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细胞技术专题：细胞自噬的研究方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
正常培养的细胞自噬活性很低，不适于观察，因此，必须对自噬进行人工干预和调节，经报道的工具药有： 一、自噬诱导剂 (1) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模拟内质网应激 (2) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化锂）：IMPase 抑制剂（即Inositol monophosphatase，肌醇单磷酸酶） (3) Earle's平衡盐溶液：制造饥饿 (4) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制剂 (5) Rapamycin：mTOR抑制剂 (6) Xestospongin B/C：IP3R阻滞剂 二、自噬抑制剂 (1) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制剂 (2) Bafilomycin A1：质子泵抑制剂 (3) Hydroxychloroquine（羟氯喹）：Lysosomal lumen alkalizer（溶酶体腔碱化剂） 除了选用上述工具药外，一般还需结合遗传学技术对自噬相关基因进行干预：包括反义RNA干扰技术（Knockdown）、突变株筛选、外源基因导入等。 三、自噬过程进行观察和检测 细胞经诱导或抑制后，需对自噬过程进行观察和检测，常用的策略和技术有： 1、观察自噬体的形成 由于自噬体属于亚细胞结构，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为：新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体（AV1）的特征为：双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体（AV2）的特征为：单层膜，胞浆成分已降解。（autophagic vacuole，AV） 2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成 由于电镜耗时长，不利于监测（Monitoring）自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中；自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。 3、利用Western Blot检测LC3-II/I比值
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医用离心机安全使用常识
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
医用离心机安全使用常识 1.如何安全使用离心机 1.1 正确安装 (1)电源电压:电压波动要符合+10%以内的国家标准，否则一些厂家的离心机是不能正常运转。如果电压波动在此以上，建议用稳压器，以供符合此电网。 (2)地线要牢:房间的电源的布线要符合要求。我国是三相四线制。三相是工业电中的三相，使用三相电时零线与地线分开，更重要的是不管是三相工业电也好，一般的单相电也好，地线应可靠，以免漏电，地线不能接在暖气管、自来水管上。 (3)地面要平整、牢固:对大型离心机而言，在安装地点搬动地板要牢固，保证离心机的转子正常工作，不陷凹进去，安装固定处地面应平整且牢固。 (4)找好水平:找较准确的小型水平尺，离心机盖子打开，在主轴上找水平，通过调整4个脚轮旁边的调整螺栓的拧动来找好水平，注意其中1脚不能落空。 1.2 装样找平衡 离心机在设计与制造时，对转子的加工误差带来的不平衡，已作了动平衡试验的补救，但凡是离心机，都有其允许的装样不平衡量。离心机厂商为了在离心机允许的最大不平衡限量这一指标上与其他厂家竞争，尽量给出较大值。在这较大值上，离心机可以运转，但这时产生的不平衡力以每分钟ｎ次频率猛然冲击轴承及支架，离心机是受损伤的。因此，用户对那些昂贵的离心机，尽量找好平衡后离心，对离心机的寿命有好处。 1.3 清理离心腔内的积水 离心机运转时使用制冷，由于空气的水分，在离心腔内结霜，停机后霜化为水。大部分国外的低速大容量离心机，没有排水孔，离心腔中水愈积愈多。此时，用户应自行拆下转子，清理积水。在重新安装转子时，一定要装好，避免出事故。 1.4 铝合金不能受腐蚀 离心机转子一般是用铝合金制造，当受腐蚀后强度降低，容易出事故。铝合金易受液体腐蚀，清洗后应用吹风机吹干，或倒置一段时间，确认干了才能使用。有的血站进口离心机，6个铝杯里应有的6个塑料托没有。塑料托中应放血袋，避免直接放在铝杯里
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捕食应激致大鼠的持续性情绪唤醒障碍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
摘要 目的：探讨严重心理应激是否可引发实验大鼠较长时间的情绪唤醒水平障碍，以建立较理想的创伤后应激障碍动物模型。 方法：实验于2004- 01 /2005- 06 在解放军成都军区成都总医院完成。选择雄性Wistar 大鼠135只, 成组设计随机分为捕食应激组75 只和正常对照组60 只。先将大鼠放入捕食应激实验箱的小笼中，再将一只饥饿的猫放入实验箱中，使猫与大鼠无生理伤害性接触，致大鼠出现轻微惊恐性颤动及因惊吓所致呼吸急促而快速鼻翼煽动6～8 min；正常对照组大鼠除不接触猫外，其他处理程序相同。并通过大鼠运动活性、探究行为、拒俘反应性和高架十字迷宫实验观测应激后4个月内实验大鼠情绪唤醒水平改变，同时以Morris 水迷宫法检测其空间学习和记忆能力。采用SPSS 9.0 软件进行单因素或双因素方差分析，以及各组均数的SN-K法和Tamhane’s T2 法检验。 结果：参与实验大鼠135只在实验过程中无死亡，均进入结果分析。①与正常对照组相比，捕食应激后1个月内应激大鼠旷场爬越行为明显减少[（71.5±13.5），（96.8±18.4）分，P < 0.05]；4 个月时后肢性站立仍明显减少[（11.4±2.1），（17.9±3.3）分，P < 0.05]。②与正常对照组相比，高架十字迷宫实验中应激大鼠进入开臂次数百分比和开臂滞留时间百分比均明显降低[(4.8±0.9)%，(20.7±3.7)%，P < 0.01]；[(0.9±0.2)%，(6.6±1.2)%，P < 0.01]。③与正常对照组相比，拒俘反应性则在应激后2 个月内明显增加[（2.4±0.5），（1.5±0.4）分，P < 0.05]。④与正常对照组相比，捕食应激后第1 天应激大鼠在Morris 水迷宫空间觅向训练中潜伏期明显延长训练15 次时为(32±6)，(17±3) s，P < 0.05]，在空间定向能力测试时应激大鼠水迷宫的4个象限中无目的漫游所花费时间百分比差异无显著性意义。应激后2 周时大鼠空间学习和记忆能力测试无明显改变。 结论:单纯捕食应激成功诱发了实验大鼠持续性运动活性减少、探究行为受抑、警觉水平过高、焦虑不安状态、环境适应能力下降、惊恐逃避反应等多
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366nm大肠埃希氏菌测定荧光观察仪使用方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
366nm检测用紫外灯, 用于水及食物中的微生物检测，如水中大肠埃希氏菌在含MUG 的培养基中培养后，即会产生荧光反应也可用于实验室蛋白质及化合物的检测。 大肠埃希氏菌定义 大肠埃希氏菌是指能产生β-半乳糖苷酶（β-D-galactosidase）分解ONPG（Ortho-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside）使培养液呈黄色，能产生β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase）分解MUG（4-methyl-umbelliferyl-β-D-glucuronide）使培养液在波长366nm紫外光下产生荧光的细菌。 检测重要性 《生活饮用水标准检验方法》GB/T 5750-2006中将大肠埃希氏菌列入检测项目中。并在解读《生活饮用水卫生标准》GB5749-2006中阐述：“只有埃希氏大肠杆菌是粪源特异性的，是最准确和专一的粪便污染指示”。 二、用途 ： 大肠埃希氏菌测定荧光观察使用方法：将台式紫外光灯置于暗处，插上电源，将经过24小时培养后的EC-MUG管在灯下照射，如有蓝色荧光产生则为大肠埃希氏菌阳性管； 三、注意事项： 每次观察时，用一个没开封的EC-MUG管和被测的EC-MUG管在紫外光灯同时观察，如果被测的EC-MUG管产生荧光，在紫外光灯下与没开封的EC-MUG管比较，有明显的区别。每次测试完后将电源拔掉。 四、具体方法:取供试液10ml(相当于供试品1g、1ml）,直接或处理后接种至适量(不少于100ml)的胆盐乳糖培养基中,培养18--24小时,必要时可延长至48小时. 取上述培养物0.2ml,接种至含5mlMUG培养基的试管内,培养,于5小时、24小时在366nm紫外线下观察,同时用未接种的MUG培养基作本底对照.若管内培养物呈现荧光,为MUG阳性,不呈现荧光,为MUG阴性.观察后,沿培养管的管壁加入数滴靛基质试液,液面呈玫瑰红色,为靛基质阳性,呈试剂本色,为靛基持阴性.本底对照应为MUG阴性和靛基质阴性. 如MUG阳性,靛基质阳性,判供试品检出大肠埃希菌; 如MUG阴性,靛基质阴性,判供试品未检出大肠埃希菌;如MUG阳性,靛基质阴性,或MUG阴性,靛基质阳性,则应取胆盐乳糖培养基的培养物划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基
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新方法：NanoString技术检测微创穿刺样品蛋白表达
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
NanoString技术由于其高灵敏度，高重复性并且检测过程中不需要进行反转录和扩增，一经推出便受到了广泛的关注和认可。现在这项技术广泛的应用在基因表达（mRNA），小RNA（miRNA），拷贝数变异（CNV），长链非编码RNA（lncRNA）等方面的检测，但是这些检测的对象都是核酸，对于细胞蛋白的表达还无能为力。最近，在Science Translational Medicine 杂志上刊登了一篇题为“Cancer Cell Profiling by Barcoding Allows Multiplexed Protein Analysis in Fine-Needle Aspirates”的研究论文，报道了Adeeti V. Ullal和他的同事开发的一种基于NanoString技术的新的检测蛋白质表达的方法。该方法利用NanoString技术的高灵敏度和不需反转录的特点，可以准确的检测用微创穿刺（Fine-needle aspirates，FNAs）方法取得的微量样本中的细胞表面蛋白的表达情况。 在理想的状况下，临床样本应该在疾病发展不同阶段连续取材，用以跟踪关键蛋白的变化情况。但是这种取材方式费用高，损伤大。而用微创穿刺方法则可以进行连续的取材，但是由于这种方法取到的细胞数量很少，限制了可分析蛋白的数量。尽管复用流式细胞仪（multiplexed flow cytometry）和质谱流式细胞技术（mass cytometry）可以用于检测少量的细胞。但是，复用流式细胞仪由于光谱重叠，可以检测的标志物（marker）很有限。而质谱流式细胞技术在样品制备过程中会损失很多的样品，因此这两种技术都不适用于检测微量样本来源的蛋白质组信息。 Adeeti V. Ullal和他的同事设计ABCD检测平台（antibody barcoding with photocleavable DNA，ABCD）该平台用一种带有DNA标签的抗体对细胞表面蛋白进行检测，这种DNA标签由一段化学性质稳定且可被光裂解的小分子连接片段连接到抗体分子上，这样每一种蛋白对应唯一的一种抗体，每一种抗体对应唯一的DNA标签，我们只需要检测DNA标签就可以知道细胞表面蛋白的表达情况。在与目的细胞结合后，洗去多余未结合的抗体，并且用光脉冲把DNA标签解
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动物脂肪含量测定方法比较
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
EchoMRI体成分分析仪的专利技术，使其在动物脂肪含量测定、体成分分析研究中优于DXA、CT、MRI、全身电导率发等传统方法。 肥胖症发生率正逐年增加，并有加速提高的趋势。肥胖症长伴发糖尿病、脂肪肝、血脂紊乱、高血压、冠心病等多种慢性疾病，是严重影响人们健康和生活质量的疾病之一，已成为世界各国面临的严重公共健康问题。专家指出，肥胖症、艾滋病、吸毒和酗酒共同组成了新的四大社会医学难题。因此，开展与肥胖相关的课题研究是当前的迫切任务。 一直以来，我们利用实验动物模型（如小鼠，大鼠）对人类肥胖的病因及**肥胖的方法做了大量相关研究。在此类研究中，最重要的一点是我们需要找到可靠、准确的测量动物身体成分的方法。化学分析法是测量身体成分的金标准，可这种方法需要将动物杀死，因此不能对动物进行长期反复地测量。另外，化学分析方法的过程耗时长且工作量大。因此，快速地体内测量的方法对于测量随时间而发生变化的身体成分来说就至关重要。目前有几种身体成分测定方法，如双能X射线吸收测定法(Dual Energy X-ray Absorptiometry，DXA)，计算机断层扫描（Computed Tomography，CT），磁共振成像(Magnetic Resonance Imaging,MRI)，同位素稀释法，全身电导率法(Total Body Electrical Conductivity, TOBEC)及定量磁共振法（QMR），以下分别就每种方法的特点做一简单介绍。 DXA, CT和 MRI 都是非入侵性的，非破坏性的方法。 1. 双能X射线吸收法 DXA体内测定脂肪的是在利用骨密度测定仪测量骨密度的基础上，扩展和延伸用于测脂肪含量及分布。改装置由一种超稳定X射线发生器发射一束宽波长的射线束，通过X线束滤过式脉冲技术可获得两种能量的X线，即高能和低能两束不同能量的弱X线，X线穿过受检部位后，被与X线管球同步移动的高及低能探测器所接受，将信号传送到计算机进行数据处理，就可以计算出身体脂肪组织、非脂肪组织和骨矿物质含量、骨矿密度等参数，扫描的时间大约为6分钟。这种方法曾经被
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慢病毒的包装简介及其应用范围
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
，（ Lentivirus ）载体是以 HIV-1 （人类免疫缺陷 I 型病毒）为基础发展起来的基因**载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因**效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。 目前慢病毒也被广泛地应用于表达 RNAi 的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的 siRNA 半衰期短，体外合成慢病毒(RNAi)对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达 siRNA 的载体，然后转移到细胞内转录慢病毒(RNAi) 的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成 siRNA ，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的 慢病毒(RNAi) 表达载体中，是由 RNA 聚合酶Ⅲ启动子来指导 RNA 合成的，这是因为 RNA 聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的 RNA 不会带 poly A 尾。当 RNA 聚合酶Ⅲ遇到连续 4 个或 5 个 T 时，它指导的转录就会停止，在转录产物 3' 端形成 1~4 个U 。 U6 和 H1 RNA 启动子是两种 RNA 聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～ 21ntRNA 和～ 50ntRNA 茎环结构（ stem loop ）。在 siRNA 表达载体中，构成慢病毒(RNAi)-siRNA 的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录，然后两条链互补结合形成 siRNA ；也可由载体直接表达小发卡状 RNA(small hairpin RNA, shRNA)，慢病毒载体包含位于 RNA 聚合酶Ⅲ启动子和 4 ～ 5 T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有 1~4 个 U 3 ' 突出端的茎环结构，在细胞内进一
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实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）分类以及实验步骤介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）技术（Real-time quantitative PCR），是指在（QPCR，荧光定量）反应体系中加入荧光基因，利用荧光信号积累实时监测整个（QPCR，荧光定量）PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 实时荧光定量PCR技术于1996年由美国AppliedBiosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，已成为国际公认的核酸分子定量的标准方法，目前（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）在基因表达研究和临床疾病检测等领域已得到广泛应用（如转基因动植物检测、RNAi基因失活率检测、病原微生物或病毒含量检测、基因差异表达、基因分型）。本公司用Sybrgreen法或者Taqman法Real-time PCR，QPCR，荧光定量）对DNA/RNA 进行实时荧光定量PCR（Real-time PCR） 的定量测定或型的鉴定。 实时荧光定量PCR（Real-time PCR，QPCR，荧光定量）分类： ☆TaqMan荧光探针（Real-time PCR，QPCR，荧光定量） PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5‘-3‘外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 ☆SYBR Green荧光染料法：Real-time PCR|QPCR SYBR Green是一种DNA结合染料，能非特异地掺入到双链DNA中去。在游离状态下，它不发出荧光，但一旦结合到双链DNA中以后，便可以发出荧光。在Real-time PCR|QPCR实验中它的最大优点就是可以与任意引物、模板相配合，用于
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多克隆抗体的免疫电泳操作流程
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
（多克隆抗体）的免疫电泳实验原理： 多克隆抗体的免疫电泳又称为γ球蛋白电泳或免疫球蛋白电泳技术，这是一种能够判断血液中三种免疫球蛋白IgM, IgG, IgA含量水平的实验方法。在多克隆抗体的免疫电泳验技术中，首先利用蛋白质的分子量和所带电荷的比值运用水平琼脂糖凝胶电泳技术将蛋白质进行分离，然后将特异性的多克隆抗体引入到与电泳方向平行的凹槽中，在抗原和多克隆抗体的扩散过程中，抗原和抗体适当比例的结合会导致沉淀的产生。0.85%盐不仅可以终止扩散过程也可用于洗去未结合的蛋白，抗原和抗体结合所形成的沉淀线即可以肉眼观察也可利用染色方法观察。 多克隆抗体的免疫电泳技术不仅可用于血清或尿样中单克隆抗体的鉴定，也可用于其它方面，比如免疫复合物的筛选、各种异常丙种球蛋白血症的识别和鉴定等。免疫电泳技术也是进行蛋白质常规评价的一种可靠，精确的实验方法，可观察蛋白质结构的变化和浓度的改变。 （多克隆抗体）的免疫电泳实验试剂 1. 水平电泳仪 2. 打孔器 3. 滴管 4. 刀片 5. 电源 6. 水浴(55℃) 7. 烧杯(400-600ml) 8. 加样枪(5-100μl) （多克隆抗体）的免疫电泳实验设备 1. 纯化的抗体;蛋白质混合物;1%琼脂。 2. Tris-巴比妥缓冲溶液：2.24g 巴比妥酸，4.43g Tris，0.053g 乳酸钙及0.065g 叠氮化钠溶于100ml 蒸馏水中。 3. 电泳缓冲溶液：将Tris-巴比妥缓冲溶液与蒸馏水按1：4的比例混合。 （多克隆抗体）的免疫电泳实验实验步骤 1. 准备琼脂糖凝胶 将琼脂和电泳缓冲溶液混合放入90℃水浴加热至溶化，制成1%琼脂，将琼脂在冷却前铺在水平玻璃板上，待冷却至室温后，按图用内径4毫米的打孔器打孔及制作凹槽。 2. （多克隆抗体）电泳 将用电泳缓冲溶液稀释的4%-5%的抗原用滴管小心放入小孔中，将胶板放入电泳槽中并用润湿的滤纸将胶板和电泳槽中的缓冲溶液相连。盖上电泳槽盖，接通电源，6V/cm通电至前沿移动约35mm，时间约为1小时，利用示踪染料判断移动距离。 3. （多克隆抗
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细胞凋亡（TUNEL，TUNEL染色）检测技术简介
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
细胞凋亡是指为维持内环境稳定， 生物体内细胞在特定的内源或外源信号诱导下，其死亡途径被激活，并在有关基因的调控下发生的程序性死亡过程。细胞凋亡是程序性死亡过程的一种主要形式，它涉及染色质凝聚和外周化、细胞质减少、核片段化、细胞质致密化、与周围细胞联系中断、内质网与细胞膜融合，最终细胞片段化形成许多细胞凋亡体。 细胞凋亡用（TUNEL，TUNEL染色）（TdT-mediated dUTP nick end labeling）细胞凋亡检测试剂盒来检测。细胞凋亡检测试剂盒是用来检测组织细胞在凋亡早期过程中细胞核DNA的断裂情况。细胞凋亡检测其原理是荧光素标记的12-dUTP在末端脱氧核苷转移酶(TdT)的作用下，连接到凋亡细胞中断裂的DNA的3’-OH末端，利用由荧光显微镜或者流式细胞检测仪检测凋亡的发生。 与坏死是两种完全不同的细胞凋亡形式，细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。细胞凋亡是细胞的一种基本生物学现象，在多细胞生物去除不需要的或异常的细胞中起着必要的作用。它在生物体的进化、内环境的稳定以及多个系统的发育中起着重要的作用。细胞凋亡不仅是一种特殊的细胞死亡类型，而且具有重要的生物学意义及复杂的分子生物学机制。凋亡是多基因严格控制的过程。 根据死亡细胞在形态学、生物化学和分子生物学上的差别，可以将二者区别开来。细胞凋亡的检测方法有很多，下面介绍几种常用的测定方法。 一、细胞凋亡的形态学检测 根据凋亡细胞固有的形态特征，人们已经设计了许多不同的细胞凋亡形态学检测方法。 1 光学显微镜和倒置显微镜检测细胞凋亡： （1） 未染色细胞：凋亡细胞的体积变小、变形，细胞膜完整但出现发泡现象，细胞凋亡晚期可见凋亡小体。贴壁细胞出现皱缩、变圆、脱落。 （2） 染色细胞：常用姬姆萨染色、瑞氏染色等。凋亡细胞的染色质浓缩、边缘
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细胞凋亡，细胞凋亡通路和细胞凋亡检测的几种检测方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察：细胞凋亡后呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽”现象。 2、丫啶橙(AO)染色，观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。细胞凋亡|后（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色：（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）：如果不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近吞噬现象。 二、 (一)、检测原理（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测） 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但细胞凋亡后DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180-200bpDNA片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 (二) 细胞凋亡，结果判断 正常活细胞 电泳出现阶梯状(LADDER)条带; （细胞凋亡）后，坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 三、酶联免疫吸附法(ELISA)核小体测定（细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测） 细胞凋亡的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA法检测，细胞凋亡。 (一) （细胞凋亡,细胞凋亡通路，细胞凋亡检测）检测步骤 1、细胞凋亡后，将其裂解后高速离心，其上清液中含有核小体 2、在微定量板上吸附组蛋白体 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DN
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细胞技术专题：小鼠腹腔巨噬细胞原代培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
小鼠腹腔巨噬细胞原代培养可以：（1）用于细胞保种；（2）用于分子生物学研究；（3）用于基因**研究。 实验方法 腹腔取材法 实验方法原理 巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。巨噬细胞容易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2－3周，多用做原代培养，难以长期生存。 巨噬细胞也建有无限细胞系，大多来自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均获恶性，培养中呈巨噬细胞形态和吞噬功能，易于传代和瓶壁分离，但难以建株。 实验材料 小鼠 试剂、试剂盒 RPMI1640培养基 酚红 酒精 小牛血清 巯基乙醇酸钠 双抗 培养液 小牛血清 青霉素 链霉素 台盼兰 碘酒 仪器、耗材 绵球 手术直剪 注射器 培养皿 超净台 解剖板 眼科剪 离心管 眼科镊 实验步骤 一、实验材料准备 1. 动物：各个品系的小鼠2-4只。 2. 试剂：RPMI1640培养基(含酚红)，小牛血清，双抗，培养液(10%小牛血清、RPMI1640、双抗)，台盼兰等。碘酒绵球和酒精绵球。 3. 器械：一次性注射器、手术器械。 二、实验方法 如果采用刺激物，则可在实验前三天腹腔注射3%巯基乙醇酸钠每只2 mL，获得的巨噬细胞数要多一些。不采用刺激物，直接开始下面的步骤。 1. 拉颈处死小鼠，在75%酒精浸泡1-2分钟，移入超净台中，仰卧位固定于解剖板上，碘酒消毒腹部皮肤，酒精绵球脱碘。用手术直剪充分剪开腹部皮肤，暴露腹部肌层，再用酒精绵球消毒腹部肌层。 2. 用注射器抽取5 mL含双抗的RPMI1640培养基注入腹腔，用绵球轻揉腹部1-2 min，然后，用眼科镊稍提起腹腔，并用眼科剪剪开一个小口，用吸管吸取细胞悬液，移入离心管中(个人认为，此法比用注射器抽吸好一些)。 3. 1 000 rpm离心5 min后，用含双抗的RPMI1640培养基洗涤一次，再次离心，重悬细胞于含10%小牛血清的RPMI1640培养液中，如果是作为饲养细胞使用，则选择相应的培养液。台盼蓝拒染法
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细胞技术专题：大鼠主动脉内皮细胞培养实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
大鼠血管内皮细胞培养可以：（1）用于血液流动性、防止血栓形成、调节血管张力等研究；（2）用于选择性通透性以及免疫调节等方面研究。 实验方法 贴块法 实验方法原理 贴块法适用于内皮细胞产量低的、管径较小血管的内皮细胞培养，其方法较酶消化法简便、经济。但缺点使易混有成纤维细胞和平滑肌细胞，前者的贴壁时间和内皮接近，后者贴壁较内皮慢，而且会被肝素所抑制。 实验材料 雄性Wistar大鼠 试剂、试剂盒 DMEM 胎牛血清 内皮细胞生长因子 肝素钠 青链霉素 明胶 胰蛋白酶 PBS D-Hanks’液 仪器、耗材 手术器械 眼科剪 眼科镊 培养皿 手术刀 培养瓶 CO2培养箱 实验步骤 一、实验方法 1. 颈椎脱臼处死大鼠，将整个大鼠浸泡于75%乙醇中消毒约1 min。在无菌状态下，逐层剪开胸腔，分离取出主动脉，放含无菌 D-Hanks’液培养皿中。 2. 用眼科剪、镊尽量去除血管外膜的脂肪和纤维组织。然后，用含抗生素的D-Hanks’液冲洗血管的外表面及血管腔内的凝血数次，再放入另一无菌培养皿中。 3. 用眼科剪纵向剪开血管，平展在培养皿中。用非常锐利的手术刀将其切成1 mm3 大小的动脉植 块(或者用剪刀剪，依照个人习惯)，然后种植到培养瓶或培养皿(培养瓶或皿用1%明胶预置 37℃下过夜， 使用前2 h 移入CO2培养箱中。用时可以先经含 10%小牛血清的培养液冲洗)。将动脉植块的内膜面与瓶底接触，种植密度约为 1 块/cm2 。 4. 置培养箱中静置2 h(干贴壁)。然后，加入0.5 ml 含 25%胎牛血清的培养液，液量以略盖过动脉植块内膜面，而又不使植块漂浮为宜。24 h 后，更换培养液，加入 2-3 ml 培养液。 5. 72 h 左右的时候，当观察到内皮细胞充分长出，而成纤维细胞刚要长出的时候，将动脉植块除去，刮除成纤维细胞，换培养液1 次。以后每2 天换液一次，每次换1/2~1/3 的液量。继续培养 8-10 d， 细胞融合成单层，即可传代。二、实验结果 植块培养法进行的原代培养，一般在培养2-3 天，动脉植块周围即有细胞生长，并渐
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细胞技术专题：细胞周期测定实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
标签： 细胞周期 体外培养 周期测定 细胞周期测定可以：（1）作为生物相容性评价指标；（2）用于研究细胞凋亡；（3）作为选择细胞的依据。 实验方法 细胞计数法 BrdU渗入法 流式细胞仪测定法 实验方法原理 体外培养细胞 生长、分裂繁殖的能力，可用分裂指数来表示。它与生长曲线有一定的联系，如随着分裂指数的不断提高，细胞也就进入了指数生长期。 分裂指数指细胞 群体中分裂细胞 所占的百分比，它是测定细胞 周期的一个重要指标，也是不同实验研究选择细胞的重要依据。 实验材料 细胞 试剂、试剂盒 胰酶 甲醇 培养液 冰醋酸 Giemsa染液 仪器、耗材 CO2培养箱 普通显微镜 培养皿 盖玻片 吸管 实验步骤 一、消化细胞 ，将细胞 悬液接至内含盖玻片的培养皿中。 二、CO2培养箱中培养48小时，使细胞长在盖片上。 三、取出盖片，按下列顺序操作： PBS漂洗3分钟→甲醇：冰醋酸=3：1固定液中固定30分钟→Giemsa液染色10分钟→自来水冲洗。 四、盖片晾干后反扣在载玻片上，镜检。 五、计算分裂指数=分裂细胞 数/总细胞 数×100% 注意事项 1. 操作时动作要轻，以免使盖片上的细胞脱落。 其他 一、Giemsa染液配制称Giemsa粉末0.5 g，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33 ml）。56℃中保温90-120分钟。加入33 ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。使用时按要求用PBS稀释。一般稀释10倍。 实验方法原理 细胞周期指细胞一个世代所经历的时间。从一次细胞分裂结束到下一次分裂结束为一个周期。细胞周期反应了细胞增殖速度。 单个细胞的周期测定可采用缩时摄影的方法，但它不能代表细胞群体的周期，故现多采用其他方法测群体周期。 BrdU（5-溴脱氧尿嘧啶核苷）加入培养基后，可做为细胞DNA复制的原料，经过两个细胞周期后，细胞中两条单链均含BrdU的DNA将占l/2，反映在染色体上应表现为一条单体浅染。如经历了三个周期，则染色体中约一半为两条单体均浅染，另
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细胞技术专题：平板细胞克隆形成试验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
概念： 细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。 基本步骤： 1、取对数生长期的各组细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在10%胎牛血清的DMEM培养液中备用。 2、将细胞悬液作梯度倍数稀释，每组细胞分别以每皿50、100、200个细胞的梯度密度分别接种含10mL 37℃预温培养液的皿中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37℃ 5% CO2及饱和湿度的细胞培养箱中培养2～3周。 3、经常观察，当培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定细胞5mL固定15分钟。然后去固定液，加适量GIMSA应用染色液染10～30分钟，然后用流水缓慢洗去染色液，空气干燥。 4、将平皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数大于10个细胞的克隆数。最后计算克隆形成率。 克隆形成率 =（克隆数/接种细胞数）×100% 平板克隆形成试验方法简单，适用于贴壁生长的细胞。适宜底物为玻璃的、塑料瓶皿。试验成功的关键是细胞悬液的制备和接种密度。细胞一定要分散得好，不能有细胞团，接种密度不能过大。
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