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细胞技术专题：细胞划痕实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
材料： 6孔板 marker笔 直尺 20微升枪头（灭菌） 无血清培养基 PBS 准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内） 流程： 1、先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀地划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2、在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3、第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不要倾斜。 4、用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。 5、放入37℃5%CO2培养箱培养。按0、6、12、24小时取样，拍照。
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细胞技术专题：肿瘤细胞侵袭试验（Tumour Invasion Assay）介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一 、 原理 Matrigel 是从小鼠EHS肉瘤中提取的基质成分，含有LN、IV型胶原、接触蛋白和肝素硫酸多糖，铺在无聚乙烯吡硌烷酮的聚碳酸酯滤膜上，能在DMEM培养基中重建形成膜结构，这种膜结构与天然基质膜结构极为相似。 滤膜孔径一般为8um，而且膜孔都被Matrigel覆盖，细胞不能自由穿过，必须分泌水解酶，并通过变形运动才能穿过这种铺有Martrigel的滤膜，这与体内情况较为相似。 铺有Martrigel的滤膜放在以Blind Well腔或MICS腔上下室之间，铺有Martrigel面朝向上室，在下室中加有趋化剂，如一定浓度的LN、FN或小鼠3T3条件培养液或人睾丸上皮成纤维细胞培养液，上室加入重悬的瘤细胞，具有侵袭能力的细胞在趋化剂诱导下开始穿膜运动。细胞穿膜所用的时间与Martrigel的用量有关，选择25ugMartrigell铺膜，16小时后观察结果较为合适。穿过滤膜的细胞多数粘附在滤膜下表面，可用棉签将上表面的细胞拭去，然后用乙醇固定滤膜，PE染色，在光镜下观察统计穿过Martrigel的细胞数。另外用Transwell小室也可进行重建基质膜侵袭分析，这一方法是在Transwell小室吊篮式上腔的滤膜上铺上30ugMartrigel，加入细胞72h后观察结果。值得注意的是，细胞在TransWll腔中培养72小时后，有相当数量穿过滤膜的细胞不再粘附在滤膜下表面，而是脱落进人下腔溶液中．因此统计穿过基质膜的细胞数目时应把这部分细胞考虑在内。肿瘤细胞穿过重建基质膜的能力与它的体内侵袭转移能力表现出较好的相关性，可以用重建基质膜模型初筛抗侵袭药物。 在上述分析中，如果不在膜上铺Martrigel而直接将8um孔径滤膜安放在侵袭腔室上下腔室之间，细胞通过变形运动穿过滤膜，用这种模型对分析细胞运动能力和药物对细胞运动能力的影响。另外，在下室中加有LN或FN或在滤膜下表面铺上LN或FN，可分析药物对肿瘤细胞的趋化性或趋固性的影响。 二 、 材料 1、Matrigel 基质胶（威格拉斯生物技术（北京）有限公司），10mg/ml，5ml，分装成0.5ml/只10个EP管中；用时加
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细胞技术专题：小鼠肝细胞原代培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠肝细胞原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因**研究。 实验方法 胰酶消化法 实验方法原理 将小鼠的肝细胞从机体中取出，经胰酶、螯合剂（常用EDTA）处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。 实验材料 小鼠 试剂、试剂盒 DMEM 无血清DMEM培养基 胰酶 PBS 仪器、耗材 饭盒 纱布 剪子 镊子 烧杯 平皿 研磨玻片 滤网 离心管 6孔培养板 吸管 移液管 手套 微量加样器 实验步骤 一、实验材料准备 1. 动物：小鼠。 2. 试剂：DMEM(含血清)、无血清DMEM培养基、胰酶、PBS。 3. 器械：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管(15/50 ml)、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器。 4. 准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。 二、方法 1. 将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取肝脏，置于盛有PBS的平皿中。 2. 剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。 2.3 用手术剪将脏器剪成小块(大小约1mm2)，玻片研磨，转到离心管，离心(1 000 rpm，5 min)。 4. 视组织或细胞量加入5-6倍(3-5 ml)胰酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。 5. 加入3-5 ml含血清的培养液以中止胰酶消化作用。 6. 用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。 7. 再次离心5 min，弃上清液。 8. 加入无血清培养液5 ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。 9. 加入含血清的培养液1-2 ml(视细胞量)，血球计数板计数。 10. 将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养
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细胞技术专题：光学显微镜检测肿瘤细胞形态实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
光学显微镜检测肿瘤细胞形态可以：（1）辅助判断肿瘤细胞是否凋亡；（2）用于病理检查；（3）提取肿瘤细胞微细结构信息。 实验方法 瑞氏-吉姆萨混染法 HE染色法 实验方法原理 吉姆萨染液由天青，伊红组成。染色原理和结果与瑞特染色法基本相同。 1）嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结果，染粉红色，称为嗜酸性物质； 2）细胞核蛋白和淋巴细胞 胞浆为酸性，与碱性染料美蓝或天青结合，染紫蓝色，称为嗜碱性物质； 3）中性颗粒呈等电状态与伊红和美蓝均可结合，染淡紫色，称为中性物质。 PH对细胞染色有影响。细胞各种成分均分布蛋白质，由于蛋白质系两性电解质，所带电荷随溶液PH而定，在偏酸性环境中下在电荷增多，易与伊红结合，染色偏红；在偏碱性环境中负电荷增多，易与美蓝或天青结合，染色 偏蓝。因此细胞染色对氢离子浓度十分敏感，染色用玻片必须清洁，无酸碱污染。配制必须用优质甲醇，稀释染色必须用缓冲液，冲洗用水应近中性，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难，甚至造成错误。 用途：适合大多数细胞组织的染色，包括血涂片、各种组织石蜡切片、冰冻切片、以及各种培养细胞。染色体显带、多种微生物的鉴别染色和细胞凋亡的检测等。 实验材料 肿瘤细胞 试剂、试剂盒 甲醛 二甲苯 Gimsa染液 Sorensen磷酸缓冲液 香柏油 蒸馏水 仪器、耗材 光学显微镜 树胶 载玻片 盖玻片 洗瓶 离心机 离心管 实验步骤 一、试剂配制 1. 瑞氏染液配制 称瑞氏染料0.1 g于研钵，少量多次加入AR级甲醇至完全溶解，后补充至60 ml棕色瓶密封保存，可加3 ml甘油防止挥发。 2. 吉姆萨染液配制 0.1 g吉姆萨染料放入有6.6 ml甘油的圆锥烧瓶内，56度，水浴90-120 min，当染料与甘油充分混合后加入6.6 ml甲醇，充分摇匀后过滤，棕色瓶室温可保存一周。 二、染色 1. 收集细胞制成悬液后涂片、晾干。悬浮培养细胞离心收集。贴壁细胞可直接培养在载玻片上。组织取材需机械零散。
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细胞技术专题：大鼠乳鼠成骨细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
大鼠乳鼠成骨细胞培养培养可以：（1）获得大鼠乳鼠成骨细胞；（2）用于骨修复的细胞学机制研究。 实验方法 酶消化法 实验方法原理 取材于出生2~3 d 小鼠颅骨，以含20%胎牛血清的DMEM培养液进行培养，采用胶原酶消化法分离成骨细胞，并进行细胞接种与传代。采用胶原酶消化法分离培养成骨细胞是一种可靠、简便、快速的细胞原代分离培养方法。 实验材料 SD大鼠 试剂、试剂盒 F12 完全培养液 胰蛋白酶 Ⅱ型胶原酶 酒精 仪器、耗材 手术器械 磁力搅拌器 实验步骤 一、实验步骤 1. 拉颈处死24 小时内新生的SD大鼠，75%乙醇浸泡5 min，取出头盖骨，分离顶骨和额骨，冰生理盐水液反复洗涤大鼠乳鼠颅盖骨标本除去脂肪组织及残留血，放入另一盛有F12 完全培基液的培养皿中再洗涤， 将颅骨剪成2～5 mm2 碎片，将洗涤过的骨碎片用 0.25%胰蛋白酶2 ml 预消化15 min，以清除纤维组织细胞，弃去上清液(其中主要含成纤维细胞)。 2. 然后以0.1% Ⅱ型胶原酶10 ml，在37℃环境中消化 20 分钟，室温下磁力搅拌消化20 分钟。静置数分钟，收集消化液，室温下以1200 rpm离心10 分钟。去除上清液，用20% 胎牛血清的F12 培养液4 ml 悬 浮细胞，接种于75 ml 培养瓶中，补培养液8 ml 使每瓶液体量达到12 ml；对静置后沉淀部分可再重复以胶原酶消化20 分钟、磁力搅拌消化15 分钟、离心10 分钟，将获得的3 瓶细胞放置于二氧化碳培养箱，在5% CO2，95%空气，37℃温度下培养，24 小时后可见细胞贴壁生长，胞质开始伸展，换新鲜培养液，以后每隔48 小时换培养液(注：消化视具体情况而定，也可多消化 1 遍)。 3. 原代培养一般接种后第7 天能长满。传代时，取生长良好、贴壁松紧适度的成骨细胞 1 瓶，弃去培养 液，传代时先以 PBS 冲洗 2 遍，加 0.25%胰酶1 ml，室温下消化3～5 分钟，将胰蛋白酶液弃去，加 F12 培养液充分吹打8-10 分钟。将已消化的细胞收集、合并，计数；用 F12 完全培基调节至细胞浓度为合适浓 度。一般取2-5 代成骨
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细胞技术专题：大鼠胰岛细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
实验方法原理 水合氯醛腹腔麻醉，采用胶原酶ⅴ逆行灌注、原位消化及Ficoll-400梯度离心的方法分离、纯化大鼠胰岛，并分离、培养胰岛单细胞。 实验材料 一周龄Wistar 大鼠 试剂、试剂盒 D-Hanks’液 胰蛋白酶 Ⅴ型胶原酶 葡萄糖 碘乙酸 仪器、耗材 手术剪 手术钳 眼科剪刀 眼科镊子 大头针 手术刀片 培养皿 实验步骤 一、实验步骤 1. 一周龄Wistar大鼠，断颈处死，于75%乙醇浸泡15 分钟，无菌取出胰腺，于冰冷无菌D-Hanks’液中漂洗，用眼科剪仔细清除脂肪、包膜、血管等胰外组织，转入青霉素小瓶中。 2. 加入少量无菌D-Hanks’液，用眼科剪剪成0.1-1.0 mm3 大小的碎片，用滴管轻轻吸出上层细小脂肪碎块和油滴，再用无菌D-Hanks’液反复清洗 8~10 次，加入10 倍体积无菌消化酶液[胰蛋白酶-胶原酶消化液：0.05 g 胰蛋白酶，0.025 g Ⅴ型胶原酶(663 U/mg)，0.05 g 葡萄糖，溶于100mL 无Ca2+、Mg2+的0.01 mol/L PBS(pH 值为 7.4)溶液，用0.22 µm 微孔滤膜滤菌]，38℃±1℃消化，消化过程中不断震荡，10 分钟后弃去上清液。 3. 用无菌D-Hanks’液将组织块清洗 2~3 次，加入新鲜酶液继续消化，重复上述步骤，此时组织块边缘模糊。 4. 将组织块浸入消化酶液中，38℃±1℃消化10 分钟，将消化酶液与组织块分开，组织块重新加入新鲜消化酶液进行消化；而原消化酶液1500 rpm离心 10 分钟，取沉淀即为消化下的细胞，重新用无菌D-Hanks’悬浮，离心，重复 1~2 次，再用培养基洗 2~3 次，用培养基悬浮即得细胞悬液。 5. 将消化过的组织块重复消化5~6 次至组织块消化完全，重复以上操作。 6. 合并几次所得细胞悬液，计数，调整细胞浓度为 2×105个细胞/mL，将细胞悬液接种于24 孔塑料培养板中，每孔1 mL，置于37℃，5%CO2，饱和湿度培养箱中培养。 7. 由于成纤维细胞贴壁要比胰岛细胞迅速，接种15 h 后，轻轻振荡培养板，将上面未贴壁的细胞接入新的培养板中，可除去部分成纤维细胞。 8. 将新培养板中细胞培养 48 小时后，换新鲜配置的含
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细胞技术专题：肿瘤细胞的软琼脂集落培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
在体外培养基中由一个祖先细胞增殖形成的细胞团，称之为集落。肿瘤细胞能无限繁殖，所以具有这种能力，而成熟分化的细胞则不能形成集落。 实验方法 基本方案 实验方法原理 HL-60细胞是一种急性早幼粒细胞白血病细胞，在体外无需加刺激因子，可在软琼脂培养基中形成集落。二甲基亚砜是一种细胞分化诱导剂，经二甲基亚砜处理后的HL-60细胞按粒系途径定向成熟分化，同时细胞的增殖力降低，几乎全部细胞丧失了软琼脂中形成集落的能力。因此，这种方法可用于细胞分化的基础研究和临床肿瘤**的疗效检验等方面。 实验材料 HL-60细胞 试剂、试剂盒 小牛血清 RPMI1640培养液 台盼兰 琼脂 二甲基亚砜 仪器、耗材 超净工作台 二氧化碳培养箱 显微镜 培养瓶 吸管 酒精灯 血细胞计数板 多孔培养板 实验步骤 1. 收集对数生长期的HL-60细胞，先按实验十三测定细胞活力，然后调整细胞浓度，制成300~1 000活细胞/ml 的细胞悬液。 2. 取二个培养瓶每个瓶中加9 ml 调整好浓度的细胞悬液，然后各加入1 ml 3%琼脂（已融化，在65℃水浴中放置），迅速加入，混匀。 3. 用微量加样器吸140 μl 二甲基亚砜（MDSO），加到一个瓶中，充分混匀，为实验组，另一瓶不加DMSO，为空白对照组。 4. 取一个16 mm 多孔培养板，每孔加1 ml（35 mm 培养皿需加2 ml）细胞琼脂悬液，勿有气泡，将实验组和对照组分两组加好，盖上盖并作好标记。 5. 在室温放置20分钟使细胞琼脂悬液凝固。 6. 然后移培养板或平皿于CO2培养箱中37℃进行培养。 7. 培养7~10天，肉眼观察并计数细胞集落。 8. 结果：以肉眼可见的细胞团（含500个以上细胞）作为计数集落的标准。对照组HL-60细胞在含0.3%的软琼脂培养基中生长良好，每个孔中可见有多个集落形成，而实验组HL-60细胞因经二甲基亚砜诱导分化，细胞在软琼脂中的集落形成明显减少。 9. 集落的计数和计算： （1）集落数=n孔中细胞集落数总和/n孔 （2）集落形成率=集落数/接种培养细胞总数×100%
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细胞技术专题：staurosporine诱导小鼠心肌细胞凋亡模型构建
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
原代心肌细胞的培养及实验方案 取出生后0~24 h C57BL/6cr小鼠心脏，按改良的Lader方法进行细胞的分离。 获取博动的心脏迅速放置于无Ca2+、Mg2+的Hank’s平衡液中。剪碎心脏，放置在4℃条件下100 g/L的Trypsin溶液中消化16~18 h，用Trypsin抑制剂中止消化。然后在37℃下，用胶原酶Ⅱ于CO2培养箱内，在摇床上继续孵化消化45~60 min，最后用70 μm直径尼龙过滤网过滤获取心肌细胞，用含有25 mmol/L HCO3-，100 mL/L FSB，1×105 u/L青霉素G和50 g/L链霉素的M199培养基制成细胞悬液，按差速贴壁分离法纯化心肌细胞。加入10 μmol/L BrdU到细胞悬液，以6×105密度种植于96或24孔细胞培养板上，置37℃培养箱培养. 培养的心肌细胞24 h后更换含有10 μmol/L BrdU新鲜M199培养基，培养72 h后进行实验使用. 设立阴性、阳性对照及实验组，每组20孔；阳性对照加入4 μmol/L STS，实验组中加入4 μmol/L STS后再分别加入250 μmol/L DIDS或100 μmol/L NPPB，100 μmol/L Quinine和1 mmol/L BaCl2孵化4 h，更换新鲜M199培养基继续孵化4 h后进行各种指标的检测。 细胞存活试验 按照实验方案处理后的培养心肌细胞，每100 μL培养基的小孔中加入10 μL的MTT再孵化2 h，用分光比色仪进行检测，实验结果以细胞存活率表示，细胞存活率=A试验组/A对照组×100%. MTT法A值既能反映心肌细胞内线粒体脱氢酶活性，又能间接反映心肌细胞的增殖与存活情况. 凋亡琼脂糖凝胶电泳检测 收集24孔板处理过的细胞，弃上清加入50 μL含有200 mg/L的RNase细胞裂解液(10 μmol/L Tris.HCl，0.1 mol/L EDTA，5 g/L SDS)，37℃孵化1 h再加入500 mg/L蛋白酶K继续孵化。1 h后加入等体积的酚、氯仿、异丙醇（25∶24∶1）充分摇匀，离心取上清再加入等体积的氯仿抽提1次，转移的上清液中再加1/10体积3 mol/L醋酸钠及两倍体积的无水乙醇过夜后离心，700 mL/L的乙醇洗涤后，TE液溶解DNA，于20 g/L含有溴化乙锭的琼脂糖凝胶中电泳，紫外透射仪下观察、记录拍照. Caspase3活性的检测 使用Ap
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细胞技术专题：大鼠脑微血管内皮细胞原代培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
参考文献 [1] Grant GA et al. News Physiol Sci, 1998, 13：287 [2] Panula P et al. Experientia, 1978, 34：95 [3] 王建民等。解剖学杂志，1998，21：495 [4] 许彦钢等。微循环技术杂志，1997，2：63 [5] 钱志远等。细胞生物学杂志，1999，21：42 [6] Kis B et al. Neuroreport, 2001, 12：4139 [7] Szabo CA et al. Neurobiology (Bp), 1997, 5：1 [8] Abbott NJ et al. J Cell Sci, 1992, 103：23 [9] Gordon EL et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1991, 27A：312 [10] Diglio CA et al. Lab Invest, 1982, 46：554 [11] Rupnick MA et al. In Vitro Cell Dev Biol, 1988, 24：435 [12] Ichikawa N et al. J Pharmacol Toxicol Methods, 1996, 36：45 [13] Scott PA et al. J Cell Sci, 1993, 105：269 [14] Domotor E et al. Neurochem Int, 1998, 33：473
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细胞技术专题：兔膀胱平滑肌细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
二、参考文献 1. Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and their interaction with biopolymers. J Pediatr Surg, 2003,38(1):21-24. 2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI. Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder.Exp Physiol,1996,81(4):553-564. 3. ChamLey CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture. Physiol Rev,1979,599(1):1-61. 4. Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int,2003,92(4):476-478. 5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells. J Urol, 2001,165(2):627-632.
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如何选择蛋白印迹实验中的印迹膜
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
硝酸纤维素膜（NC膜）是蛋白和核酸杂交最常用的印迹膜，是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。目前市场上的NC膜产品数量众多，品质参差不齐。 从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。如果采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。Sartorius的NC膜是致密的 100% 硝酸纤维素滤膜，是用于Western、Northern和Southern杂交的优良滤膜。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，保证最大的蛋白结合量，可达150-200μg /cm2。除此之外，Sartorius的NC膜质的精良，具有良好的韧性与强度。相比传统的NC膜质地比较脆，漂洗一两次就会破损，Sartorius的NC膜的优势就凸显了出来，既能反复使用，又不易破损，是Western、Northern和Southern杂交实验的最佳选择。 从膜的选择上来看，根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。Sartorius的NC膜也有两种可供选择，几乎能够涵盖大多数用户的需求。孔径为 0.2 µm 的硝酸纤维素膜推荐用于转印小分子蛋白和核酸，能避免由于膜转移而导致的样品损失；孔径为 0.45 µm 的硝酸纤维素膜推荐用于转印大分子蛋白和核酸以及大多数分析型印
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细胞技术专题：大鼠星型胶质细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
大鼠星型胶质细胞培养可以：（1）用于神经系统发育、分化及再生等基础研究；（2）脑缺血预处理上调神经保护蛋白的机制研究；（3）脑损伤和脑疼痛的研究；（4）新蛋白的功能研究。 实验方法 酶消化法 胰酶消化法 胰蛋白酶消化法 实验方法原理 大鼠星形胶质细胞原代培养后，作胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞化学染色鉴定，应用缺氧D-Hank液及缺氧培养罐行OGD后用台盼蓝染色及乳酸脱氢酶(LDH)漏出率检测细胞损伤程度。 实验材料 Wistar大鼠乳鼠 试剂、试剂盒 FBS DMEM 胰蛋白酶 EDTA 酒精 仪器、耗材 眼科剪 滴管 离心机 培养皿 CO2培养箱 实验步骤 一、实验步骤 1. 新生1-2 天Wistar大鼠乳鼠，经75%酒精消毒，断头处死。 2. 取脑放入冷的D-Hanks’平衡盐溶液，去除脑膜及大血管。 3. 分离两侧大脑皮质并剪成1mm3 大小，加入0.25%胰蛋白酶37℃空气浴震荡消化10 min。 4. 用含10% FBS的DMEM培养基终止消化，离心(1 000 rpm，10 min)，去上清。 5. 用含10% FBS的DMEM培养基重悬沉淀，经75 µm 筛网过滤，收集滤液，再次离心10 min，收集沉淀用含10% FBS的DMEM培养基重悬，调整细胞密度至1.5×106/ml，种植于75 cm2 培养瓶。 6. 经1 小时差速黏附去除成纤维细胞后，将细胞悬液转移到一新的75 cm2 培养瓶继续培养，两天换液一次。 7. 7 天后将培养瓶放入水平摇床(260 rpm，2 h，37℃)，换液弃除小胶质细胞，放入培养箱平衡1 小时，重新置于水平摇床18 h。 8. 换液弃除少突胶质细胞，用新鲜培养基洗2 遍，加入0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA 1:1 混合液消化、传代备用。 二、 形态学观察 倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长状况。 三、 细胞生长曲线绘制 传代后的细胞以 2×104/ml 的密度种植于24 孔培养板中培养，3 天换液1 次， 每24 小时取3 孔计数，连续7 天，取均值绘制生长曲线。 四、星型胶质细胞的鉴定 胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫细胞组织化学鉴定方法。取星型胶质细胞去除培养
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细胞技术专题：大鼠肝星状细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、讨论进一步鉴别需要做免疫组化：Desmin 和α-SMA；后者在细胞激活后才表达。也采用过无须原位消化的方案，完全可行，只不过消化时间更难控制！实验采用原代培养的或传代后9代内的细胞(**5 代以内)。二、文献 1. 袁桃霞，张锦生，张月娥，等. 大鼠肝 Ito 细胞的体外培养及肝素对其抑制作用的观察. 上海医科大学 学报,1996,23(2):90-93. 2. Huang GC, Zhang JS, Tang QQ. Involvement of C/EBP-α gene in in vitro activation of rat hepatic stellate cells. Biochem Biophys Res Commun,2004,324(4):1309-1318.
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超纯水中常用术语介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
超纯水机品质的主要体现在超纯水水质方面。与超纯水相磁的术语主要有：电阻率、电导率、总有机碳量、微粒子、热源、微生物等。它们也是超纯水水质检测依据。 电阻率（resistivity）是用来表示各种物质电阻特性的物理量，与温度有关。单位是Ω·m或Ω.cm，超纯水中常用ΜΩ.cm。电阻率是超纯水中电解质含量的体现之一。通常，电阻率越大，超纯水纯度越高。 电导率：其物理学概念是在介质中该量与电场强度之积等于传导电流密度。对于各向同性介质，电导率是标量；对于各向异性介质，电导率是张量。通俗说，电导率是指物质传导电流的能力。单位是西门子每米（S/m）或μS/cm，超纯水技术指标中用μS/cm表示。水的导电性和水的电阻成倒数关系。水的电导率和电阻率主要受水中所含带电离子影响。 自然水中除了含有带电离子，还有其它多种杂质。有机物主要用总有机碳量表示。 总有机碳量（TOC）（或总有机碳）是以碳的含量表示有机物总量的一个指标。总有机碳量检测方法有很多种，艾柯超纯水机具有总有机碳量在线检测功能。
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动物行为学实验的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
行为是基因与环境相互作用的结果。基因的变化（如转基因，基因敲除或下调等）最终表现为与基因相关的行为变化；环境的变化（如声、光、电的刺激和药物的处理）不仅其本身可直接影响动物的行为，而且可通过对相关基因的影响而改变动物的行为。学习和记忆更是这种相关基因与环境相互作用的行为表现的一种形式。学习是一个获得外界环境信息（对动物而言）或有关世界知识（对人类而言）的过程；记忆则是对这种信息或知识进行加工（encoding）、储存（storage）和再现（retrieval）的过程。人类的记忆复杂，包括对事件与物体的明晰记忆（explicit memory）或描述性记忆（declarative memory）和与学习无关（如适应性和敏感性）或有关（如操作技术和习惯养成）的模糊记忆（implicit memory）或非描述性记忆（nondeclarative memory）。而动物记忆相对较为简单，包括短期记忆（shortterm memory）和长期记忆(long-term memory)；前者一般持续几分钟到几小时，后者则持续24小时到数天.数周甚至更长时间。与此相对应得是工作记忆(working memory)和参考记忆(reference memory)。工作记忆是将获得的信息进行加工并储存较短的时间，因而代表短期记忆；参考记忆是指对在整个实验过程中（测试的任何一天）均有用的信息进行加工储存的过程，因而代表长期记忆。 记忆的脑机制非常复杂，迄今仍不清楚。早在20世纪40年代末，著名神经外科医生Wilder Penfield 第一个获得证据表明，记忆的加工可能是在人脑的某些特殊部位进行。他从上千例的病人观察到，电刺激病人的脑颞叶皮层（temporal lobes）会产生一连串对早期经验的回忆，病人称之为“经验反应”（experiential response）。几年后一次偶然的机会，为了给一个患癫痫长达10年的病人施行脑手术**，Penfield将病人双侧的海马·杏仁核和部分颞叶皮层切除。术后发现，病人的癫痫症状大为改善。但出乎意料的是，病人的记忆同时受到破坏性的损害。虽然病人保留了几秒到几分钟的短期记忆，且对手
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