炎性浸润）、脂肪酸合成摄取和炎症反应相关基因和蛋白的表达。 虫草素可改善HFHC饮食引起的肝脂肪变性、炎症和纤维化 为进一步研究虫草素对NASH的体内
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狷羚疱疹病毒1型PCR检测试剂盒说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
狷羚疱疹病毒1型PCR检测试剂盒说明书 本产品是即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。 1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。 2. 快捷，操作步骤已经限度地简化，能减少污染，降低实验误差。 3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。 4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。 5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。 使用及效果：将本产品15 μL 与用户自备的模板，引物和水共15 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取10 μL 电泳检查扩增结果。 技术特点： 1、准确可靠，临床双盲对照试验＞1000例，结果与金标准测序法比对，结果一致性大于99%。 2、高灵敏：可检测低至10ng的人基因组DNA。 3、快速：整个检测流程只需3小时。 4、简便：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配置操作简便。 5、防污染 6、高特异性：双重特异性组成，保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对，才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对，在延伸中产生荧光。 组成及试剂配制: 1、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：1×20ml。 4、
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IHC、ICC、IF免疫染色技术简介及实验设计
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
一．免疫组织/细胞化学简介 免疫组织化学（IHC）是确定组织切片上蛋白的存在与否及存在位置的一种方法。尽管这种方法在定量分析时灵敏度较免疫印迹法或ELISA等免疫测定方法低，但是它能观察到整个组织的情况，同时可以检测目的蛋白在组织中的表达位置。适用于评估癌症等疾病的发展及**情况。因此，从IHC获得的信息结合显微技术给广大科研工作者提供了一幅“宏图”，使来自其它方法的数据有据可依。 免疫细胞化学（ICC）技术则是IHC技术在细胞样本中的应用，通过对悬浮/爬片细胞进行免疫染色，可以检测到目标蛋白在细胞中的表达位置和含量等信息，更加直观。 IHC和ICC染色是抗体识别靶抗原的过程。因为抗体与抗原的结合是高度特异的，因此，它只与组织切片或细胞样本中相应的蛋白结合。应用显色检测法即能看到抗原—抗体反应，其显色方法是将使用酶结合的抗体，在添加底物后，通过酶促反应在蛋白位点产生色素沉着。另外一种方法是直接使用荧光染料标记的抗体，将抗体识别与荧光显色技术相结合，通过荧光显微技术对样本进行检测，这种方法通常被叫做免疫荧光（IF）。结合目前先进的荧光显微镜成像技术，如激光共聚焦显微镜，IF可以得到检测样本的三维立体结构，更加形象直观。 要实现可靠一致的实验结果，对操作流程的优化必不可少。IHC/ICC/IF的原理和实验步骤大体相同，整体实验流程如下图所示。 免疫染色实验流程图 二．设计实验 1.实验对照 实验对照：在进行免疫组化染色时，必须证实组织内显示的反应产物，确实是抗原与相应的特异性抗体反应所产生的。由于免疫组织化学染色中影响抗原、抗体和免疫反应的因素很多，因此对免疫组织化学染色结果的评价必须设置对照组才能做出正确的判断。常用的对照组有以下几种： 阳性对照：用已证实含用待测抗原的组织，与待检标本做同样处理后，进行免疫组化染色，结果应为阳性，称为阳性对照。每次实验都应做阳性对照，通过阳性对照可证明靶抗原有一定活性，染
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NOD scid免疫缺陷小鼠模型的故事
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
疾病动物模型是研究人类疾病发生发展机制、药物筛选及疗效评价必不可少的工具，好的疾病动物模型可以加快新药的研发速度。你还在为不知道选择什么小鼠模型发愁吗？你还在为造模发愁吗？赛业生物新栏目《每周一鼠》上线啦，每周更新，为大家讲解一个疾病小鼠模型的故事，希望对大家了解不同的疾病小鼠模型有所帮助。今天和大家见面的是免疫缺陷鼠NOD scid 。 免疫缺陷小鼠是指由于先天遗传突变或者用人工方法造成的免疫系统上一种或者多种免疫成分（B细胞、T细胞、NK细胞等）存在缺陷或者缺失的小鼠，随着基因编辑技术的不断发展，越来越多的免疫缺陷小鼠品系被研发出来，在免疫学、传染病学、肿瘤学、干细胞生物学等研究领域中发挥着日益重要的作用。 SCID小鼠是1983年美国学者Bosma等首先在C. B-17近交系小鼠中发现的,由位于16号染色体的SCID隐性基因突变所致。SCID小鼠的T、B淋巴细胞功能缺陷,但巨噬细胞、NK细胞及淋巴因子激活细胞(LAK)等均正常。少部分周龄较大的SCID小鼠会发生泄露,产生B和T淋巴细胞,降低了植入细胞的存活率。NOD/Lt小鼠具有Ｔ淋巴细胞介导的细胞免疫，但ＮＫ细胞、抗原提呈细胞功能缺陷。学者们将SCID小鼠与非肥胖型糖尿病小鼠NOD/Lt回交而得到非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷小鼠。 NOD scid小鼠既具有SCID鼠的特征，缺乏适应性免疫系统，不再发生自身免疫性糖尿病，同时还表现出NOD鼠所具有的多种固有免疫缺陷，包括NK细胞活性低、骨髓功能不正常、约30%纯合子无补体成分C5并缺乏补体系统的溶血活性，是一种更易于移植成功并可稳定应用的动物模型。 品系说明 ☑ 在非肥胖型糖尿病小鼠（NOD）背景品系的基础上引入PrkdcSCID突变。 ☑ 先天性T和B淋巴细胞免疫缺陷。 ☑ NK细胞活性降低。 ☑ 补体活性降低。 ☑ 巨噬细胞对人源细胞吞噬作用弱。 ☑ 树突状细胞功能下降。 表型信息及应用 ☑ 独有的多种免疫缺陷为人类造血细胞的重建提供了一个极好的系统，是HIV-1研究和基因**的
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无血清培养基体系的特长劣势详解
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
1976年，Sato等首次发现在不加入血清的培养基中加入少量生长因子能够维持GH3细胞株的生长，自此无血清培养技术越来越得到人们的重视。无血清培养基是继天然培养基，合成培养基之后的第三类培养基。与传统的培养基相比较，无血清培养基是不含动物血清，但仍可以维持细胞在体外较长时间生长、增殖的一种培养基。无血清培养基由于其组成成分相对清楚，制备过程简单，在现代生物技术学领域得到广泛应用。 无血清培养基的优劣势 无血清培养基体现出以下几方面的优势： 1. 培养基化学组成明确可控； 2. 培养基性能受原料批次影响小； 3. 培养基被病原微生物污染的潜在风险大大降低； 4. 简单、明晰的组分有利于下游生产工艺（如细胞表达产物的分离和纯化）； 5. 有利于体外培养细胞的分化。 劣势： 1. 细胞在无血清培养基中易受某些机械因素和化学因素的影响，培养基的保存和应用不如传统的合成培养基方便。 2. 成本较高。 3. 针对性强，一种无血清培养基仅适合某一类细胞的培养。 无血清培养基组成 大多数细胞在基础培养基中单独培养时都不能增殖，它们需要补充额外的生长因子和细胞因子，如激素、转运蛋白、微量元素或ECM因子。激素如胰岛素、生长激素等胰岛素作为一种多肽激素，对哺乳动物细胞具有多效合成作用，促进葡萄糖和氨基酸摄取、脂肪生成、单价阳离子和磷酸转运、蛋白质和核酸合成。转运蛋白，如转铁蛋白，转铁蛋白作为铁的载体，也有助于降低氧自由基和过氧化氢的毒性水平。ECM因子是某些贴壁生长细胞所必需的组分，如纤连蛋白、胶原蛋白、层粘连蛋白等。 无血清与血清体系培养MSC的比较 实验原材料： BM-MSCs（骨髓来源，P5）；MSCs无血清培养基；DMEM培养基及胎牛血清。 实验动物模型： 将大鼠随机分为4组（每组6只）：SF-MSCs（无血清体系培养）；10%MSCs（DMEM+10%FBS培养）；PBS组；假手术组。 实验操作： 对大鼠进行单侧输尿管结扎，假手术组未进行单侧输尿管结扎。术后4天，SF-MSC
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MeCP2基因敲除小鼠助力神经系统发育障碍疾病的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
想调整研究方向，获得学术研究突破口？想获得论文选题思路，提高发文命中率？你需要了解学科发展态势和未来走向！赛业生物专栏《Gene of the Week》每周会根据热点研究领域介绍一个基因，详细为您介绍基因基本信息、研究概况和应用背景等，助您保持学术研究敏锐度，提高科学研究效率，期待您的持续关注哦。今天我们要讲的主角是神经系统发育障碍疾病致病基因之一MeCP2。 1 基因基本信息 2 MeCP2基因研究概况 MeCP2对哺乳动物的学习记忆能力有着重要的影响，同时也是Rett综合症和MeCP2重复综合症的致病基因。MeCP2通过多种机制对基因的转录有显著影响，而且有明确表型的学习和记忆动物模型，使MeCP2成为学习和记忆中基因转录研究的理想对象。MECP基因主要发挥的就是转录调节功能。在人类和小鼠中，该基因位于X染色体上，最终编码一个500左右氨基酸残基的蛋白质。该蛋白与DNA甲基化的位点结合，解除转录抑制。Rett综合症是由MeCP2发生突变导致其失活所致，属于X染色体隐性疾病；而MeCP2重复则是由MeCP2的过表达所致，属于X染色体显性疾病。 MeCP2同时具备转录抑制和转录激活两种功能。一方面MeCP2结合甲基化位点后会与mSin3A/HDAC共抑制因子结合，进一步稳定甲基化结构，从而对基因的转录产生抑制作用；另一方面，该蛋白磷酸化后也会招募CREB等转录激活蛋白促进基因的转录。 图1. MeCP2功能的分子机理。 信息来源：10.1101/lm.048876.118. MeCP2基因位于X染色体上，其左右相邻的基因分别为RCP和IRAK基因。在人类和大小鼠中，对该基因功能有显著影响的是第1-4号外显子和其中的3个内含子。MeCP2蛋白主要由5个部分组成，首先是位于两端的末端序列NTD（N-terminal Domain）和CTD（C-terminal Domain）；中间则依次是是甲基化位点结合结构域，中间区域（interdomian）和转录抑制结构域。该蛋白理论上为53kd大小，不过由于其在翻译后经历过一系列的修饰作用，其分子量在免疫印迹中大多为75kd。MeCP2在大多数组
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细胞培养中常见的生物污染及解决方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
细胞培养中常见的生物污染包括细菌污染、霉菌污染、支原体污染、黑点污染、真菌污染和原生动物污染。这些污染在细胞培养中的特点及相应的解决办法如下： 1.细菌污染 细菌在普通倒置显微镜下呈黑色和细砂状。根据感染菌的种类不同，可能会呈现不同的形状，培养液一般会变得浑浊、黄色，对细胞生长有明显影响。 解决方法：仔细检查器具的灭菌情况，确保通风时间和高压灭菌器的压力是否足够。最重要的是，与培养基接触的移液管等物品如果被污染两次，则可能会导致储存溶液也受到污染。所以一定要注意！下次使用前要检查培养基的浑浊度。此外，建议在培养基中添加抗生素。 2.霉菌污染 正常情况下，培养基在 37℃ 培养箱中培养两三天，在倒置显微镜下仍保持透明，无杂质。一旦出现絮状杂质，显微镜下可见丝状和团块状漂浮物，菌丝明显。此时，虽然细胞仍在生长，但它们的生命状态会在长时间后逐渐恶化。 解决方法：用硫酸铜溶液擦拭 CO2 培养箱，向托盘中加入饱和硫酸铜或消毒后加入饱和磷酸氢二钠高盐溶液，避免霉菌污染。 如果霉菌污染，暂时转移所有细胞，并立即彻底使用 guo 氧乙酸溶液擦拭培养箱，包括层板和内壁。将 guo 氧乙酸放在培养箱中一小时，使蒸汽扩散，待 guo 氧乙酸气味消散后，将细胞转移到培养箱中。值得注意的是，培养箱需要每两个月定期清洗一次，尤其是在梅雨季节。用 84 消毒液、清水和 75% 酒精连续擦拭培养箱，用紫外线照射也是一种有效的方法。 为防止霉菌污染，需添加 3μg/ml 两性霉素、霉素抑制素、fang 线菌素 D 或青霉素链霉素。一旦被污染，就不可能恢复，即使使用上述抗生素，也没有什么区别。对于支原体污染的细胞培养，**选择是丢弃污染的培养物，并用使用新鲜的无支原体的储存液，彻底消毒环境。如果所有的细胞都被污染了，那可能是整个培养系统污染了。因此，必须对培养基和实验设备进行检查。如果只是个别污染，可能是操作问题，有必要注意实验操作步骤的规范。 3
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工业应用中倒置显微镜相较于正置显微镜的五大优势
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
使用倒置显微镜时，您需要从下方观察样本，因为倒置显微镜的光学元件位于样本下方，而使用正置显微镜时，您需要从上方观察样本。一直以来，倒置显微镜主要用于生命科学研究，因为重力将样本沉入含有水性溶液的托座底部，从上方则无法观察到太多内容。但近段时间以来，倒置显微镜在工业应用中也变得越来越流行。我们现在一起来了解倒置显微镜在工业应用中的优势。 1) 与正置显微镜相比，倒置显微镜让您获得更大的自由 对于正置显微镜，样本的尺寸限制为80 mm的平均高度和3 kg的重量，这也取决于所使用的物镜。而这一限制并不适用于倒置显微镜。由于光学元件都安装在载物台下方，所以样本放在物镜上方。这意味着使用者获得了更佳的工作距离，可以处理重达30 kg的大型厚重样本。所以如果要处理较大且较重的样本，或者使用的样本在尺寸和重量方面存在着很大的差异变化，则倒置显微镜能够提供您所需的自由。 图1: 倒置显微镜的光通道 图2：含有大样本的倒置显微镜 2) 倒置显微镜能够让您在更短时间内观察更多的样本 使用倒置显微镜时，您只需要将样本摆放于载物台上，对焦表面进行成像即可。样本在所有放大倍数下都能保持对焦而且同类型的样本都能进一步保持同样的对焦。 使用正置显微镜时，其工作流程包含更多需要操作员完成的任务：您需要降低载物台，将其移出，取下样品架并安装新的样品架，将样本摆放到位并实施保护，再使用样本压块将样本表面调平，之后才能转换至更低的放大倍数进行定位。操作员需要练习全部这些步骤，但不同的步骤在每次操作当中依然存在着失败的风险。 对于未经培训的操作员来说，样本的放置可能是一项艰巨的任务；而使用倒置显微镜时，将样品放在载物台上可谓‘小菜一碟’，整个操作所需的步骤也更少。 还有一点：正置显微镜的所有步骤加起来会非常耗时，尤其是当您需要对样本逐一进行观察而且样本量较大时。假设经验丰富的使用者在操作正置显微镜。即便每个步骤只需要5秒的时间，
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免疫系统人源化小鼠的分类及其在抗HIV细胞免疫疗法中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
BRGSF小鼠背景回顾 BRGSF（BALB/c Rag2tm1Fwa Il2rgtm1Cgn SirpαNOD Flk2tm1lrl）小鼠是目前市面上免疫缺陷程度最高的小鼠之一：Rag2和Il2rg基因的敲除使BRGSF小鼠T、B、NK细胞缺失；SirpαNOD抑制了小鼠巨噬细胞对人源细胞的吞噬作用；Flk2基因的敲除使小鼠髓系细胞组分（特别是树突状细胞，DC）大幅减少（图1）。这种免疫系统上的高度缺陷使BRGSF小鼠对各类人源移植物高度兼容，同时也是构建免疫系统人源化小鼠的优秀模型。 因此，通过在BRGSF小鼠身上进行人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）移植，我们可以得到以人源T细胞重建为主的PBMC免疫系统人源化小鼠。这种小鼠可用于需要成熟T细胞的短期研究，例如HIV/AIDS相关研究。 图1. BRGSF重度免疫缺陷小鼠。 免疫系统人源化小鼠 人源化小鼠是指携带功能性人类基因、细胞、组织、器官或免疫系统，甚至是微生物的小鼠，可用于生物医学研究和临床**方案的开发。其中，免疫系统人源化小鼠，也称为人免疫系统重建小鼠，是指通过将人的造血干细胞、免疫细胞或组织移植到免疫缺陷小鼠体内，使其能重建人类免疫系统的小鼠模型。这类小鼠可以更有效地模拟人体免疫系统的反应，为人类肿瘤免疫、自身免疫性疾病，以及人特异性传染疾病（例如由人类免疫缺陷病毒HIV引起的获得性免疫缺陷综合征AIDS）的转化研究提供优秀模型。 不同类型免疫系统人源化小鼠的对比 根据重建方法，免疫系统人源化小鼠可大致被分为以下三类。 1 Hu-PBL小鼠，也称为Hu-PBMC小鼠 构建方法：经尾静脉（i.v.）、腹腔（i.p.）或脾内（intrasplenic）注射人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）到成年免疫缺陷小鼠体内。 人源免疫系统重建时间：约2周。 优点： ①操作简单，成本低； ②T细胞移植效率高。 缺点： ①重建以人源T细胞为主，B细胞和髓系细胞数量较低（可能是因为缺乏与它们生存相关的人源细胞因子）； ②产生致死
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1,3-βDglucosidase ELISA试剂盒使用说明书
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
1,3-βDglucosidase ELISA试剂盒说明书 本产品是即用型PCR试剂盒的改良产品， 含有Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料等所有PCR 所需要的成分，用户只需加入模板和引物即可进行PCR 反应，具有广泛的用途。 1. 方便，用户只需准备模板和引物既可以进行PCR 实验。 2. 快捷，操作步骤已经限度地简化，能减少污染，降低实验误差。 3. 本产品A 型含电泳染料，PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。 4. 由于各成分的浓度和比例都经过精心优化，反应的灵敏度高，特异性强。能扩增各种常见的DNA 样品。 5. 产物可直接用于T 载体克隆，不需要额外的加A 反应。 使用及效果：将本产品15 μL 与用户自备的模板，引物和水共15 μL 混合后，直接进行PCR反应（PCR 参数由用户自己确定），反应结束后直接取10 μL 电泳检查扩增结果。 技术特点： 1、准确可靠，临床双盲对照试验＞1000例，结果与金标准测序法比对，结果一致性大于99%。 2、高灵敏：可检测低至10ng的人基因组DNA。 3、快速：整个检测流程只需3小时。 4、简便：试剂盒提供预混好的试剂，使体系配置操作简便。 5、防污染 6、高特异性：双重特异性组成，保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对，才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对，在延伸中产生荧光。 组成及试剂配制: 1、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至0.5ml，盖好后室温静置大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为200 U/L，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在板中进行倍比稀释），分别配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，样品稀释液直接作为空白孔 0 U/L。如配制100 U/L标准品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述标准品加入含有0.3ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：1×20ml。 4
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