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基因甲基化检测试剂盒有哪些优势特点呢？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
基因甲基化是指DNA分子上CpG双核苷中的胞嘧啶（C）在酶的作用下选择性地添加甲基形成5'-甲基胞嘧啶的过程。CpG双核苷常位于基因转录调控区附近，其甲基化能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性等发生改变，从而调控基因的转录和表达。 简单来说，基因甲基化就像DNA的一顶最神奇的“帽子”。戴上这顶“帽子”则会封suo转录起始使转录过程不能延伸，并且影响转录因子与启动子的结合，从而使得基因沉默。因此低甲基化会激活基因转录，而超甲基化则会阻止基因转录导致基因沉默。 基因甲基化异常是肿瘤发生最常见的表观遗传变化之一，肿瘤的发生表现为基因组整体甲基化水平降低（癌基因）和CpG岛局部甲基化水平的异常升高（抑癌基因）。 在肿瘤细胞中存在多种不同类型的基因被甲基化，提示多途径参不了肿瘤的发生。对肺癌相关甲基化 DNA 检测可辅助肿瘤的诊断以及评估**反应和预后情况。透景选用SHOX2和RASSF1A两个基因作为甲基化检测的组合，可有效实现对肺癌的早期辅助诊断。 主要用于肺癌早期诊断、肺结节良恶性鉴别诊断等提高无创样本的检测灵敏度，同时保证检测特异性；提高无创样本的检测灵敏度，同时保证检测特异性。 透景生命肺癌甲基化-人SHOX2、RASSF1A基因甲基化检测试剂盒有哪些优势特点呢？ 1、样本特异性更高，降低假性结果，采用肺泡灌洗液作为检测样本，肺癌细胞数量比例高，检测特异性更具优势。 2、灵敏度高，无症状早期即可检测。甲基化检测灵敏度高，在无症状期即可检出，大大弥补影像学和细胞学的缺陷，可提高早期诊断率。临床验证实验数据表明，lung-Me甲基化检测对肺癌的诊断灵敏度为71.5%-83.2%，特异性为90.0%-97.4%。 3、与细胞学检测比较，甲基化检测结果更灵敏，更客观，更稳定，收样本与操作的影响更小，Lung-Me可以作为细胞学检测的有力补充，特别是在细胞学结果未明或阴性时。 4、前沿的技术优势透景投入10年精力，集中开发肿瘤早期诊断产品，SHOX2、RASSF1a甲基化检测早期肺癌
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超声波细胞破碎仪使用时需要注意哪些细节？
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
超声波细胞破碎仪使用时需要注意哪些细节？ 1 、切记空载（一定要将超声变幅杆插入样品后才能开机,） 2、变幅杆（超声探头）入水深度： 1.5Cm 左右，液面高度**有 30mm 以上，探头要居中，不要贴壁。 超声波是垂直纵波，插入太深不容易形成对流，影响破碎效率。 3、超声参数设置：设置键好仪器工作参数（具体设置见说明书或），对于对温度要求比较敏感的 样品（比如细菌）一般外面采用冰浴，实际温度肯定是低于 25 度，蛋白核酸肯定不会变性。 1） 时间：超声时间每次**不要超过 5 秒 ，间隙时间应大于或等于超声时间，以便于热量散发。时间 设定应以超声时间短，超声次数多原则，可延长超声机子以及探头的寿命。 2） 超声功率： 不宜太大，以免样品飞溅或起泡沫，如小于 10ml 样品容量，功率应在 200w 以内,选用 2mm 超声探头，另将面板后面的变幅杆选择开关打到相应挡；10-200ml 样品容量的功率在 200－400w， 选用 6mm 超声探头，另将面板后面的变幅杆打到相应挡；200ml 以上的样品容量功率在 300-600w 之间， 选用 10mm 超声探头，另将面板后面的变幅杆打到相应挡；（2MM 的小探头功率严禁超过 350W） 3） 容 器选择：有多少的样品就选多大的烧杯，这样也是有利样品在超声中对流，提高破碎效率。例如；20ML 的处理量**用 20ML 的烧杯。 如 100ml 大肠杆菌样品设置参数： 超声 5 秒 ／间隙 5 秒 次数 70 次（总 时间为 10 分钟）。功率 300W（仅供参考） 500ML 左右的量，功率开到 500W-800W 左右 4、若样品放在 1.5ml 的 EP 管里请一定要将 EP 管固定好，以防冰浴融化后液面下降导致空载 5、日常保养：用完后用酒精擦洗探头或用清水进行超声
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抗原和抗体的区别
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
1、性质不同 抗原：抗原（antigen，缩写Ag）是指能引起抗体生成的物质。它为任何可诱发免疫反应的物质。外来分子可经过B细胞上免疫球蛋白的辨识或经抗原呈现细胞的处理并与主要组织相容性复合体结合成复合物再活化T细胞，引发连续的免疫反应。 抗体：抗体（antibody）是指机体由于抗原的刺激而产生的具有保护作用的蛋白质。它（免疫球蛋白不仅仅只是抗体）是一种由浆细胞（效应B细胞）分泌。 被免疫系统用来鉴别与中和外来物质如细菌、病毒等的大型Y形蛋白质，仅被发现存在于脊椎动物的血液等体液中，及其B细胞的细胞膜表面。抗体能识别特定外来物的一个独特特征，该外来目标被称为抗原。 2、特点不同 抗原：异物性是指进入机体组织内的抗原物质，必须与该机体组织细胞的成分不相同；大分子性是指构成抗原的物质通常是相对分子质量大于10000的大分子物质，分子量越大，抗原性越强；特异性是指一种抗原只能与相应的抗体或效应T细胞发生特异性结合。 抗体：IgG于出生后3个月开始合成，3～5岁接近成人水平；IgM占血清Ig总量的5%～10%，血清浓度约为1mg/ml。 IgA分为两型：血清型为单体，主要存在于血清中，仅占血清Ig总量的10%～15%；分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)为二聚体，由J链连接，含内皮细胞合成的分泌片，经分泌性上皮细胞分泌至外分泌液中。 3、功能不同 抗原：在医疗中将病原微生物制成疫苗进行预防接种，可以提高人的免疫力。也可以根据微生物抗原的特异性进行各种免疫学试验，帮助诊断疾病。 抗体：抗体的功能与其结构密切相关。同一抗体的V区和c区的氨基酸组成和顺序的不同，决定了其功能上的差异。不同抗体的V区和C区在结构变化上具有一定的规律，又使得其在功能上存在共性。V区和C区的组成和结构，决定了抗体的生物学功能。
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单克隆抗体和多克隆抗体两者间的区别
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
有一个经常出现的问题—单克隆抗体和多克隆抗体有什么区别？这是个好问题！这两种抗体的产生方式和用途都大不相同。 在这我们对这两种类型的抗体进行了细分，并概述了有关多克隆抗体和单克隆抗体的所有相关信息。 什么是单克隆抗体？ 单克隆抗体定义： 一种（单）类型的抗体与目标抗原上的特定表位结合，构成单克隆抗体。 单克隆抗体生产 为了制造单克隆抗体，首先将免疫抗原注射到宿主动物中。一旦免疫原引起免疫反应，就会从脾脏中提取B细胞并与骨髓瘤细胞（癌症B细胞）融合。 健康的脾细胞不会在细胞培养中无限期地存活，因此进行这种融合过程以制造永生细胞系。通过该过程创建了杂交瘤细胞系。 通过将脾脏中的单个B细胞融合并培养到它们自己的杂交瘤中，可以产生所有产生相同特异性抗体的B细胞的单一培养物。 特定的克隆号码被分配给筛选产生单克隆抗体的每个杂交瘤，以便可以识别特定的抗体和它结合的特定表位。 B细胞将单克隆抗体分泌到细胞培养基中。在这里，单抗被提取出来用于进一步的测试和纯化。 单克隆抗体杂交瘤克隆的创建提供了稳定的可再生抗体来源，确保每批与前一批相同。 为了制造一种分泌富含抗体的液体的肿瘤，称为腹水，也可以将杂交瘤注射到小鼠的腹腔中用于单抗的产生。 什么是多克隆抗体？ 多克隆抗体定义： 与靶抗原上的许多不同表位结合的许多不同抗体构成多克隆抗体。 多克隆抗体生产 将免疫原注射到宿主动物中以产生多克隆抗体。动物的免疫反应是由这种免疫原激活多个B细胞引起的，所有这些B细胞都靶向免疫原上的特定表位。 大量具有不同互补位的抗体由此产生，因此对靶蛋白的亲和力不同。 免疫后，可以直接使用来自血清（去除了凝血蛋白和红细胞的血液）中的这些多克隆抗体，或者可以将它们纯化以获得不含其他血清蛋白的溶液。 新动物必须用抗原免疫以创建新批次，这意味着批次之间存在高度可变性。
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ELISA实验测定类型和操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
双抗体夹心法检测抗原 双抗体夹心法是检测抗原常用的方法，但要注意的是在一步法（待测抗原与酶标抗体一起加入反应）测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成“夹心复合物”出现钩状效应，甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 双抗体夹心法测抗原的另一注意点是类风湿因子（RF）的干扰。RF是一种自身抗体，多为IgM型，能和多种动物IgG的Fc段结合。用作双抗体夹心法检测的血清标本中如含有RF，它可充当抗原成份，同时与固相抗体和酶标抗体结合，表现出假阳性反应。双抗体夹心法适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，但不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。 双抗体夹心法的简要操作步骤为： 1）先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面； 2）再加样品，使目标检测抗原形成抗原-抗体复合物； 3）加酶标抗抗体（第二种动物抗抗原的酶标抗体）； 4）加入酶促反应底物，发生显色反应，显色的深浅与待测抗原的量成正比。 竞争法检测抗原 当小分子抗原或半抗原因缺乏可作夹心法的两个以上的抗体结合位点，因此不能用双抗体夹心法进行测定，可以采用竞争法模式。方法的基本原理可见图2，经洗涤后分成两组：一组加酶标记抗原和被测抗原的混合液，而另一组只加酶标记抗原，再经孵育洗涤后加底物显色，这两组底物降解量之差，即为所要测定的未知抗原的量。小分子激素、药物等ELISA测定多用此法。 竞争法的简要操作步骤： 1）先加入抗体，使抗体固定结合于载体表面； 2）加入梯度浓度比例的待测样品与酶标抗原混合物,同时做只加酶标抗原的对照组； 3）加入酶促反应底物，发生显色反应，对比实验组及对照组的显色差异，计算未知抗原的量。 双抗原夹心法检测抗体 双抗原夹心法的反应
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菲恩生物预吸附二抗实验原理
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
对于经常进行抗体检测工作的人来说，非特异性结合和背景着色常常是一大困扰，某些情况下二抗存在交叉反应是主要原因。 二抗，即第二抗体，是能和抗体结合，即抗体的抗体，其主要作用是检测抗体的存在，放大一抗的信号。二抗的制备一般是利用抗体是大分子的蛋白质具有抗原性的性质，去免疫异种动物，由异种动物的免疫系统产生的针对于此抗体的免疫球蛋白。因此二抗实际上也是多抗，本身的特性决定了其大概率会存在交叉反应。 针对这一问题，我们可以在制备二抗时添加一步预吸附的纯化步骤，以提高抗体的特异性。基本原理是将二抗流经固定有潜在交叉反应的物种的血清蛋白的基质柱，有非特异性结合的二抗会留在柱中，而特异性高的二抗将通过基质柱。 经过预吸附处理的二抗能有效降低非特异性背景，尤其在多重染色实验和样本中内源性免疫球蛋白(Igs)含量高的IHC实验时效果更好。 多重染色实验时，由于同时使用多个一抗和对应的二抗，每种二抗有和其他一抗之间交叉反应的风险。例如同时使用兔抗和小鼠抗进行双染实验时，应使用针对小鼠血清预吸附的抗兔二抗，和针对兔血清预吸附的抗小鼠二抗。 而IHC实验中如果所用样本中内源性免疫球蛋白(Igs)含量高，二抗也有与样本本身免疫球蛋白交叉反应的风险。如对人组织样本进行染色时，应使用对人血清预吸附的HRP二抗。 菲恩生物提供的抗体种类广泛，涵盖了肿瘤、神经生物学、肝细胞、信号传道、表观遗传学、心血管生物学、免疫学、代谢、细胞生物学等研究领域，还包括单克隆抗体、多克隆抗体、标记的抗体和未标记的抗体。其中多克隆抗体是经过抗原亲和纯化的特异性IgG。菲恩生物提供10，000多种抗体产品,可用于大多数动物物种。
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细胞因子的原理与应用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
原理 为了维持机体的生理平衡，抵抗病原微生物的侵袭，防止肿瘤发生，机体的许多细胞，特别是免疫细胞合成和分泌许多种微量的多肽类因子。它们在细胞之间传递信息，调节细胞的生理过程，提高机体的免疫力，在异常情况下也有可能引起发烧、炎症、休克等病理过程。这样一大类因子已发现的有上百种，统称为细胞因子，包括淋巴细胞产生的淋巴因子、单核细胞产生的单核因子、各种生长因子等。许多细胞因子是根据它们的功能命名的，如白细胞介素(IL)、干扰素(IFN)、集落刺激因子(CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)、红细胞生成素(EPO)等。 作用 细胞因子通过结合细胞表面相应的细胞因子受体而发挥生物学作用。细胞因子与其受体集合后启动复杂的细胞内分子间的相互作用，最终引起细胞基因转录的变化。 参与免疫应答与免疫调节，调节固有免疫和适应性免疫应答;刺激造血功能;刺激细胞活化、增殖和分化;诱导或抑制细胞毒作用，诱导其凋亡。细胞因子的作用方式:1.自分泌作用。2.旁分泌作用。3.内分泌作用。 细胞因子的作用特点:多效性、重叠性、协同性、拮抗性和双重性。 细胞因子研究具有非常重要的理论和实用意义，它有助于阐明分子水平的免疫调节机理，有助于疾病的预防、诊断和**，特别是利用基因工程技术生产的重组细胞因子已用于**肿瘤、感染、炎症、造血功能障碍等，并收到良好疗效，具有非常广阔的应用前景。 细胞因子正逐渐作为佐剂用于疫苗的研制，如白介素-2、IL-12等。
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八仙过海，各显神通-G-Bioscience Focus系列抽提试剂盒
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
蛋白样本制备的目标简言之“三高”，保留活性高，回收产量高，工作效率高。“三高”是苦中作乐的说法，说的轻松，这头一条“保留活性高”便是蛋白样品制备的痛中之痛----样品制备过程导致的蛋白变性和随后的复性工作是很令人头痛的问题。这些年来以G Biosciences为代表的以蛋白质研究为核心研发的公司开发了一系列蛋白抽提试剂，大大简化了样品制备工作的烦恼，更重要的是保证实验结果的可重复性。 八仙过海，各显神通-Focus系列抽提试剂盒，让你的抽提不再是事儿！ 针对各种常见样本的抽提，G Biosciences旗下的Focus系列抽提试剂盒可谓是八仙过海，为你带来了是蛋白质样本抽提综合解决方案。如果你的目的是研究蛋白质特性，把时间都耗在纯化过程中那太费时间，看准目标，蛋白纯化也可以连同初步纯化一步到位。这类试剂盒通常在裂解细胞的同时利用某些共性初步分离蛋白质，令产品分段收集，使得在后继的电泳分析中减少背景蛋白的复杂程度，提高蛋白电泳分辨率。下面让我们对这些“神通”一一进行解析。 各显神通之第一式-哺乳动物蛋白质组抽提 FOCUS™ 哺乳动物蛋白质组抽提试剂盒-从哺乳动物样本中抽提和溶解几乎所有的蛋白，包括膜蛋白和可溶性蛋白，通过一个强烈的离液剂抽提缓冲液来溶解甚至最难溶解的蛋白。适用于哺乳动物组织和贴壁&悬浮细胞等生物样本。它可以一步提取实验步骤，同时提供有一个强烈的离液剂抽提缓冲液，用于50X100mg动物组织或50微升湿细胞团样本制备应用，从哺乳动物组织和细胞中提取总蛋白，适用于样本制备用于2D凝胶电泳和其他应用。 各显神通之第二式-蛋白质组分级分离 FOCUS™蛋白质组分级分离试剂盒-用来将复杂的生物样本分级分离为胞质蛋白和膜蛋白。最终得到的膜蛋白随后分级分离成周边蛋白和膜内嵌蛋白或脂筏相关的蛋白和去污剂溶解的膜蛋白。该试剂盒可以进行大于50次的实验，它的“法力”包括：用于分级分离内嵌蛋白，周边蛋白以及脂筏相关蛋白的组分，分级分离复杂的蛋
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蛋白样品制备详解—概念篇
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
蛋白样品制备是许多实验重要的第一步，蛋白样品由于其结构特性各异，又必须使其完全溶解和尽可能少的化学修饰，所以不可能有一个通用的技术，只能通过大量的实验来积累经验。正如开篇所引用的两句话中包含的深意：在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程，规范的操作手段来确保蛋白研究的完整性，也需要将其看成是独特而奇妙的个体，结合以往经验但又不拘泥于经验，才能真正揭开她神秘的面纱。2012年让我们一起来回顾一下这一重要技术及值得关注的产品。 1.为什么要进行样品制备 “为什么要进行样品制备？电泳的目的不就是分离吗？”刚接触双向电泳的小菜鸟有可能就会这么问。这个问题很好回答，这是由于目前双向电泳一般只能分辨到1000-3000个蛋白质点(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此样品的预分离制备是必须的。另外比如像对临床组织样本进行研究，寻找疾病标记的蛋白质组学研究目的，由于临床样本都是各种细胞或组织混杂，而且状态不一，如肿瘤组织中，发生癌变的往往是上皮类细胞，而这类细胞在肿瘤中总是与血管、基质细胞等混杂。所以常规采用的癌和癌旁组织或肿瘤与正常组织进行差异比较，实际上是多种细胞甚至组织蛋白质组混合物的比较，而蛋白质组研究的通常是单一的细胞类型，因此需要进行有效的样品制备。 但是为什么要进行不同步骤的样品制备呢？这不仅仅是由于蛋白本身不同，所以需要不同方法来配合，而且在制备样品的时候，首先需要明确的是什么是实验的最终目的：是分离尽可能多的蛋白还是分离样品中某些感兴趣的蛋白，这些直接决定了你的制备方法，也决定了实验的成功与否。由于想要分离的蛋白必须是完全溶解的，溶解的效果取决于裂解、破碎、沉淀、溶解的过程以及去污剂的选择和各种溶液的组成，因此如果是只对样品中的一部分蛋白感兴趣，可采取预分离的方法，如欲分析的蛋白来自细胞器（细胞核、线粒体和原生质膜），则应先采取超速离心或其他方法将细胞器分离出来再溶解蛋白；如
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蛋白样品制备详解—蛋白质保护篇
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
蛋白质是成分高度复杂的，复杂的生物大分子包括1个或多个长链氨基酸. 蛋白或肽折叠形成二级和三级结构， 和其他蛋白亚基相互作用来形成四级结构。蛋白是在结构上彼此不同的同时出于稳定性和活性的目的要求不同的周边环境. 蛋白当脱离他们天然的环境后是非常容易降解，变性和沉淀的。 在蛋白抽提过程中，细胞和细胞器膜是被破坏掉从而释放蛋白到溶液中使蛋白高度不稳定. 蛋白是暴露在溶液中不同的PH值，离子强度，温度和蛋白酶中. 尽管所有的蛋白是不同的他们要求不同的参数比如稳定性，溶解性和活性, 然而一些因素如果处理好的话可以保证活性蛋白的抽提，能够在蛋白抽提过程中保护蛋白的组分或者因素如下: 缓冲液组分: 在蛋白抽提过程中为蛋白提供适宜的缓冲液环境是非常重要的，这样蛋白可以应付突然变化的PH值。如果蛋白抽提裂解缓冲液不是蛋白适宜的缓冲液蛋白会很容易发生不可逆的变性。 一个好的蛋白抽提缓冲液必须在要求的PH值下有很强的缓冲能力，水溶性，化学稳定性，和加到蛋白抽提溶液中的其他添加物的兼容性，以及蛋白下游应用的兼容性。 大部分常规使用的生物缓冲液有 pKa 大约 7因此可以用于生理PH值下。 常用的生物缓冲液的是磷酸盐，Tris, MOPS 和HEPES. 这些缓冲液通常使用在 20 mM浓度以上来保证足够的缓冲能力. 抽提时的温度: 来自于哺乳动物细胞的蛋白适合于他们活性的温度大约 37 °C以及许多来自于生长在37°C细菌的细菌蛋白也有蛋白稳定性的最适温度在37°C。鉴于此，我们可以预计成功的蛋白抽提在室温进行。然而溶液中的蛋白在室温中会发生降解因为溶液中蛋白的环境和细胞中的环境是不同的。溶液中蛋白没有受到如同细胞中伴侣的保护。除此之外蛋白由于存在于溶液中的内源蛋白酶从而容易发生降解。细胞中的内源蛋白酶在细胞中存在特定的小室中因此不能降解所有的细胞蛋白。蛋白酶的活性在 4°C 时会减弱通常来说蛋白的抽提应该在冰上进行从而得到活性蛋白。 细胞裂解和蛋白抽提缓冲液的
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单链建库技术之革新产品,Swift RNA建库试剂盒
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
Swift 拥有的Adaptase技术，可以同时进行单链DNA的加尾和接头连接反应。高效率的Adaptase反应，允许起始量低至单个细胞。不依赖模板的化学反应，提供碱基偏好性的全面覆盖文库。该技术已经应用到多种Swift文库构建试剂盒中，包括Swift标准RNA建库试剂盒和快速RNA建库试剂盒。 两款建库试剂盒均能接受较为宽泛的样本起始量，产出优秀的测序数据，深化、加速您的RNA-seq研究。试剂盒借助Adpatase技术，利用第一链cDNA模版，可以构建链特异性RNA文库，无需常规的第二链cDNA合成。 Swift RNA-Seq Workflow Swift Rapid RNA-Seq Workflow 标准建库试剂盒支持低至100pg mRNA或10ng总RNA。对于低起始量和困难样本，试剂盒均可以保持高质量、高稳定性表现。快速建库试剂盒只需要3.5个小时，便能完成建库，相比较同类产品，为市面上最快。非常简单的工作流程，以最少数量的试剂组分和纯化步骤，节省您的时间和精力。 两款建库试剂盒均可搭配使用 Normalase，简化上机测序前文库均一化处理流程。通过两步酶促反应，已扩增的文库不到一个小时即可得到等摩尔 pooling 文库。更多关于 Normalase 的介绍，请参考 ： 【Swift Normalase试剂盒】 NGS文库均一化革命性技术 Tips Swift虽然不提供自动化平台和耗材，但我们与诸多自动化解决方案提供商和终端客户保持有密切合作关系，共同开发适用于自动化平台的优化脚本，并且在24、96和384反应试剂盒中均提供了超过10%的额外试剂，以适应自动化需求。 如果您有这方面的需求，欢迎与我们联系。
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淋巴细胞分离液分离原理和使用
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
淋巴细胞分离液是一种根据细胞密度差异，借助离心产生的重力加速度，进行细胞的分离纯化的常用试剂。常用的淋巴细胞分离液有Ficoll淋巴细胞分离液、Percoll淋巴细胞分离液。Ficoll与Percoll分离单个核细胞的方法均为密度梯度离心法。 分离原理：外周血中单个核细胞和单核细胞,其体积、形态和密度与其他细胞不同，淋巴细胞分离液是一种密度介于1.075~1.090之间而近似于等渗的溶液,用它做密度梯度离心,使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。 淋巴细胞分离液的使用方法： 1、准备无菌的15ml离心管或锥形管； 2、加入淋巴细胞分离液3ml；（注意：淋巴细胞分离液使用前需恢复室温，18-25℃）3、Hank~s液或PBS缓冲液1:1比列（如果全血样本粘稠，可适当增大比例）稀释抗凝过的全血样品。4、小心沿着壁管，接近分离液层面，非常缓慢地加入新鲜的稀释过的全血样品在淋巴细胞分离液上面；（切记不要搅浑淋巴细胞分离液）5、小心放进离心机（水平转子），4℃离心20-30分钟，速度为400g-1000g；（注意：离心机刹车应取消，需等待自然停止）6、小心取出离管，切记不要震动；7、可见上层为淡红色透明血浆，其次为薄薄的只密白色环，白色环卫单核细胞淋巴细胞。
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ELISA实验中常遇到的问题、产生的原因与解决办法
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
酶联免疫吸附实验，简称为 ELISA。ELISA 实验是一种非常经典的免疫学实验。虽然历史非常悠久了，但是还是不断地在临床和基础研究中得到应用。其主要用于：免疫酶染色各种细胞内成份的定位；研究抗酶抗体的合成；显现微量的免疫沉淀反应；定量检测体液中抗原或者抗体成份。小编总结了一些经验教训。遇到的问题，可能的原因，解决方法。供大家参考。 问题 1：阳性与阴性不能达到 2.1 的比值，阴性颜色太深。 可能的原因：阴性对照（也就是阳性对照的除目标抗原外的其它成分）中有某种成分与一抗作用。 解决的方法：纯化抗原除去干扰成分。 问题 2：阳性与阴性不能达到 2.1 的比值，阳性颜色太浅。 可能的原因有 3 个： 1）一抗效价不好。 2）抗原太稀。 3）封闭时间过长。 解决的方法： 1）换用一抗或增加一抗用量。 2）增加抗原浓度。 3）缩短封闭时间，封闭时间一般 37 摄氏度 3 个小时，或者 4 摄氏度过夜。不能比这个更长了。 问题 3：增加抗原浓度，一抗浓度不变，显色反应没有表现出应有的梯度。 可能的问题： 一抗与抗原的比例已经饱和。 解决的方法： 增加一抗用量; 或在一抗用量不变的情况下减少抗原浓度做梯度。 问题 4：增加一抗浓度，显色反应没有表现出应有的梯度。 可能的原因：一抗与抗原的比例已经饱和。 解决的方法：增加抗原用量；或在抗原用量不变的情况下减少一抗浓度做梯度。 问题 5：加完 TMB 显色后颜色梯度很明显，但加了硫酸终止反应后颜色梯度没有那么明显了。 可能的原因：硫酸可能把其它成分都炭化了。 解决的办法：加少一点硫酸，参考值：50 μlTMB+35 μl 硫酸；或者采用 1M 的 HCL 作为终止液，50ulTMB+50ul1M HCL。 这些步骤里面，一抗和封闭是两个关键。如果 ELISA 做不出满意的结果，首先应该从这两个方面改进。Elisa 实验看似简单，其实不然。别小瞧了ELISA。光是一个加样就有很多讲究。 ELISA 中加样须注意如下问题： 吸取样品时，加样枪吸头不
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如何提高蛋白转印效率
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
质量差的蛋白转印在免疫印迹的过程中会导致要么比较弱的信号要么没有信号. 尽管质量差的蛋白转印时有发生，科学家们通常不把它作为一个免疫印迹实验失败的原因。因此，当需要排除质量差的信号的原因时转膜的质量好坏需要首先被考虑. 导致转膜差的原因 质量差的蛋白转印可能发生在抗原水平低的情况下。这种情况的发生通常是因为要么转膜步骤差或胶没有足够的装载. 在实验室中，这在免疫印迹中会作为错误发生从而导致信号的缺失。为了使转印成功膜需要有更高水平的抗原.也会有转印膜自己的问题或者操作时间长短，因为蛋白转印或许需要更长时间取决于实验人员使用的产品. 如果一个蛋白转印被中断或者没有给与足够的时间, 那么转印或许不能产生足够强度的信号。 另外一个导致质量差转膜的原因是抗体浓度。如果浓度太高或太低, 那么会有很少或者没有信号的转移。 你可以分辨出浓度是否太高因为棕色/ 微黄色的条带会在膜上出现被捕获的气泡会提供一个天然屏障对于蛋白转印，这会导致膜和转印的区域是空白的。在真正印迹的过程中很难识别这些捕获的气泡, 这会导致印迹的失败而没有任何物理的暗示为什么会失败。 阻止和检测质量差的蛋白转印 因为蛋白转印经常被忽视, 实验室人员或许想要整合蛋白确认的过程. 蛋白转印可以通过使用反向染色来进行确认，这会发现任何特定性的问题比如大气泡这些气泡会阻止某些区域不能得到转印。 有很少的方法可以解决气泡问题. 反而，较好的方法是检测印迹来看是否有气泡。不进行染色的话， 大大部分气泡不会被注意到从而导致最终信号的缺失。 除了染色的方法之外，也有其他的产品，比如 Swift Transfer Pads, 它可以用于降低必要的蛋白的转膜时间阻止潜在的问题发生，比如过热. 他会降低蛋白转膜不完全的比率。Swift Transfer Pads可以用于任何类型的蛋白，但是对于特别高分子量的蛋白转膜很有帮助。有高分子量的蛋白或许需要更长的转膜时间同时有很大的可能得到质量差的转膜
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如何提高透析的效率
作者：德尔塔 日期：2022-03-31
在生物化学中，透析是在大分子样本溶液中通过选择性和被动扩散的原理分离小分子和不想要的化合物的过程。 通常来说，样品和缓冲液溶液（透析液）放到膜的相反面上。因为透析通过扩散发生作用，分子会自然的从高浓度到低浓度区域进行移动直到达到平衡点。从而协助样品和透析液分子的分离。 因为大分子不能通过膜孔径，他们会在容器的样品面得到保留。然而，我们不想要的分子 (包括盐类缓冲液 (Tris 和PBS), 还原剂 (DTT, BME), 防腐剂比如硫汞撒以及非反应的交联剂或标记试剂比如 sulfo-SMCC 和 生物素), 这些分子在尺寸上非常小，可以非常容易的扩散出半透膜到透析液中。 这降低了样品中目标分子的浓度直到整个溶液达到了平衡。 通常来讲，透析的速率很慢因为它接近平衡后你需要改变透析液，几小时后重新建立可以驱动透析的浓度差. 通过使透析进行到平衡在改变透析液缓冲液之前，你能够纯化在透析膜上浓缩得到的物质通过样品体积和缓冲液体积之间的因子比例. 透析步骤 由于涉及到每一个样品的变量很多，所以透析的完成点是多少有些主管的判断，没有通用的透析步骤可以适用所有的应用。记住，这里提供一个典型的透析步骤可以用于蛋白样品。 1.预润湿或制备透析膜根据厂家的指导. 2.将样品上到透析管或透析装置中. 3.在室温透析1-2小时. 4.改变透析缓冲液透析另外1-2个小时. 5.改变透析缓冲液4°C透析过夜. 样品和透析液组成的不同创造了一个跨膜的浓度差，这驱动了整个过程的发生。因为如此，你应该使用一个高缓冲液对样品的体积比来维持这个浓度梯度。为了得到结果，确保你的透析液是样品体积的 200 到 500 倍. 透析液缓冲液改变的次数以及透析的时间都会影响你的结果。 提高透析的效果 通常来讲，你可以提高实验的速率和效率通过控制影响扩散的因子。 ·加热. 加热影响分子的热动力学这样你可以加速扩散和透析通过增加温度。然而，请记住你的目标蛋白分子的热稳定性是非常重要的和你的实验
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