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抗生素、免疫力和肥胖
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
研究表明，幼年时给予小鼠低剂量的抗生素会导致成年后肥胖。 小鼠出生后不久给予一个短期的，低剂量的抗生素用量，对其肠道微生物具有持久的后果，而且啮齿类动物一到中年便会导致肥胖。这些研究结果，于今天（8月14日）发表在细胞学杂志上，表明肠道微生物在早期生命过程中是一个关键的时间窗口，可能影响代谢途径的发展。 几十年来，低剂量的抗生素用于在农业上促进动物生长，虽然药物增肥的机制还不清楚。美国纽约大学Langone医学中心Martin Blaser和他的同事在2012年一篇自然杂志上的文章显示，小鼠生命早期的抗生素**会改变小鼠体内激素水平和参与碳水化合物和脂质代谢有关基因活动的改变。 Blaser告诉科学杂志说，最新的这项研究，他和他的同事们的目的是更好地了解这些**的机制怎样介导了微生物对宿主代谢的影响。研究者利用两组低剂量青霉素处理的小鼠，一组是即将出生的小鼠，另一组是断奶时期的小鼠。第三组是在小鼠已经断奶后，给予抗生素。这些实验所使用的低剂量青霉素虽然的确导致了肥胖和肠道中优势菌群的比例倾斜，但不足以降低肠道内的微生物种群。 处理小鼠的肠道中乳酸菌水平显着低于未经处理的小鼠；另两种细菌，Candidatus和Allobaculum，通常在生命早期所占比例会达到峰值，却被小剂量青霉素抑制了。 麦迪逊大学的微生物学家Federico Rey 说，“我们通常看到，高剂量的抗生素减少微生物的多样性，但这是典型的“抗生素炸弹”，他没有参与这项工作。“此种情况下，抑制优势细菌可能会让其他物种蓬勃发展。” 与未经处理的小鼠相比，青霉素处理的断奶后小鼠加速增长，骨矿物质含量改变，并且脂肪和总体重增加。但是在生育前和养育过程中对母鼠进行处理，其对后代的影响更大。Blaser 说，“仅仅给小鼠喂四周抗生素就足以得到充分的效果，”他又说道，“基本上，越早，越强。” 抗生素处理加上高脂饮食可以加剧诱发肥胖的效果。抗生素诱导的微生物变化也会影响宿主肠细胞；研究者发现肠道免疫
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Novus血液肿瘤研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
常见的血液肿瘤主要包括各类白血病、多发性脊髓瘤以及恶性淋巴瘤。急性白血病占常见恶性肿瘤的第八位，淋巴瘤也是在前十位，并且发病率逐年升高，多发性骨髓瘤的整个发病率在血液恶性肿瘤里面占10%。 以下产品可用于多种常见血液肿瘤研究，急性淋巴细胞白血病（Acute Lymphoblastic Leukemia (ALL)是一种起源于淋巴细胞的B系或T系细胞在骨髓内异常增生的恶性肿瘤疾病。异常增生的原始细胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同时也可侵及骨髓外的组织，如脑膜、淋巴结、性腺、肝等。急性髓细胞白血病(acute myelocytic leukemia，AML)包括所有非淋巴细胞来源的急性白血病，是多能干细胞或已轻度分化的前体细胞核型发生突变所形成的一类疾病是造血系统的克隆性恶性疾病。淋巴瘤（Lymphoma）是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤，主要表现为无痛性淋巴结肿大，肝脾肿大。 相关产品列表： 急性淋巴细胞白血病相关抗体 Antibody Catalog No. Host Clone Reactivity Tested Application/s CD3 NBP2-25186 Ms OKT3 Hu FLOW CD19 NBP2-25196 Ms CD19 Hu FLOW, IHC IL2RA/CD25 NBP2-27425 Rt PC61 Ms FLOW CD44 NBP1-47386 Ms 8E2F3 Hu, Ms, Ca, Rb, Eq WB, ELISA, FLOW, ICC/IF, IHC, IHC-P Notch-1 NB100-78486 Ms mN1A Hu, Ms WB, FLOW, ICC/IF, IHC, IHC-P, IP 急性髓细胞样白血病相关抗体 Antibody Catalog No. Host Clone Reactivity Tested Application/s c-Kit NB100-77477 Rt 2B8 Hu, Ms FLOW, IHC, IHC-Fr, IP ETV6/Tel NBP1-80695 Rb poly Hu, Rt WB, ICC/IF, IHC, IHC-P Flt3/CD135 NBP1-43352 Rt A2F10 Ms FLOW, Func, IP Nucleophosmin NB110-
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植物miRNA及piRNA的逆转录
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
miRNA在植物的发育、抗病、和应激反应中发挥着重要作用。一般认为，这些小的非编码RNA通过靶向mRNA剪切，在后转录水平调节植物的基因表达。这些基因表达中的靶向变化由数百个成熟miRNA的差异表达所调控，每个成熟miRNA结合在靶mRNA的特定序列上。因此，对植物的成熟miRNA调控和表达进行分析，能够为植物的组织发育、干旱保护及疾病防御机理提供宝贵信息。目前基本无法通过qRT-PCR对植物的成熟miRNA进行分析，由于植物miRNA的特性，基于多聚腺苷酸的逆转录反应对其反应效率十分低下。QIAGEN推出了独特的解决方案，能够对植物组织中的成熟miRNA进行通用的逆转录反应。 QIAGEN miScript Plant RT Kit用于植物miRNA和其他3’端修饰的小RNA的cDNA合成；是针对具有3’端甲基化(2’-O-Me)修饰的小RNA进行无偏差 cDNA合成的通用型试剂盒。本试剂盒专为基于实时定量PCR技术的小RNA表达分析应用设计和优化，能够配合miScript SYBR Green PCR Kit和miScript miRNA PCR Array或miScript Primer Assay等产品使用。这一类通过功能验证的分析和芯片产品可应用于水稻、玉米、大豆、烟草和其他一些重要农业作物的检测，以及植物学相关的研究。在3’末端碱基具有2’-O-Me甲基化修饰的小RNA（如植物成熟miRNA和piwi互作RNA (piRNA)）中，一般不具有poly A尾结构，因此无法通过多聚腺苷酸依赖的cDNA合成方法有效地反转录。专用的miScript Plant RT Kit通过首先向植物miRNA的3’末端连接一个接头解决了这一难题。不同于多聚腺苷酸化，这一链接反应不会受到植物miRNA 3’末端碱基上存在的2’-O-Me甲基化修饰的负面抑制。接头一旦连接成功，即可实现反转录反应。 性 能 miScript Plant RT Kit与miScript Plant qPCR System的联合使用，能够确保针对植物样本实现灵敏和特异性的miRNA检测和定量工作。由于许多miRNA表达丰度很低，因此检测灵敏度对于确保获得可靠数据至关重要。miScript Plant qPCR System能够提供优异的灵敏度，宽广的动态
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Morris水迷宫：学习记忆的行为学研究方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
本实验由美国科学家Richard GMMorris于1981年建立。最初用于研究脑内结构对学习和记忆的调节作用，后来逐步发展成为目前最为常用的评价动物学习与记忆的模型。这一实验的基础是，啮齿类动物在水中有强烈的逃避水环境的动机，并以最快、最直接的途径逃离水环境。学会逃避水环境的过程体现动物的学习能力；根据周围环境进行空间定位，有目的地游往水中安全的地方（平台），体现动物的空间记忆能力。 （一） 实验设备 实验用大鼠或小鼠进行。大鼠水迷宫实验设备包括一个灰色或黑色圆形水池（直径200cm，高100cm；小鼠规格尺寸减半）、一个平台（直径10cm）、一台跟踪摄像机以及摄像机相联的计算机（图25-1）。池内盛水，深50cm，水温为摄氏22~24℃。平台置于水面下2cm（小鼠为1cm）。在水中加入奶粉或牛奶将水搅浑以免让动物看清水下平台。摄像机位于水池中央上方200cm，可记录动物的位置、游泳距离和时间（从而可计算出游泳速度）以及游泳路径等。房间周围墙壁上贴上色彩鲜明、形状不同的图画用为迷宫外暗示（extra-mazecues）。 （二） 实验方法 分获得性训练、探查和对位训练3个过程。 1．获得性训练（Acquisition phase）理论上将水池分为4个象限，平台置于其中一个象限区的中央。 （1） 将动物（大鼠或小鼠）头朝池壁放入水中，放入位置随机取东、西、南、北四个起始位置之一。记录动物找到水下平台的时间（s）。在前几次训练中，如果这个时间超过60s，则引导动物到平台。让动物在平台上停留10s. （2） 将动物移开、擦干。必要时将动物（尤其是大鼠）放在150W的白炽灯下烤5min，放回笼内。每只动物每天训练4次，两次训练之间间隔15~20min,连续训练5d。 2．探查训练(probe trial1) 最后一次获得性训练结束后的第二天，将平台撤除，开始60s的探查训练。将动物由原先平台象限的对侧放入水中。记录动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。
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频振式杀虫灯的全面分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
频振式杀虫灯是杀虫的利器，在特定的范围内散发光波，生态无污染的消灭害虫。下面就让我们从光、波、色、味四个方面来全面的了解下频振式杀虫灯吧。 1、频振式杀虫灯的光波作用。 (1)使昆虫在光波的干扰下活动周期延长，因此能使诱杀量增多。比如棉铃虫，每晚有3个活动周期，可以使混飞期、交配期、归巢期，如果每当活动期延长30分钟，就可以提高诱杀率。 (2)解决了杀虫灯在使用中的安全问题。灯光会根据波的频率不同自动调整电流，当有人体接触时，灯具立即进入安全保护状态。 (3)在下雨时空气湿度大时，以及因清理虫体时使电网出现短路，频振式杀虫灯就会进入安全保护状态，不会因短路使灯管烧坏。 2、频振式杀虫灯的颜色。 根据三色定理将灯具设计为黄色。夜间开灯时灯光变为黄绿色，这样就能使喜欢黄色的害虫大量扑灯，而喜欢绿色的草蛉、瓢虫等益虫则少扑灯，大大提高了害虫诱杀率。 3、频振式杀虫灯的味。 味也是引诱原理，在实际使用中发现，接虫袋内如有活虫存在，诱集的同类昆虫就会更多，证明了活虫会释放性信息素，可以提高诱捕率;因此，将频振式杀虫灯改进为不同昆虫扑灯有不同的电流量给以击伤，实践证明这一改进的思路是成功的。
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温湿度光照度对植物生长的影响
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
影响植物生长的因素很多，目前科学家已经确定了52种因素，如土壤有机质、土壤水分、根层深度、温度、湿度、光照度、风速等等，所以掌握植物生长环境中的这些因素是很重要的，下面简单分析温度、湿度、光照度对植物的影响。 温度对植物生长的影响 温度对植物生长的影响是综合的，它既可以通过影响光合、呼吸、蒸腾等代谢过程，也可以通过影响有机物的合成和运输等代谢过程来影响植物的生长，还可以直接影响土温、气温，通过影响水肥的吸收和输导来影响植物的生长。由于参与代谢活动的酶的活性在不同温度下有不同的表现，所以温度对植物生长的影响也具有最低、最适和最高温度三基点。植物只能在最低温度与最高温度范围内生长。虽然生长的最适温度，就是指生长最快的温度，但这并不是植物生长最健壮的温度。因为在最适温度下，植物体内的有机物消耗过多，植株反倒长得细长柔弱。因此在生产实践上培育健壮植株，常常要求低于最适温度的温度，这个温度称协调的最适温度。 湿度对植物生长的影响 影响绝对湿度的因子主要取决于水汽的来源、输送与空气保持水汽的能力等。因此，影响水汽供应的因子如降水、水体的存在、土壤水分的高低和蒸发条件等，影响水汽输送的条件如风、垂直气流等，以及影响空气保持水汽能力的条件如气温等，都可能影响绝对湿度。相对湿度一方面决定于绝对湿度，另一方面决定于空气温度。空气相对湿度或饱和差是影响植物吸水与蒸腾的重要因子之一。在相对湿度较小(饱和差较大)时，如土壤水分充足，则植物蒸腾较旺盛，植物生长较好。若较长时间空气湿度处于饱和条件下，植物生长将受抑制，导致谷物子粒的灌浆速度降低，棉花蕾铃脱落加重，棉子生命力降低和影响棉花采收质量等。相对湿度太小，会加重土壤干旱或引起大气干旱，特别在气温高而土壤水分缺乏的条件下，植物的水分平衡被破坏,水分入不敷出,会阻碍生长而造成减产。相对湿度和饱和差的高低，可制约某些植物花药开裂、花粉散落和萌发的时间，从而影
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Western blot常用封闭液及注意事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
在做Western blot实验中，会用到固相载体（如NC膜，PVDF膜），在这些固相载体表面有很多洞洞，通过电转，胶上的蛋白被转移到膜上，蛋白以机械填补（堆积）和吸附的方式结合于表面。蛋白塞进了表面的很多洞洞里面，但是蛋白并不是连续的，而有很多空隙，抗体也是蛋白，也会被吸附在空的洞里，这样就会有很多非特异性的信号。 封闭液中的蛋白可以与固相载体表面的空白位置结合，同样以机械填补（堆积）和吸附覆盖的方式结合在膜上，因为有“填补”和覆盖“蛋白结合位点以避免一抗的非特异性结合，所以有”封闭“的说法。同样这两种作用使封闭液中的蛋白能够狠牢固的结合在空白位置上，这样抗体蛋白就不会被非特异性的吸附到膜上，而只会跟特异性蛋白结合。 封闭液应封闭所有的未结合位点而不替换表面上的靶蛋白，不结合靶蛋白表位，也不与抗体或检测试剂有交叉反应。 常见的封闭液： BSA BSA是最常用的封闭液，成分单一适用于大多数情况。若免疫原是偶联BSA的，BSA有很强的免疫原性，会导致产生很多针对BSA的抗体，为避免交叉反应，不能用BSA，脱脂奶粉封闭，可以选用酪蛋白或无蛋白的封闭液。 血清 封闭血清的原理主要有两点，第一是待测样本有些与蛋白非特异性结合的物质，从而导致背景过高，因此可以用BSA或血清封闭掉这部分分特异性的结合，从这点看，BSA和血清没有明显区别。第二待测样品中可能会有Fc受体，可以和抗体恒定区结合，与抗体特异性无关，封闭血清中有抗体，因此用血清可以封闭掉一抗及二抗和样本Fc受体之间的结合，BSA无法封闭Fc受体。 脱脂奶粉 脱脂奶粉最大的优点是价格便宜，但由于成分相对复杂，所以适用范围要狭窄一些。磷酸化抗体也许会导致背景增加，此外，因为自身含有生物素，不能用于生物素标记的抗体系统。脱脂奶粉种含有少量的生物素和碱性磷酸酶残留，在使用生物素-亲和素系统和碱性磷酸酶标记的二抗时，也会使得高背景或本底水平增高。 联科生物
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浅谈预染蛋白Marker与未预染蛋白Marker
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
在Western实验中，蛋白Marker可以监控蛋白质在SDS-PAGE中的迁移，监控蛋白的转膜效率，确定蛋白分子量大小。选择正确的蛋白Marker是western blot实验成功的必备条件之一。蛋白Marker分为两种：一种是未预染的Marker，即宽分子量蛋白标准，高分子量蛋白标准及低分子量蛋白标准；另一种是预染的Marker，即单色预染和多色预染。 一、未预染蛋白Marker 未预染的蛋白Marker是最简单，也是最准确的一种，由于没有附带染料分子或者标记大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数选用预混合的marker，方便不同大小蛋白的比较。 二、预染蛋白Marker 预染蛋白Marker是一些纯化较好的蛋白混合物，通过与染料共价偶联，在电泳过程中或者转膜时可以直接观察到。预染Marker的出现方便了我们的实验，这种蛋白分子量标准可以帮助我们在电泳时，电泳后，以及转膜后检测电泳情况和估计迁移率。值得注意的是预染蛋白Marker与染料共价偶联，所以在不同的缓冲条件下电泳时迁移特性可能会发生某些变化，可能导致一些偏差，所以不太适合精确定位蛋白。 联科生物现货供应即用型的预染蛋白Marker，无需煮沸可以直接上样，而且条带尖锐，颜色稳定，转膜效率高。 目录号 产品名称(简述) 规格 目录价 LK-PM0671 Prestained Protein Ladder(10-170kD) 125ul(25mini gel) ￥300.00 LK-PM0672 Prestained Protein Ladder(10-170kD) 250ul(50mini gel) ￥500.00 LK-PM1811 PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (10-250 kDa) 125ul ￥400.00 阅读原文：
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人全血Foxp3实验步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
需要试剂 Human Regulatory T Cell Whole Blood Staining Kit （#88-8996-40） 包含组分： (1)、1X RBC Lysis Buffer: 200 mL (2)、Flow Cytometry Staining Buffer: 600 mL (3)、Fixation/Permeabilization Concentrate: 30 ml (4)、Fixation/Permeabilization Diluent: 100 mL (5)、Anti-Human Foxp3 PE (PCH101): 25 tests Anti-human CD4 （标记可选） Anti-human CD25（标记可选） Rat IgG2a K Isotype Control PE (#12-4321-41) 推荐操作步骤 取100ul全血，加入适量Anti-human CD4和Anti-human CD25，4 ℃孵育30 分钟（根据说明书和抗体管上的标识确定抗体用量）。按个人要求设置空白管、补偿管、同型对照管和样本管。 染色完的全血不用洗，每管加入2-3ml 1X RBC Lysis Buffer，混匀。室温孵育10分钟。 观察溶液透亮后，300 -400 g离心5分钟，去上清。 加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g离心5分钟，去上清。 重复洗一次。 制备固定/破膜工作液：1份Fixation/Permeabilization Concentrate加入到3份Fixation/Permeabilization Diluent中，按样品量现用现配，每管用量为1ml。 旋涡震荡细胞沉淀，每管加入1ml的固定/破膜工作液（第6步配置准备的），并再次旋涡混匀。 避光4℃孵育30分钟到60分钟，在此时间内效果一致。 加入2-3ml Flow Cytometry Staining Buffer，300 -400 g离心5分钟，去上清。 重复洗一次。 样本管中加入5ul或1test的Foxp3抗体，同型对照管中加入0.25ug Rat IgG2a K Isotype Control PE，保证最终染色体积不大于100ul，避光4℃孵育30-60分钟，根据结果优化染色时间。 加入2ml Flow Cytometry Staining Buffer洗涤细胞并弃去上清液。 用300-500ul Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。
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凋亡试剂盒V13241和V13245检测步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
实验方法 该实验采用的是经过优化的喜树碱诱导Jurkat细胞系凋亡实验条件。其他类型的细胞需做相应调整。该试剂盒在传统及Attune™声波聚焦流式细胞仪上验证过，使用Attune™声波聚焦流式细胞仪时，各种流速（25 μL/min 到 1,000 μL/min）都可以。 1.用有效方法诱导凋亡；设一不加诱导的阴性对照。 2.孵育之后收集细胞并用冷的PBS洗涤。 3.制备1×annexin V 结合缓冲液：按10次分析的量计算，加1 mL试剂C到4ml的去离子水中。 4.制备100μg/mL的PI工作液：用45μl 1×annexin V 结合缓冲液稀释5μl试剂B，剩余可保存备用。 5.再次离心步骤2中收集的细胞，弃去上清，重悬在1×annexinV 结合缓冲液。计数并用上述缓冲液稀释至约1 × 106 cells/mL。按每次实验用量100μl准备充分。 6.在每100μl细胞悬液中加入5μl试剂A和1μl步骤4制备的PI工作液。 7. 室温孵育15min。 8. 孵育结束，加400μl 1×annexin V 结合缓冲液，轻轻混匀后置于冰上。 9.尽快对染色细胞进行分析。可用FL1检测530nm激发光，FL3检测>575nm的激发光。细胞群将被分为三组：活细胞显示弱荧光，凋亡细胞显示绿色荧光，而死细胞则同时发红、绿荧光。 10. 可用荧光显微镜验证结果，适用检测FITC、TRITC或Texas Red®的滤光片检测。 图1. Jurkat细胞经10μM喜树碱处理4h(B)或不处理(A)的流式图。细胞经喜树碱处理后，凋亡细胞增多。A=凋亡细胞；V=活细胞；N=坏死细胞。 阅读原文：
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小鼠Treg检测操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
1、在每个流式上样管中加入100 µl准备好的细胞悬液，细胞数约为1x106个. 2、按照细胞表面抗原染色方法标记表面抗原。根据说明书加入CD4和CD25抗体100 µl体系中使用0.125 µg FITC anti-mouse CD4，0.06 µg APC anti-mouse CD25抗体。**根据这些试剂详细的说明书操作。4 ℃孵育30 分钟。孵育表面抗体之前加入Fc受体阻断剂。 3、用预冷流式染色缓冲溶液洗涤细胞（离心并转移）。 4、旋涡震荡重悬细胞后加入1ml的固定/破膜工作液（Fixation/Permeabilization）（1:3稀释好），并再次旋涡混匀。 5、避光4℃孵育30分钟到18小时（孵育30分钟到18小时，结果一样）。 6、加入2ml 破膜缓冲液（Permeabilization Buffer）（1:9去离子水稀释）离心洗涤细胞并弃去上清液。 7、重复第6步操作洗涤细胞。 8、（可选）加入含0.5 µg Fc受体阻断剂的破膜缓冲液，保证100 µl体系4 ℃孵育15分钟。 9、封闭液无需洗去，体系加入0.5 µg PE antimouse/rat Foxp3抗体和PE Rat lgG2a同型对照（用Permeabilization Buffer工作液进行稀释），避光4℃孵育至少30分钟。建议进行预实验摸索出抗体的最适浓度。 10、加入2ml破膜工作液离心洗涤细胞并弃去上清液。 11、重复上一步洗涤细胞。 用适量体积的Flow Cytometry Staining Buffer重悬细胞，并上机检测并分析。注：由于染色过程中使用了细胞固定和破膜，对比起活细胞在形态上会有一定变化，因此FSC/SSC图中圈门时需要做一定调整。 以上步骤仅供参考，以厂家说明书为准。 阅读原文：
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Western常见问题分析（二）
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
1、Western用的一抗，单抗好些还是多抗好些？ 做Western来讲，理论上单抗比多抗的特异性要好，但单抗种类较少，一般价格偏高，所以一般来说多抗足够了。用于Western的抗体和用于ELISA的抗体，一般来说用于Western的抗体识别的是氨基酸序列特异性，而可用于ELISA的抗体要看抗原种类，有些是识别氨基酸序列特异性，有些是识别构象特异性，所以一般根据说明书来确定。做免疫印迹选择抗体主要考虑两个问题，一时所选抗体是否识别凝胶电泳后转印至膜上的变性蛋白，另一个是所选抗体是否会引起交叉反应条带。 2、半干转是否要去膜、滤纸、胶同样大小，因为胶大小不一定规则，膜和滤纸会大一点，那样会不会短路？ 可以相等，但是如果纸、膜比凝胶大就比较容易形成短路了，上下两层滤纸也不能因过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。转移前和转移过程中看看电压就行，正常的半干转是慢慢变高的，最后结束时一般是开始的1.5-3倍都是正常的。 3、Western Blot哪种染色好？ 阴离子染料是较常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达1.5ug，考马斯亮蓝虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。胶体金，灵敏度高，检测范围可达到pg级，但染色稳定。 生物素话灵敏度位于1.2之间，可用于任何一种膜。 4、不能很好的将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么解决？ 可以考虑，转移缓冲液中加入20%甲醇，因为甲醇可以降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液中加入终浓度0.1% SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜，低浓度胶，提高转移电压/电流，增加转移时间。 5、DAB显色，碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶显色原理是什么。 DAB显色在辣根过氧化物酶的作用能形成一种灰褐色的终末
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CIK/DC-CIK及其在细胞**上的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
【背景知识】 CIK是“Cytokine-Induced Killer Cells”的缩写，中文全称为“细胞因子诱导的杀伤细胞”。 CIK是单个核细胞在CD3单抗和多种细胞因子(包括IFN-γ，IL-2等)的作用下培养获得的一群以CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群，其既具有T淋巴细胞强大的抗肿瘤活性，又具有NK细胞(自然杀伤细胞)的非MHC(主要组织相容性抗原)限制性肿瘤杀伤能力。 CIK细胞优势：杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增，是目前临床上广泛使用的过继性免疫**细胞。 【培养原理】 CIK培养用细胞因子和抗体： 1. CD3激发型单抗： T细胞活化的第一信号来自于T细胞表面的受体，即T细胞抗原受体(T cell antigen receptor, TCR)与APC提呈的抗原的特异性结合，也就是T细胞对抗原的特异性识别。TCR是由2条不同肽链构成的异二聚体，在T细胞表面，其与CD3分子通过非共价键结合，形成 TCR/CD3复合体。TCR识别特异性抗原后会引起CD3和T细胞表面的辅助受体CD4或 CD8分子的胞浆尾部聚集，进而激活与胞浆尾部相连的酪氨酸激酶(Lck, Fyn和ZAP-70等)，促使CD3分子胞浆区的免疫受体酪氨酸活化基序(immunoreceptor tyrosine-based activation motif, ITAM)中的酪氨酸(Y)磷酸化。磷酸化的酪氨酸(pY)进一步磷酸化下游含酪氨酸的蛋白，从而引起激酶活化的级联反应(磷脂酰肌醇途径或 MAP激酶途径等)，最终通过激活转录因子，使其进入细胞核内，结合于调控T细胞增殖和活化的靶基因(如IL-2和IFN-γ等)，引起基因的表达和转录，T细胞因而由静止状态转为增殖和活化状态。 由上可见，CD3分子在T细胞活化信号的转导中起着极其关键的作用。CD3激发型单抗与T细胞表面CD3分子特异性结合后，可引起CD3分子胞浆区ITAM基序中酪氨酸的磷酸化，进而导致 T细胞增殖和活化的下游信号的激活，从而使T细胞增殖和活化。也就是说，CD3激发型单抗能够模拟抗原与TCR/CD3复合物的识别和激活过程，从而引起 T细胞的增殖与活化，因此是CIK细胞培养中不可或缺的刺
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质粒纯化方案中的关键步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
如今质粒纯化不再是什么难题，那么做了这么次质粒抽提的你了解质粒纯化的原理吗？你知道哪些步骤对质粒纯化的成功起着关键作用吗？ QIAGEN质粒抽提简单原理： 在碱性条件下裂解细菌之后，将裂解液以指定的盐浓度加入QIAGEN-tip当中。质粒DNA将发生选择性的结合而从RNA、蛋白质及其他细胞污染物中被分离出来。 1、制备细胞裂解产物 细胞产率很大程度上依赖于细胞裂解质量。因此制备澄清的细胞裂解产物是QIAGEN纯化方案中的重要一环，QIAGEN已经仔细针对最优的裂解条件进行了相关的专业设计。 对培养物进行收获和重悬之后，在RNase A存在的条件下使用NaOH-SDS（P2缓冲液）裂解细菌细胞。SDS溶解了细胞膜中的磷脂和蛋白成分，导致细胞裂解并释放出内容物。NaOH则对染色质和质粒DNA以及蛋白质进行变性。最优化的裂解时间能够让细胞中释放出最多的质粒DNA，却不会释放出与细胞壁结合的染色体DNA，从而使得质粒暴露于变性条件下的时间达到最小。碱性处理的时间过长可能导致质粒DNA形成无法恢复的变性状态。这一状态的质粒在琼脂糖凝胶中移动得更快，并且能够抵抗限制性内切酶的降解。随后通过加入酸性的醋酸钾（P3缓冲液）对裂解液进行中和。高的盐分会导致KDS*发生沉淀，变性蛋白、染色体DNA和细胞碎片随之被盐——去垢剂复合物所俘获。而质粒DNA由于其更小的体积和共价闭合性，得以重新正确地复性并存留于液相之中。由于裂解液中任何残存的SDS都会抑制DNA与QIAGEN树脂的结合，所以裂解液必须缓慢而彻底地进行混合，确保去垢剂完全沉淀。 *十二烷基硫酸钾。 从染色体DNA中分离质粒的原理主要基于细胞壁结合的染色体DNA与盐分、去垢剂和蛋白的不溶复合物之间的共沉淀效应。质粒DNA则仍存留于上方澄清的液相当中。裂解过程中的剧烈处理将会切断细菌染色体，导致上清液中发生染色体DNA碎片的污染。后续的反应条件将无法在化学上区分质粒DNA与染色体碎片，因此这两种成分将不会被QIAGEN树脂分离，进而在相同的盐浓度下被
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质粒DNA质量如何评估才可靠？
作者：德尔塔 日期：2022-04-12
质粒抽提过程中有很多步骤会影响最后的产量和质量，那么如何评估质粒DNA的产量和质量呢？ 目前使用分光光度法定量质粒DNA和通过琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA产率和质量的分析是两种最常用的方法。 溶液中的核酸浓度可通过260 nm的吸光度方便地进行计算。A260的数值处于0.1至1.0之间时测量结果具有良好的重复性，但当A260数值小于0.1或大于1.0的时候，结果的可重复性将显著下降。而且，3.0以上的读值是无法使用的，它可能会潜在导致对DNA质量的低估。因此，为了获得可靠的DNA分光光度定量结果，A260的读值需要处于0.1至1.0之间。当检测小量DNA时，使用琼脂糖凝胶电泳进行的定量分析可能更为可靠。 造成较低的产率和质量的可能因素有很多。为了确定存在问题的环节，可于每一纯化步骤都保留一小部分样品，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析。 制备样本 如各个实验方案和下列表格中所示，从澄清裂解液（样本1）、流出液（样本2）、QC洗涤缓冲液的混合组分（样本3）和QF/QN缓冲液洗脱产物（样本4）中各取出部分样品。使用1倍体积的异丙醇沉淀核酸，并使用70%的乙醇洗涤该沉淀，充分蒸干后重悬于10 µl pH8.0的TE缓冲液中。 表一 琼脂糖凝胶分析所需样本体积 样本 实验方案步骤 Midi Maxi Mega Giga （极低拷贝数质粒/科斯质粒） QIAGEN-tip 100 （极低拷贝数质粒/科斯质粒）QIAGEN-tip 500 1 240 µl 120 µl 120 µl 75 µl 600 µl 750 µl 2 240 µl 120 µl 120 µl 75 µl 50 µl 24 µl 3 400 µl 240 µl 160 µl 120 µl 200 µl 120 µl 4 100 µl 60 µl 22 µl 20 µl 50 µl 30 µl (制备产物占样本量的百分比) 2% 0.40% 0.08% 0.02% 1% 0.20% 琼脂糖凝胶分析 在1%的琼脂糖凝胶*中，对于各个质粒纯化步骤中
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