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培养基NK细胞的制备研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
NK细胞的制备方法，即通过联合细胞因子和饲养细胞的刺激作用，提高NK细胞的增殖速度和纯度。本发明的主要特点是：NCR3LG1和m?IL-15同时转染到K562细胞，m?IL-15可以调节NK细胞的活化和增殖，而NCR3LG1作为NK细胞表面主要的活化受体之一NKp30的配体，可以有效的刺激NK细胞活化，且两者有协同作用。本发明提供出一种联合饲养细胞和游离因子共同培养制备NK细胞的方法。 1.NK 细胞的制备：悬浮NK 于接种培养液中，细胞浓度调至106/ml。 2.培养基接种NK 细胞 1）于4℃用300×g 离心饲养细胞12min。 2）被离心的饲养细胞悬浮于饲养培养液中，细胞浓度调至2×106/ml。 3）用强度5000radγ射线照射饲养细胞，于4℃用300×g 离心饲养细胞12min，将离心细胞再悬浮于饲养细胞培养液中，饲养细胞浓度调至2×106/ml。 4）在6 块96 孔培养板的各孔中加100μl 上述饲养细胞悬液（总量用60ml 饲养细胞悬液，含1．2×108 个饲养细胞）。 5）将96 孔板置37℃孵箱预温，直到加入NK 细胞。 6）将NK 细胞悬浮于接种培养基液中，并于预温的96 孔板中加入100μlNK 细胞，使成为10 细胞/孔、5 细胞/孔和2．5 细胞/孔的三种类型板，而且每种类型重复二块板。 7）将培养板置5％CO2 孵箱中37℃培养。 3.NK 细胞的再刺激（接种后2－3 天，主要依赖于饲养细胞） 1）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液。 2）每孔中加入含有经照射的饲养细胞（2×106 细胞/ml）的NK 克隆培养液100。此培养液的制备方法如下： （1）融化饲养细胞，移至50ml 试管中。 （2）轻轻地加入培养液30ml，混匀后用5000radγ射线照射饲养细胞。 （3）用300×g 离心饲养细胞12min，并计数饲养细胞数量。 （4）按细胞计数结果，将饲养细胞悬浮于NK 克隆培养液中，调至细胞浓度为2×106/ml。 4.换液（6－8 天）从每孔中轻轻移弃100μl 上清液，并加入新鲜NK 克隆培养液100μl。 5.检测NK 细胞的生长状况（9－10 天）如检查有细胞生长，按第8 天的操作换液。 6.分
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大鼠组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）ELISA
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
本试剂仅供研究使用目的：本试剂盒用于测定大鼠血清，血浆及相关液体样本中组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）的含量。 实验原理： 本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）水平。用纯化的大鼠组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入t-PA，再与HRP标记的组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成zui终的黄色。颜色的深浅和样品中的t-PA呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠组织型纤维溶酶激活剂（t-PA）浓度。 样本处理及要求： 1、血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。 2、血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。 3、尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。 4、细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。 5、组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。 6、标本
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ELISA试剂盒物的催化作用相结合起来
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
ELISA试剂盒技能原理：以免疫学反响为根底，将抗原、抗体的特异性反响与酶对底1. 抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶符号。2. 结合在固相载体外表的抗原或抗体仍保持其免疫学活性。3. 酶符号的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。4. 受检标本与固相载体外表的抗原或抗体起反响。再参加酶符号 的抗原或抗体，也经过反响而结合在固相载体上。5. 此刻固相上的酶量与标本中受检物质的量呈必定的份额。6. 参加酶反响的底物后，底物被酶催化变成有色产品，产品的量 与标本中受检物质的量直接有关，故可根据呈色的深浅进行定 性或定量分析。测定办法具有很高的敏感度（pg-ng/ml水 平），而且重复性好。ELISA试剂盒样本处理及请求：1. 血清：室温血液天然凝结10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。细心搜集上清，保留过程中如呈现沉积，应再次离心。2. 血浆：应根据标本的请求挑选EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。细心搜集上清，保留过程中如有沉积构成，应当再次离心。3. 尿液：用无菌管搜集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。细心搜集上清，保留过程中如有沉积构成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。4. 细胞培养上清：检查排泄性的成份时，用无菌管搜集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。细心搜集上清。检查细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度到达100万/ml左右。经过重复冻融，以使细胞损坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。细心搜集上清。保留过程中如有沉积构成，应再次离心。5. 组织标本：切割标本后，称取重量。参加必定量的PBS，PH7.4。用液氮敏捷冷冻保留备用。标本消融后仍然保持2-8℃的温度。参加必定量的PBS（PH7.4），用手艺或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。细心搜集上清。分装后一份待检查，其余冷冻备用。6. 标本收集后尽早进行获取，获取按有关文献进行，
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如何判定原装ELISA试剂盒的效果标准？
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
对原装ELISA试剂盒的研究表明 *大鼠ELISA试剂盒进行了研究，应用双抗体夹心法测定标本中大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)elisa试剂盒水平。通过标准曲线计算样品中大鼠性激素结合球蛋白(SHBG)elisa试剂盒浓度。原装ELISA试剂盒的效果标准如何判定。原装ELISA试剂盒的应用，它的判断标准是什么，对于它的研究有何结果。 原装ELISA试剂盒的应用 利用基因定点修饰技术CRISPR-Cas系统，可快速地在单倍体干细胞上进行定位的基因修饰或敲除，并且处理后的细胞仍能维持单倍体和多能性状态。尤为重要的是，该工作证明了大鼠单倍体胚胎干细胞同样具有替代精子与卵母细胞“受精”并产生健康大鼠的能力。 如何去判断原装ELISA试剂盒检测结果 加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜色明显深于阴性对照;与阴性对照的颜色接近者，判定为阴性。 以样品孔的OD值大于阴性对照OD值+2～3SD，作为阳性结果的阈值。 以P/N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于或等于2.1为阳性;P/N值小于2.1，但大于1.5为可疑;P/N小于1.5为阴性。 定量测定结果根据标准曲线计算样品中待测物的含量。
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ELISA试剂盒标本及采集、贮运因素
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
ELISA试剂盒进口大鼠标本及采集、贮运因素：（1）ELISA试剂盒进口大鼠严重溶血，以HRP 为标记的ELISA 测定中，残留在孔内的血红蛋白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性； （2）混有红细胞的血清 易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；（3）如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应； （4）标本凝固不全，有时为了争取时间快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残留部分纤维蛋白原，在ELISA 测定过程中可以形成肉眼可见的纤维蛋白块，易造成假阳性结果； （5）采血试管洗涤不彻底、ELISA试剂盒进口大鼠反复使用易交叉污染； （6）塑料试管能吸附抗原物质 ，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成假阴性。 ELISA结果判定常用的几种方法：1）目测定性法：加入底物经酶解和终止反应后，肉眼观察阳性孔颜色明显深于（竞争法则浅于）阴性对照；与阴性对照的颜色接近者，判定为阴性。2）以样品孔的OD值大于阴性对照OD值+2～3SD，作为阳性结果的阈值。3）以P／N值（阳性孔OD值／阴性孔OD值）大于或等于2．1为阳性；P／N值小于2．1，但大于1．5为可疑；P／N小于1．5为阴性。4）ELISA试剂盒进口大鼠定量测定结果根据标准曲线计算样品中待测物的含量。
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青海发光杆菌染色技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
青海发光杆菌染色通常只用一种染色剂，使细菌整个细胞染上颜色。但看不清结构。所以只便于检查细菌的形态、大小和排列方式等。 【实验目的】 1、掌握单染色的操作技术 2、观察细菌的基本形态 【实验原理】 单染色即用单纯的种染料进行染色，多数采用美蓝、结晶紫或石碳酸复红等碱性染料。此法仅能显示细胞的外部形态，而不能辨别其内部结构。染色前必须将细胞固定，其目的是杀死细菌，并使它粘附在载玻片上。此外，还可以增加菌体对染料的亲和力。常用的有加热和化学固定两种方法。无论用哪种方法都应尽量使细菌维持原有的形态，防止细胞膨胀或收缩。 青海发光杆菌【实验材料、药品及器具】 1、菌种 大肠杆菌（Escherichia coli） 枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis） 2、染色液 石炭酸品红染色或结晶紫染色液（Stining Solutions） 3、无菌水 4、洗瓶装蒸馏水 5、洗净的载玻片（Slicle）5片 6、显微镜、香柏油、接种环、酒精灯、擦镜纸、吸水纸、二甲苯 【实验步骤】 1、涂片：取一片干净无油载玻片，在其中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好的大肠杆菌，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。 2、固定：将涂好的玻片在空气中风干或火焰上通过3～4 次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。 3、染色：用石炭酸品红或结晶紫染色剂30~60S，然后用洗瓶轻轻冲洗染色剂（注意不要直接冲洗染色部位），直至无多余的染液，晾干或用吸水纸从旁吸干或用微火烘干。 4、用同样方法将枯草芽孢杆菌制作一张涂片。 5、镜检：首先在低倍镜下找到物像，然后在涂膜中央滴一滴香柏油，换成油浸镜观察两个菌种的形态和排列。 6、去除油镜上的香柏油：先用干净的擦镜纸擦2-3 次，再换另一张擦镜纸蘸取少许二甲苯以除去残留的香柏油，zui后用擦镜纸擦干。擦镜头时应顺着镜头直径方向擦，不要沿着圆周方向擦。 青海发光杆菌【实验结果】 1、绘制观察到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的形态图，
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抗原elisa试剂盒常用方法的对比
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
抗原elisa试剂盒法可分为多种类型测定，是一种广泛应用在测定液体样本中的蛋白、抗体、或激素的免疫分析技术。 我公司技术部将各种ELISA常用方法的优势劣势进行对比，结果如下：一、直接法：将抗原直接固定在固相载体上，加入酶标记的一级抗体，即可测定抗原总量，此一级抗体的特异性非常重要。优势：操作手续简短，因无须使用二抗可避免交互反应。劣势：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。二、间接法：此测定方法与直接法类似，差别在于一级抗体没有酶标记，改用酶标记的二级抗体去辨识一级抗体来测定抗原量。优势：二抗可以加强信号，而且有多种选择能做不同的测定分析。不加抗原elisa试剂盒酶标记的一级抗体则能保留它zui多的免疫反应性。劣势：交互反应发生的机率较高。三、双抗体夹心法：被检测的抗原包被在两个抗体之间，其中一个抗体将抗原固定于固相载体上，即捕捉抗体。另一个则是检测抗体，此抗体可用酶标记后直接测定抗原的量；或不标记，再透过酶标记的二级抗体来测定抗原的量。这两种抗体必须小心选取，才可避免交互反应或竞争相同的抗原结合部位。优势：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化。劣势：抗原一定得拥有两个以上的抗体结合部位。更多抗原elisa试剂盒技术问题我们都可解答！我公司供应进口、国产ELISA试剂盒，种属包括人、大鼠、小鼠等，质量保证，价格优惠，有意向咨询购买的顾客可以我司业务员。
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ATCC菌种的临床应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
ATCC菌种属多烯类抗真菌药，具有广谱抗真菌作用，但经皮肤黏膜不吸收，口服后血药浓度极低，临床上局部应用且疗效不理想。据文献报道，其新剂型制剂不仅提高了局部外用的效果，而且扩大了其用途。1制霉菌素脂质体注射剂由Aronex研制，目前处于Ⅲ期临床试验末期。**念珠菌感染109例念珠菌血症患者，其中91例每日剂量2mg/kg，另18例4mg/kg静脉给药，平均疗程10.6天。56例可评价患者中50例有效。临床免疫力低下的感染人群，对两性霉素B或氟康唑不敏感的念珠菌感染中60%对本品敏感，静脉给药可使80%患者*。**曲霉感染应用本品**24例不能耐受两性霉素B或**无效的侵袭性曲霉病患者，ATCC菌种每日静脉滴注4mg/kg，19例可评价患者中6例有效。**隐球菌感染**隐球菌性脑膜炎，每日静脉使用本品4mg/kg的疗效与两性霉素B每日0.7mg/kg相仿。经验**粒细胞缺乏伴发热患者27例反复发热的粒细胞缺乏患者经本品**8天，其中10例（37%）获满意的临床效果。不良反应常见的不良反应有低血钾（25%）、肾功能损害（每日剂量>6mg/kg时可能发生）。快速静滴可能导致寒战、发热、呼吸困难，偶有皮疹、肝功能损害，但通常不影响**，无需停药。每片含制霉菌素10万U，**单纯外阴阴道念珠菌病120例，年龄20~50岁，连续1周使用本品，2片/d，用药前使用2%~4%碳酸氢钠清洗外阴，以达克宁栓作对照，结果总有效率93.3%，与达克宁组差异无显著性。制霉菌素甘油涂布剂**新生儿鹅口疮患者为男性新生儿，15天，因肺炎使用抗生素**后，口腔黏膜、舌面出现片状白色奶块状物，口服制霉菌素片和制霉菌素水混悬液15天，症状时轻时重。改用制霉菌素10万U/ml甘油涂布患处，3次/d，2天后*，再未复发。姜氏报道使用本品**69例小儿患者，zui小42天，zui大9个月，总有效率70%，显著优于使用珠黄散的对照组。**霉菌性口腔炎本组67例，男42例，女25例，年龄zui大者76岁，zui小者4岁，临床表现为口腔黏膜覆盖白色假膜，重者两颊、硬腭、齿龈及舌面均可布满。**方法：先用2%~4%碳酸
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培养基的几种类型
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
在即用型平板培养基实验室中配制的适合微生物生长繁殖或累积代谢产物的任何营养基质，都叫做培养基。由于各类微生物对营养的要求不同，培养目的和检测需要不同，因而培养基的种类很多。我们可根据某种标准，将种类繁多的培养基划分为若干类型。1、根据对培养基组成物质的化学成分是否完全了解来区分，可以将培养基分为天然培养基、合成培养基和半合成培养基。（1）天然培养基是指利用各种动、植物或微生物的原料，其成分难以确切知道。用作这种培养基的主要原料有：麦芽汁、蛋白胨、酵母膏、玉米粉、麸皮、各种饼粉、马铃薯、牛奶、血清等。用这些物质配成的培养基虽然不能确切知道它的化学成分，但一般来讲，营养是比较丰富的，微生物生长旺盛，而且来源广泛，配制方便，所以较为常用，尤其适合于配制实验室常用的培养基。这种培养基的稳定性常受生产厂或批号等因素的影响。（2）合成培养基是一类化学成分和数量完全知道的培养基，它是用已知化学成分的化学药品配制而成。这类培养基化学成分、重复性强，但价格昂贵，而微生物又生长缓慢，所以它只适用于做一些科学研究，例如营养、代谢的研究。（3）在合成培养基中，加入某种或几种天然成分;或者在天然培养基中，加入一种或几种已知成分的化学药品即成半合成培养基。例如马铃薯蔗糖培养基等。这种即用型平板培养基在生产实践和实验室中使用zui多。2、根据培养基的物理状态来区分，可以分为固体培养基、液体培养基和半固体培养基。（1）液体培养基所配制的培养基是液态的，其中的成分基本上溶于水，没有明显的固形物，液体培养基营养成分分布均匀，易于控制微生物的生长代谢状态。（2）固体培养基在液体培养基中加入适量的凝固剂即成固体培养基。常用作凝固剂的物质有琼脂、明胶、硅胶等，以琼脂zui为常用。固体培养基在实际中用得十分广泛。在实验室中，它被用作微生物的分离、鉴定、检验杂菌、计数、保藏、生物测定等。（3）半固体培养基如果把少量的凝固剂加入到液体
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干细胞老化的表现及预防
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
干细胞在培养过程中如果环境不适合其生长就会出现部分细胞的老化现象。这是干细胞培养的一个难点也是经常出现的问题。本文描述干细胞老化时出现的迹象，以及其预防措施。干细胞老化的表现★ 细胞胞浆内特别是在核区附近出现黑色颗粒，表示细胞开始出现老化；★细胞胞浆内出现空泡，则表明该细胞已老化或者已经开始分化（在全部细胞中出现少数老化细胞是正常的）；★ 细胞立体感逐渐消失，细胞间的间隔不清，部分细胞扁平状，细胞的形状趋向多样；★ 贴壁性减退，出现一些漂浮的细胞；部分分泌强的细胞分泌物增多，细胞表面会比较脏；★ 细胞增殖速度明显下降，分裂相的细胞明显减少。干细胞老化的原因和预防1) 接种密度的影响：部分干细胞具有一定的分泌性能，能够分泌一些对细胞有支持能力的因子类物质；所以必须维持一定的接种密度，否则会导致细胞增殖减慢，zui后出现老化；2) 消化过度：消化细胞时会对细胞的表面蛋白有较强的损伤，所以消化的时间不能过长，使用合适浓度和pH 值的消化酶，否则会导致细胞老化和分化；3) 合适的密度的时候就要传代：细胞如果过密，接触抑制作用会导致细胞的活力减弱并影响增殖导致老化；4) 使用合适的血清和培养基：不同的干细胞对培养基特别是血清的要求不同，所以使用不同的培养用的血清进行筛选，寻找该干细胞培养的血清是预防细胞老化，维持细胞正常生长的重要保证。
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细胞培养技术注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
1. 原代细胞实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以 70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45° 角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台(至少 Class II)。操作过程中，应避免引起aerosol 之产生，小心****，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖锐针头之伤害等。 5. 定期检测下列项目： 5.1. CO2 钢瓶之CO2压力 5.2. CO2 培养箱之CO2浓度、温度、及水盘是否有污染(水盘的水用无菌水，每周更换)。 5.3. 无菌操作台内之airflow 压力，定期更换紫外线灯管及HEPA 过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000 小时/HEPA)。 6. 水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水 7. 认真按照操作规程进行实验，一般不大会导致污染，很多情况下是由于所用的试剂或培养基有污染而使实验失败，粉末培养基配制好后(加了血清)，一般在4度尽量不要超过1个月，如在-20度存放时间可长一些，但也不要超过3-4个月，可能对于永生化细胞株来说要求
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肿瘤细胞培养方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
肿瘤细胞培养成功关键在于：取材、成纤维细胞的排除、选用适宜的培养液和培养底物等几个方面。在具体培养方法方面，肿瘤细胞培养与正常组织细胞培养并无原则差别，初代培养应用组织块和消化培养法均可。1、取材：人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要，体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区，取材时尽量避免用退变组织，要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养，如因故不能立即培养，可贮存于4℃中，但不宜栽过24小时。2、培养基：肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低，正常细胞培养不加血清不能生长，肿瘤细胞在低血清培养基 中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大，是因肿瘤细胞有自泌（Autocrine）性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤细胞完全不需要这些成分。 按不同细胞需要不同的生长因子；肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子。 有的还需特异性生长因子〔如乳腺癌细胞等）。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。3、成纤维细胞的排除：成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长，致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快，zui终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。
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单克隆抗体制备---单克隆抗体的大量生产及鉴定
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
1.单克隆抗体的大量生产 大量生产单克隆抗体的主要方法： （1）体外使用旋转培养管大量培养杂交瘤细胞，从一清液中获取单克隆抗体。但此方法产量低，一般培养液内抗体含量为10～60μg/ml,如果大量生产，费用较高。 （2）体内接种杂交瘤细胞，制备腹水或血清。 2.单克隆抗体的鉴定 对制备的McAb进行系统的鉴定主要包括以下几个方面： （1）抗体特异性的鉴定 除用免疫原（抗原）进行抗体的检测外，还应该用与其抗原成分相关的其它抗原进行交叉试验，方法可用ELISA、IFA法。例如：制备抗黑色素瘤细胞的McAb，除用黑色素瘤细胞反应外，还应该用其它脏器的肿瘤细胞和正常细胞进行交叉反应，以便挑选肿瘤特异性或肿瘤相关抗原的单克隆抗体 （2）McAb的Ig类与亚类的鉴定 一般在用酶标或荧光素标记的第二抗体进行筛选时已经基本上确定了抗体的Ig类型。如果用的是酶标或荧光素标记的兔抗鼠IgG或IgM，则检测出来的抗体一般是IgG类或IgM类。至于亚类则需要用标准抗亚类血清系统作双扩或夹心ELISA来确定。在作双扩试验时，如加入适量的PEG（3%），更有利于沉淀线的形成。 （3）McAb中和活性的鉴定 用动物或细胞的保护实验来确定McAb的生物学活性。例如，如果确定抗病毒McAb的中和活性，则可用抗体和病毒同时接种于易感的动物或敏感的细胞，来观察动物或细胞是否得到抗体的保护。 （4）McAb识别抗原表位的鉴定 用竞争结合试验，测相加指数的方法测定McAb所识别抗原位点，来确定McAb的识别的表位是否相同。 （5）McAb亲合力的鉴定 用ELISA或RIA竞争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲合力。
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ELISA试剂盒的一些技术关键
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
1、细胞上清：前处理有必要把细胞离心去掉，每孔直接加100μl即可。假定浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。2、脑脊液：前处理有必要把细胞离心去掉，每孔直接加100μl即可。假定浓度太高需稀释时，用标准品稀释液直接稀释。3、血清血浆：请参与50ul样本分析缓冲液后加50ul标本,如稀释量大，请将样本与样本分析缓冲液等量参与，缺少部分用标准品稀释液赔偿至100ul。4、组织匀浆液的样本，要制备过程中需要在缓冲液中参与蛋白酶抑制剂，防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，构成查看效果的值偏低。
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细胞培养的一些问题
作者：德尔塔 日期：2022-04-02
细胞培养常见问题 1. 液体培养基的保存是冷藏好？还是冷冻好？ 要冷藏！！因为液体培养基经冷冻后再经溶化时，其溶液的pH值会发生改变，溶液往往变碱，某些成分溶解也会受到影响对细胞生长不利。故液体培养基一定要存放在冷藏箱中，通常液体培养基在冷藏条件下可存放6个月 ~ 一年。 2. 液体培养基中谷氨酰胺的作用，及使用方法。 几乎所有的细胞对谷氨酰胺有较高的要求，细胞需要谷氨酰胺合成蛋白质，在缺少谷氨酰胺时，细胞生长不良而死亡。所以，各种培养液中都含有较大量的谷氨酰胺。谷氨酰胺在溶液中很不稳定，应置-20 ◦C冰冻保存，用前加入培养基中。加有谷氨酰胺的液体培养基4 ◦C 冰箱储存两周以上时，应重新加入原来量的谷氨酰胺。基础医学细胞中心在其服务项目中配制分装了高浓度（100倍）的谷氨酰胺溶液（1ml/支）。每支1ml的谷氨酰胺加到99ml完全培养基中，其终浓度为2mM/ml培养基。包装为粉红色，-24◦C保存。 3.培养用液pH对细胞生长的影响 由于，大多数细胞适宜pH为7.2~7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。各种细胞对pH的要求也不完全相同，原代培养细胞一般对pH变动耐受差，无限细胞系耐受力强。 但总体来说，细胞耐酸性比耐碱性强一些，偏酸环境中更利于细胞生长。因此，我们在配制培养用液时，可把液体的pH稍微调得偏酸一些。液体在经过0.10um或0.22um滤膜过滤时，溶液的pH还会向上浮动0.2左右。 4.常用培养基及培养用液的渗透压范围 培养基名称 渗透压范围（mOSM） DMEM（高糖） 315 ~ 350 DMEM（低糖） 270 ~ 330 RPMI-1640 260 ~ 290 MEM-EBSS 280 ~ 310 MEM-NEAA 280 ~ 310 McCoy 280 ~ 310 MEM-a 280 ~ 310 M—199 275 ~ 305 IMDM 270 ~ 300 DMEM/F-12 280 ~ 310 F—10 270 ~ 300 F—12 275 ~ 300 培养基名称 渗透压范围（mOSM） L—15 280 ~ 320 D-Hanks 280 ~ 300 Hanks 280 ~ 300 PBS 275 ~ 300 5.细胞传代消化时所用胰酶浓度越高越好吗？ 不见得！因为胰蛋白
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