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行星式球磨机的高效特点
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
随着现代科技的飞跃发展，新材料的开发与应用在各高校、研究所乃至各行各业正引起人们的日益重视。然而，无论是提高材料的性能还是分析材料的成份，均需要制备更细、更均匀的材料样本。常规的机械制取方法是采用普通球磨机方式，通过球磨机的旋转，机内磨球与材料之间高能撞击，达到粉碎、研磨、混合材料的目的。本文介绍一种高效球磨机—行星式球磨机，供读者参考。 普通球磨机的研磨罐体是滚筒式，筒内装有若干磨球，当电机旋转时，带动滚筒旋转，筒内磨球和材料在作竖直圆周运动过程中，互相撞击，研磨材料。我们知道：物体作竖直圆周运动，必须满足一定条件：否者起不到良好的研磨作用；另一方面，由于筒体和筒内磨球与材料均匀同方向旋转，这就使得球与球，球与材料之间的碰撞能量与碰撞几率大大降低，其研磨效果和研磨效率也随之下降；当转速ｎ≥ｎ０时，由于离心力的作用，磨球和材料均贴在滚筒内壁上跟随旋转，失去相互之间的碰撞，同样起不到研磨作用。所以，要想通过普通球磨机获取粒度很小的材料，混合均匀的物料，是不容易的。 行星式球磨机不同于普通球磨机的最大特点是该球磨机中的物料和磨球是在一个二维旋转空间作高能运动，其运动方式见原理图。在一个转盘上对称装有四个球磨罐，当转盘旋转时（公转），球磨罐围绕各自的中心轴作旋转（自转），罐中磨球在高速运动中研磨和混合样品。在某一确定的时刻，大转盘所产生的较强的离心力使所磨材料与球从罐的内壁分开，并在自转的高速条件下，球和材料从罐的一侧飞越到另一侧，相互撞击，使得被磨材料的颗粒更小、更细。由于公转与自转两个离心力同时作用在磨球和物料上，而且合力的方向在不断变化，这就使得磨球与物料在球磨罐中的运动轨迹是杂乱无序的，这样，就可以通过提高转速，使磨球与材料获取足够的碰撞能量，达到高效研磨的作用。 网站地址:http://www.xyjh.com.cn 电子邮件:xyjh@xyjh.com.cn
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外泌体exosomes提取方法比较
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
[EXO]提取方法比较 ——如何获得你所想要的exosomes？ 外泌体（Exosome）发现于1986年，是一种直径约30~100nm的双层膜囊泡状结构小体，可由机体内多种细胞如免疫细胞、干细胞、心血管细胞、网织红细胞、血小板、神经细胞和肿瘤细胞等主动分泌产生，exosomes广泛分布于外周血、尿液、唾液、乳汁、腹水、羊水等体液中。 exosomes携带大量特异性的蛋白质（如细胞因子、生长因子）以及功能性的mRNAs、miRNAs等生物活性物质，在体内参与细胞通讯、细胞迁移、促血管新生和抗肿瘤免疫等生理过程，与多种疾病的发生和进程密切相关[1] [2]。由于外泌体的特殊结构和功能，使得它具有潜在的应用价值，[EXO]提取方法比较 ——如何获得你所想要的exosomes？一方面可以作为诊断多种疾病的生物指标，[EXO]提取方法比较 ——如何获得你所想要的exosomes？另一方面也可以作为**手段，未来有可能作为药物的天然载体用于临床**。 外泌体的分离纯化一直是科研工作者关注的问题，[EXO]提取方法比较 ——如何获得你所想要的exosomes？获得高纯度的外泌体对后续的研究至关重要。据了解，目前人们多采用超速离心、免疫磁珠、超滤、沉淀或试剂盒等方法实现外泌体的提取分离： 1、超速离心法（差速离心） 超离法是最常用的外泌体纯化手段，采用低速离心、高速离心交替进行（如图所示），可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎，但过程比较费时，且回收率不稳定（可能与转子类型有关），纯度也受到质疑；此外，重复离心操作还有可能对囊泡造成损害，从而降低其质量[3]。 2、密度梯度离心 在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，是一种区带分离法。通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围富集。此法获得的外泌体纯度较高，但步骤繁琐，耗时。 3、超滤离心[4] 由于外泌体是一个大小约几十纳米的囊状小体，大于一般蛋白质，利用不同截留相对分子质量(MWCO)的超
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白细胞介素种类及功能介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
白细胞介素（interleukins, ILs），简称白介素，最初是指由白细胞产生并在白细胞之间起调节作用的细胞因子，均为小分子多肽或糖蛋白类物质。1979年，第二届国际淋巴因子专题会议将免疫应答过程中白细胞间相互作用的细胞因子统一命名为白细胞介素，并规定其命名规则。目前至少发现了38个白细胞介素，常用的为IL-2，IL-4，IL-6，IL-12等，它们具有广泛的生物学活性，在介导细胞免疫、抵抗微生物感染和抗肿瘤方面起着重要的作用。 白介素-1（IL-1）有两种存在形式，即IL-1α和IL-1β，结合相同受体，它主要来源于单核吞噬细胞，还有淋巴细胞、内皮细胞及角化细胞等。它在低浓度时主要具有免疫调节作用，如协同刺激增强T细胞和APC活性；促B细胞增殖及抗体产生；在高浓度时诱发肝急性期血浆蛋白合成，介导炎症反应；引起发热和恶病质状态。 白介素-2（IL-2）主要由CD4+T细胞产生，CD8+T细胞也可产生，以自分泌和旁分泌方式发挥效应。它的主要功能为：（1）活化CD4+和CD8+T细胞，促细胞因子产生；（2）刺激NK细胞增殖、活化，诱导LAK细胞产生；（3）促活化B细胞增殖及产生抗体；（4）可激活单核-巨噬细胞。 白介素-4（IL-4）主要由Th2细胞产生，其主要功能为（1）刺激B细胞活化、增殖，诱导Ig类别转换产生IgG1 和IgE，并促进其抗原递呈；（2）促进Th0细胞向Th2细胞分化；（3）抑制Th1细胞活化、增殖；（4）协同IL-3刺激肥大细胞增殖。 白细胞介素-6（IL-6）主要由Th2细胞产生，也可由单核-巨噬细胞、血管内皮细胞、成纤维细胞产生。它的主要功能为：（1）刺激肝细胞合成急性期血浆蛋白，参与炎症反应；（2）刺激活化Ｂ细胞的增殖，分泌抗体；（3）协同刺激Ｔ细胞、胸腺细胞和骨髓造血干细胞增殖；（4）促骨髓瘤细胞增殖。 白细胞介素-8（IL-8）主要由单核-巨噬细胞和内皮细胞产生，也可由上皮细胞和成纤维细胞产生。它的主要功能为：（1）对中性粒细胞有强的趋化作用，对嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和淋巴细胞也有趋化作用；
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霍乱毒素B亚单位简介
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
霍乱毒素由（Cholera toxin,CT）两个亚单位组成，即A亚单位（CTA）和B亚单位（CTB）。A亚单位是霍乱毒素的活性部分，B亚单位的主要功能是通过与哺乳动物小肠上皮细胞上的单唾液酸神经节苷脂GM1结合而使得A亚单位进入细胞。霍乱毒素由霍乱操纵子（ctx）编码，从5到3方向，依次是反激活因子ToxR的识别序列、启动子、A基因（ctxA）、B基因（ctxB）和不依赖于r因子的转录终止系列。现在普遍认为操纵子中只有一个启动子，ctxA和ctxB位于同一个转录单位中。在霍乱弧菌中，ctxB基因的表达水平是ctxA 基因的5倍，克隆的ctx操纵子在大肠杆菌中表达时，B基因的表达水平是A基因的6倍以上。 但曹诚等研究发现，霍乱毒素B亚单位基因上游Xbal~Clal限制性片段内（即在霍乱毒素A亚基结构基因内部）存在具有启动子活性的序列。在该启动子的控制下霍乱毒素B亚基因可以高效表达，该启动子的存在可能是霍乱弧菌和大肠杆菌中CTB亚基的表达产量分别是CTA亚基的6倍和7倍的原因。 霍乱毒素B亚单位（www.absin.cn）基因（CtxB）序列长约380bp，一共编码124个氨基酸，其中前21个氨基酸为信号肽序列。对CtxB基因编码的124个氨基酸序列进行计算机软件二级结构预测分析，前17个氨基酸具有明显疏水性，形成一个a螺旋和一个b折叠。第21位的Gly和Thr亲水性较强，露于分子表面，有利于信号肽酶的切割。 爱必信大量现货，欢迎订购
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高效液相色谱法青检测青蒿素
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
青蒿素是从中药黄花蒿中分离的具有抗恶性疟疾激励的一种化合物，呈无色针状结晶。黄花蒿（Artemisia annua Linn）为中国传统中草药。其有效成分—青蒿素具有良好的抗疟效果。目前青蒿素用于疟疾防治的价值已被人类认识和接受，世界卫生组织已把青蒿素的复方制剂列为国际上防治疟疾的**药物。 中国知名科学家屠呦呦根据《肘后备急方》等中医药古典文献描述，经过艰苦卓绝的努力并从获取灵感，先驱性地发现了青蒿素。2015年10月5日，瑞典卡罗琳医学院宣布，将诺贝尔生理学或医学奖授予中国药学家屠呦呦以及爱尔兰科学家威廉•坎贝尔和日本科学家大村智，表彰他们在寄生虫疾病**研究方面取得的成就。日前，屠呦呦女士在瑞典首都斯德哥尔摩音乐厅举行的2015年诺贝尔奖颁奖仪式上正式领取诺贝尔生理学或医学奖。 青蒿素对疟原虫红内期有直接杀灭作用。对实验动物毒性很低，在机体内吸收快、分布广、排泄快。青蒿素抗疟机理是干扰了疟原虫的表膜——线粒体的功能。本品**间日疟、恶性疟平均原虫转阴时间快于氯喹，临床**中未见毒副作用，特别在抗氯喹原虫株地区**恶性疟和脑型疟更显示出其优越性。通过对青蒿素进行结构改造，找到的新的衍生物——甲基青蒿素和青蒿酯钠——具有更好的效果，甲基青蒿素口服剂量只需青蒿素的 l/6～1/8，且无苦味；青蒿酯钠易溶于水，可用于凶险型疟疾的静脉注射抢救。 中国药典中对青蒿素检测作出了明确规定。RephiLe根据药典与相关文献推出青蒿素含量检测解决方案。该方案采用HPLC检测。详细解决方案如下： 一、实验方法 高效液相色谱法（HPLC）。 二、仪器和试剂 高效液相色谱仪，超声振荡仪，PURIST 超纯水系统。 甲醇。 三、试验方法 1、色谱条件 采用迪马公司 Diamonsil C18 色谱柱，甲醇-水（75 : 25）流动相；流速 1 mL/min；ELSD 温度 40℃，载气压力 3.5 bar，放大系数 9；进样体积 20 μL。 2、标准品溶液配制 精准配置浓度为 250 μg/mL 的青蒿素甲醇溶液，置于棕色容量 3、样品溶
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荧光免疫测定技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与标本中相应的抗体或抗原反应后，测定复合物中的荧光素，这种免疫技术，称为免疫荧光测定技术。 荧光免疫测定技术分类： 荧光抗体技术（荧光显微镜技术）：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。 免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而推算被测物浓度的检测方法。 我公司的HG-98免疫定量分析仪属于上面的第二类。 HG-98免疫定量分析仪通过检测板条上激光激发的荧光，定量检测以pg/ml为单位的检测板条上单个或多个标志物。检测系统通常由荧光读数仪和检测板组成。检测板多用层析法，分析物在移动的过程中形成免疫复合物，通过检测区域、质控区域的荧光信号值的不同与分析物的不同浓度成一定的比例，获得定标曲线，可检测未知样本中分析物的浓度。 免疫定量分析：试剂的处理上就是把传统方法中的相关液体试剂浸润于滤纸和各种微孔膜的吸水材料中，成为整合的干燥试剂块，然后将其固定于硬质型基质上，成为各种形式的诊断试剂条；仪器的处理上则是把传统分析仪器微型化，操作方法简单化，使之成为便携式和手掌式的设备；通常是将上述两者整合为统一的系统，用户可以不需要额外人工处理标本、不需要非常精确的加样的，结果准确、并能自动保存所有记录，且一般设备都具有内置校正曲线计算法，质量控制限度和结果数据存储等，高灵敏度、分析时间短，是目前医疗设备的发展的一个重要发展趋势。 作为仪器的制造商，我们希望能与更多的试剂厂家合作，以便更好的为用户提供方便、快速的检测系统。
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超声波破碎原理
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
超声波是指任何声波或振动，其频率超过人类耳朵可以听到的最高阈值20千赫。超声波由于其高频特性而被广泛应用于众多领域，比如金属探伤，工件清洗等。某些动物，如犬只、海豚、以及蝙蝠等等都有着超乎人类的耳朵，也因此可以听到超声波。亦有人利用这个特性制成能产生超声波来呼唤犬只的犬笛。超声波是频率高于20000赫兹的声波，在实际应用中又分为功率超声波及检测超声波。它方向性好，穿透能力强，易于获得较集中的声能，在密度较大的固体及液体中传播距离远，可用于测距、工业探伤、医用B超声、清洗、焊接、钻孔、碎石、杀菌消毒等。 由于超声波频率很高，所以超声波与一般声波相比，它的功率是非常大的。空化作用──当超声波在液体中传播时，由于液体微粒的剧烈振动，会在液体内部产生小空洞。这些小空洞迅速胀大和闭合，会使液体微粒之间发生猛烈的撞击作用，从而产生几千到上万个大气压的压强。微粒间这种剧烈的相互作用，会使液体的温度骤然升高，起到了很好的搅拌作用，从而使两种不相溶的液体（如水和油）发生乳化，且加速溶质的溶解，加速化学反应。这种由超声波作用在液体中所引起的各种效应称为超声波的空化作用。超声波破碎就是利用这种空化作用破碎样品。 美国SONICS就是一家专做超声波破碎仪的厂家，自1969成立以来，始终是行业的创新先锋。上海书俊仪器设备有限公司作为SONICS在中国的总代理，以及SONICS厂家在中国唯一指定的中国区售后服务维修中心，一直竭诚为中国客户提供最优质的产品和服务。
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DC(树突状细胞)的制备方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
【背景】 DC 是「Dendritic Cells」的缩写，中文全称为「树突状细胞」，因其成熟时伸出 许多树突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大 籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 (Antigen Presenting Cells, APC)。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞（Naïve T cells）增殖的 APC，而其它种类的 APC（如单核巨噬细胞，B 细胞等）仅能刺激已活化 的或记忆性的 T 细胞，因此 DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中发挥着极其重要的作用。 【培养原理】 因为 DC 需从其它种类细胞诱导分化而来，且可分为不同的成熟阶段，所以通常分为 2 个步骤进行培养： Step 1：从 DC 的祖细胞（如单核细胞）诱导分化为未成熟 DC（immature DC，iDC）； Step 2：从 iDC 诱导分化为成熟 DC（mature DC，mDC）。 Step 1： GM-CSF（粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）： GM-CSF 是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞集落的形成， 并具有促进早期红巨核细胞、嗜酸性祖细胞增殖和发育的功能。GM-CSF 是最早被鉴定 出对 DC 培养有作用的细胞因子之一。 GM-CSF 在 DC 培养中的功能是促进单核细胞向大巨噬样细胞分化，细胞表面 MHC II 类分子的表达得以提高，从而增强细胞的抗原递呈功能。此外，GM-CSF 也可促进 DC 的存活。 IL-4（白细胞介素-4） IL-4 在由单核细胞诱导成 DC 的过程中发挥的作用是抑制巨噬细胞的过度生长，从 而引导单核细胞向 DC 方向分化。 若培养体系中不加 IL-4，单核细胞将分化为巨噬细 胞。同时，IL-4 还有降低细胞表面表达 CD14 分子的能力。CD14 表达水平的降低是单 核细胞分化为 DC 的重要标志。 GM-CSF 和 IL-4 共同作用可使单核细胞定向分化为未成熟 DC，此时的 DC 具有较 强的抗原摄取和加工能力，但抗原递呈能力很弱。细胞表面中度表达 MHC I 类、II 类 分子和 B7 家族分子（CD80, CD86 等），
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下肢缺血（血管再生）实验方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
下肢缺血试验应用血管新生是缺血性心血管疾病血流阻塞后改善血流灌注的重要机制。然而,目前临床上尚缺乏一种简单、无创和特异的直接评价血管新生的方法。下肢缺血试验是进行血管新生评价的重要试验。方法是使用大鼠或小鼠予结扎一侧下肢股动脉制备下肢缺血模型,另一侧下肢作为对照组。术后使用激光多普勒血流成像仪对双后肢进行扫描成像，分析后肢血流量。然后每周对双后肢进行扫描成像，分析后肢血流恢复状况。 下肢缺血试验是进行缺血性心血管病与**性血管新生研究的重要方法，可以将促血管新生因子注入体内，促进缺血局部血管新生与侧支循环，改善组织的血液供应与功能，进而评价促血管新生因子的作用。促血管新生因子可以是促血管新生药物、蛋白、基因和干细胞**。 除心脏血管疾病研究外，还可使用下肢缺血试验评价糖尿病、外周血管疾病、伤口愈合等方面的血管新生研究。 所需设备 MoorLDI2-HIR点扫描激光多普勒血流成像（Gene&I，北京） AMG小动物麻醉机（Gene&I，北京） 剃毛刀和脱毛膏 试验过程 将大鼠或小鼠使用麻醉机进行麻醉。 将后肢使用脱毛膏进行脱毛处理。 剪开其中一侧后肢皮肤，分离肌肉分离出股动脉。 使用缝合线在紧贴腹股沟处对股动脉进行结扎。 缝合伤口，使用激光多普勒扫描仪对双下肢进行血流扫描成像。 分析缺血侧下肢与正常侧血流灌注量对比。 试验结果 手术后当天，缺血侧肢体相对于正常侧缺血率可达80-90%。 在使用促血管新生因子后，可观察到缺血侧肢体血流恢复过程。 Reference Aicher A., Heeschen C., Sasaki K., Urbich C., Zeiher A. M., Dimmeler S. 2006 Low-energy shock wave for enhancing recruitment of endothelial progenitor cells: a new modality to increase efficacy of cell therapy in chronic hind limb ischemia. Circulation, 114 (25), pp 2823-30 Chalothorn D, Zhang
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EGFRvIII兔单克隆抗体结构与作用机制介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
CST公司刚出的EGF ReceptorvIII (D6T2Q) XP Rabbit mAb #64952，是目前唯一的商品化的EGFRvIII兔单克隆抗体。在IHC和IF应用上具有非常好的特异性，而且具有很高的性价比。具体订购联系一级代理商 那么 胶质母细胞瘤（glioblastoma）是神马东西？它是成人中最常见的原发性脑部肿瘤，在所有脑肿瘤中是发病率第一位的恶性肿瘤。该病有何特点？该病极难**，患者平均存活时间非常短，病死率极其高，现有的**方法，疗效不够突出且损 EGFRvIII兔单克隆抗体 伤大脑。因此，急需更加特异且有效的疗法来选择性的靶向**。 那，EGFRvIII与之又有什么关系呢？ 简单形象的说：EGFR是一类细胞的指挥兵，负责调控细胞的正常生长，若指挥调控出了岔子即信号调控紊乱，便会导致多种肿瘤的发生。EGFR负责调控的细胞是上皮起源组织中的细胞。 但EGFR有些乖张，其有众多突变形式，最常见的胞外区域的突变是EGFRvIII。它主要是厌烦背负基因太沉重便甩掉了一些，即在编码区域的外显子2—7之间移去了801个碱基，较野生型在胞外区域少了267个氨基酸，从而在外显子1和8之间产生了融合区域以及一个新的甘氨酸残基（图1），这是一个肿瘤特异的框内缺失突变。与野生型相比，EGFRvIII不依赖于配体，是组成型激活的。该突变在多种癌症中（如乳腺癌，肺癌，头颈癌等）都有发现，但在母细胞胶质瘤中最为常见。 图1. EGFRvIII结构示意图 胶质母细胞瘤与EGFRvIII 相较于继发性GBM（一般从低级别的前体进展而来），原发性GBM经常会有EGFR突变。这也是临床上该类疾病最常见的类型，而且一项流行病学的调查显示高达95%的病例为原发性GBM。 近期研究人员对251例原发性GBM进行了完整的外显子组测序及DNA拷贝数分析，这提供了相应的受体酪氨酸激酶遗传改变的全局式概览。研究结果显示67.3%的GBM存在RTK的遗传变异，而且57.4%的GBM存在EGFR变异。 此外，其它的研究发现50%具有EGFR扩增的患者同时具有EGFRvIII突变。大约20-30%的GBM具有EGF
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BCA蛋白定量方案—最便宜的BCA蛋白定量分析试剂盒技术说明
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
精确的蛋白质定量是蛋白质相关实验所必需的，这些实验涉及分子生物学，细胞生物学，生物化学，发育生物学和神经科学的研究课题。 最常用的蛋白质定量分析方法主要是BCA法和Bradford法。 基于Bradford法的原理，会由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，导致不同蛋白质测定时有较大的偏差，而且容易受到去污剂（Triton X-100、SDS…）的干扰。所以更多的权威机构和客户会选择BCA法检测蛋白浓度，例如，FDA指定BCA试剂盒为新药申报材料中蛋白质检测的唯一标准试剂。 BCA法实验原理：碱性条件下，蛋白质分子中的肽键结构能与Cu2+结合生成紫色络合物，同时将Cu2+还原为Cu+。BCA试剂可灵敏特异的与Cu+结合，形成稳定的有颜色的络合物，562nm处有最高的吸收值，可在540-595nm测定其吸收值，颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 Biovision的常规BCA蛋白定量试剂盒的优点： · 实验操作简单，便捷； · 灵敏度高，检测浓度下限达到25μg/ml； · 测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的去污剂等化学物质的影响，可以兼容SDS、Triton X-100以及Tween 20等； · 在20-2000μg/ml浓度范围内有良好的线性关系； · 检测不同蛋白质分子的变异系数小于Bradford法蛋白定量； · 性价比无与伦比，单次实验费用比国产试剂盒更低。 产品名称及描述 品牌 货号 产品说明 BCA Protein Assay Kit II Biovision K813-5000 当然BCA法也有其不足之处，就是容易收到略高浓度还原剂的干扰，如：DTT、TCEP 和β-mercaptoethanol等。为此，作为全球生命科学公司的领导者，Biovision经过探索攻坚，彻底完善了BCA的不足，推出市面上唯一一款可兼容高浓度还原剂的BCA试剂盒，。可兼容：TCEP (20 mM), DTT (10 mM), β-ME (35 mM) 图1. 高浓度还原剂条件下，Biovision试剂盒（）的优异表现 产品名称及描述 品牌 货号 产品说明 BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible Biovision K818-1000
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【锐赛小课堂】WB生物样本总蛋白抽提
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
锐赛小课堂1222-158 一、贴壁细胞蛋白提取 A 1..将水浴锅的温度调至100℃，等水浴锅达到100℃温度后，取出需要收样的细胞的培养皿或者孔板。 2.将缓冲液（1Xloading buffer）置于100℃水浴锅中预热10min。 （loding buffer： 是5Xloding buffer用纯水稀释到1Xlodingbuffer。厂家：碧云天；货号： P0015L） 3.弃去细胞培养基，用PBS洗两遍。 4.取预热好的缓冲液1X loding加入到去除细胞培养液的细胞中，用细胞刮将细胞挂下收集到EP管。 （加入loding buffer的体积建议量，以细胞密度长到70%-80%，6孔板每孔加入120ul；150px皿200ul；250px皿300ul） 5.将收集好的细胞液转移到EP管中，立即放入100℃煮15min。 6. B 1.倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。 2.每瓶细胞加 3 ml 4℃ 预冷的 PBS（0.01M pH7.2～7.3）。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞，然后弃去洗液。重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。 3.按 1 ml 裂解液加 10 μ PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。（PMSF 要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。） 4.每瓶细胞加 400 μ 含 PMSF 的裂解液，于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。 5.裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5 ml 离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。） 6.于 4℃ 下 12000rpm 离心 5 min。（提前开离心机预冷） 7.将离心后的上清分装转移倒 0.5 min 的离心管中放于-20℃ 保存。 （个人感觉上述方法可操作性有待加强，细胞中蛋白本来就很少，一瓶 50 ml 的细胞有时按照实验要求只能加 100-200μ 的裂解液，按照上述操作，直接用 200μ 裂解液进行裂解，根本就不够瓶壁上沾的。本人是先用预冷的 PBS（一般数毫升）加入后，用细胞刮刮下细胞，转移至试管中，如果数瓶细胞是收集同一蛋
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DC-CIK的制备方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
【背景】 CIK 是「Cytokine-Induced Killer Cells」的缩写，中文全称为「细胞因子诱导的杀伤细胞」。 CIK 是单个核细胞在 CD3 单抗和多种细胞因子 （包括 IFN-γ, IL-2 等） 的作用下培养获得的一群以 CD3+CD56+细胞为主要效应细胞的异质细胞群， 其既具有 T 淋巴细胞强大的抗肿瘤活 性，又具有 NK 细胞 （自然杀伤细胞） 的非 MHC （主要组织相容性抗原） 限制性肿瘤杀伤能力。 CIK 细胞具有杀瘤活性高、杀瘤谱广，对正常组织毒性低，体外可高度扩增等特点，是目前 临床上广泛使用的过继性免疫**细胞。 DC 是「Dendritic Cells」的缩写，中文全称为「树突状细胞」，因其成熟时伸出许多树 突样或伪足样突起而得名。DC 是由 2011 年诺贝尔奖获得者、加拿大籍科学家 Ralph M. Steinman 于 1973 年发现的，是目前发现的功能最强的抗原递呈细胞 （Antigen Presenting Cells, APC）。已证实，DC 是唯一能够显著刺激初始 T 细胞 （Naïve T cells） 增殖的 APC,而其它 APC （如单核巨噬细胞，B 细胞等） 仅能刺激已活化的或记忆性的 T 细胞。DC 是机体适应性 T 细胞免疫应答的始动者，在肿瘤免疫中具有极其重要的作用。 DC-CIK 即 DC 和 CIK 细胞在体外共培养，然后回输给患者。严格的说，最终的效应细 胞是经 DC 体外活化的 CIK 细胞。多项研究表明，DC 与 CIK 具有协同作用，共同孵育后， DC 表面共刺激分子的表达及抗原递呈能力均明显提高，而 CIK 的增殖能力和体内外细胞毒 活性也得以增强，因此 DC-CIK 较单独的 CIK **更为有效。若将肿瘤抗原负载的 DC 与 CIK 共培养，可刺激产生肿瘤抗原特异性的 T 细胞，这样的 DC-CIK **则兼具特异性和非 特异性双重肿瘤杀伤作用，比未负载肿瘤抗原的 DC 刺激活化的 CIK 活性更强，常被用于 临床和科研。 【培养原理】 1.DC 培养用细胞因子： GM-CSF （粒细胞巨噬细胞集落刺激因子）： GM-CSF 是一种造血生长因子，在体外可刺激中性粒细胞和巨噬细胞的集落形成， 并具有促进早
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三种流式方法检测细胞凋亡
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
一、检测原理 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 流式细胞仪检测有下列特点 1、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2、可用许多相关分析 3、结合被测细胞DNA含量分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期。但该法周样也具有标本制作复杂。非原位检测，不易与变性细胞鉴别等因素的限制。 二、检测方法 1、检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，采用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。 常用Hoechs-PI染色法，正常细胞对染料有拒染性，荧光着色很浅，凋亡细胞主要摄取hoechs-PI染料，呈现强蓝色荧光，而坏死细胞主要摄取碘化丙啶（PI）而呈红色荧光。 2、DNA片段原位标记 凋亡细胞DNA片段原位末端检测技术是指在细胞（或组织）结构保持不变的情况下，用荧光素、地高.辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（deoxyuridinetriphate，UDTP）和末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidy1 transferase，TdT）相反应与凋亡细胞裂解后3'的羟基（-OH）端相结合经显色反应后检测DNA裂解点的技术。 DNA片段原位标记法有两种 （1）原位缺口转移（in situ nick-translation，ISNT）技术，该技术是1994年由Fehsel等提出，它是利用DNA多聚酶I将标记的核苷酸接到断裂的3'-OH端 （2）原位缺口末端原位标记技术（in situ end labelling technique，ISEL）， 该技术即TUNEL法，于1993年由Wijsman等提出， 它是利用TdT将标记DUTP接到3'-OH端。研究证明，TUNEL的敏感性远高于尤其对早期凋亡的检出TUNEL更为适用。其原因可能是凋亡发生时DNA大多是双链同时断裂而单链
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lncRNA启动子DNA甲基化/羟甲基化测序分析综述
作者：德尔塔 日期：2022-04-24
技术优势： ● 专注非编码RNA领域，完善的lncRNA启动子分析流程 ● 可与lncRNA表达谱芯片联合应用，实现平台间无缝对接 ● 可视化数据展示，提供paper级结果图表 ● 优化的IP实验方法，可信赖的检测平台及数据结果 介绍： 人类基因组中仅有约2%的DNA序列最终编码生成蛋白质，其余绝大部分区域转录形成长链非编码RNA。随着lncRNA的生物学功能的发现，这些原先被认为是“junk DNA”的区域的其eferenceseq研究地位上升为“暗物质”。lncRNA的转录受到严格的调控，其表达谱细胞特异性和组织特异性甚至高于蛋白编码基因。寻找和发现疾病过程中LncRNA表达变化的原因，了解lncRNA上游调控机制，是lncRNA研究领域重要组成部分，而表观遗传学正是从基因组层面研究RNA转录调控的重要领域。 启动子区域的DNA的甲基化对RNA的转录起抑制作用。研究发现，在肝癌以及精神分裂患者样品中转录形成LncRNA MEG3的基因组区域发生DNA甲基化修饰程度的异常改变；食管癌具有特征性lncRNA启动子DNA甲基图谱，其区分癌与癌旁组织的效果要优于mRNA启动子；乳腺癌中高达57.18%的lncRNA发生启动子DNA甲基化水平的改变，lncRNA启动子的甲基化程度和lncRNA的表达水平显著相关。 康成生物在MeDIP-seq数据中加入lncRNA启动子DNA甲基化分析，客户可以同时得到lncRNA，mRNA的DNA甲基化相关数据，可与Arraystar lncRNA芯片联合应用，实现两个平台的无缝对接。lncRNA启动子分析同样适用于hMeDIP-seq平台，可以快速便捷地确定DNA羟甲基化修饰在lncRNA启动子区域的分布。 图1. 甲基化/羟甲基化测序lncRNA启动子分析流程 重要数据结果展示： 1. 两组/个样品的lncRNA启动子差异（羟）甲基化分析 康成生物使用最新软件分析两组/个样品间的差异(羟)甲基化区域。与传统的先合并reads，再计算差异富集区，或者先分别计算差异富集区，再合并的方法相比，这种方法更加稳健，能够更好地利用重复数据
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