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PCR技术专题：差示反转录PCR实验
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
差示反转录PCR也称为mRNA差异显示技术，它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术，具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高、可同时检测两种或两种以上经不同处理或处于不同发育阶段的样品，该方法自问世以来已被广泛用于差异表达基因的克隆鉴定研究中。 实验方法 mRNA差异显示法 荧光标记法 实验方法原理 几乎所有的真核基因mRNA分子的3’-末端，都带有一个多聚的腺苷酸结构，即通常所说的poly(A)尾巴。因此，在RNA聚合酶的作用下，可按mRNA为模板，以oligo(dT)为引物合成出cDNA拷贝。根据mRNA分子3’-末端序列末端结构的分析可以看到，在这段poly(A)序列起点碱基之前的一个碱基，除了为A的情况之外，只能有C、G、T三种可能。根据这种序列结构特征，P.Peng等人设计合成三中不同的下游引物，它由11个或12个连续的脱氧核苷酸加上一个3’-末端锚定脱氧核苷酸组成，用5’-T11G、5’-T11C、5’-T11A表示，这样每一种此类人工合成的寡核苷酸引物都将能够把总mRNA群体的1/3分子反转录成mRNA-cDNA杂交分子。于是，采用这三种引物，可以将整个mRNA群体在cDNA水平上分成三个亚群体。然后用一个上游的随机引物和与反转录时相同的oligo(dT)引物对这个cDNA亚群体进行PCR扩增，因为这个上游的引物将随机结合在cDNA上 ,因此来自不同mRNA的扩增产物的大小是不同的，可以在测序胶上明显分辨开来，从而筛选出不同样品间基因差异表达的DNA片段。 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 一、实验材料 1. 红豆杉细胞 未经MJ诱导处理的A和经MJ诱导处理的B红豆杉细胞。 2. 寡核苷酸引物 （1）3’锚定引物： ①H-T11A(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTA-3’ ②H-T11C(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTC-3’ ③H-T11G(2uM)： 5’-AAGCTTTTTTTTTTTG-3’ （2）5’ 随机引物： Kit引物： ①H-AP1(2uM)： 5’-AAGCTTGATTGCC-3’ ②H-AP2(2uM)： 5’-AAGCTTCGACTGT-3’ ③H-AP3(2uM)： 5’-AA
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蛋白质技术专题：蛋白质免疫印迹（Western Blot ）
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）可以：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。 实验方法 底物化学发光ECL法 Western印迹法 图解 实验方法原理 Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 实验材料 试剂、试剂盒 仪器、耗材 实验步骤 一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。 4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。 5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。 6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。 二、蛋白样品制备 1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取 （1） 倒掉培养液，并将
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蛋白质技术专题：蛋白质的表达、分离和纯化
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
目的要求 （1）了解克隆基因表达的方法和意义。 （2）了解重组蛋白亲和层析分离纯化的方法。 实验原理 克隆基因在细胞中表达对理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时克隆基因表达出所编码的蛋白质可供作结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目标蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21中，在 37℃，IPTG诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白可用一种通过共价偶连的次氨基三乙酸（NTA）使镍离子（Ni2+）固相化的层析介质加以提纯，实为金属熬合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚凝胶电泳进行分析。 试剂和器材 一、试剂 [1] LB液体培养基：Trytone 10g, yeast extract 5g, NaCl 10g, 用蒸馏水配至1000mL. [2] 氨苄青霉素：100mg/mL [3] 上样 缓冲液：100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 10 mM2-ME, pH8.0 [4] Washing Buffer：100 mM NaH2PO4, 10 mM Tris, 8 M Urea, pH6.3 [5] Elution Buffer:100 mM NaH2PO4, 10 mMTris, 8M Urea, 500 mM Imidazole, pH8.0 [6] IPTG 二、器材 摇床，离心机，层析柱（1′10 cm） 操作方法 一、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导 1. 接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白的大肠杆菌BL21菌株于5mL LB液体培养基中（含100ug/mL 氨苄青霉素），37℃震荡培养过夜。 2. 转接1mL过夜培养物于100mL（含100ug/mL 氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃震荡培养至OD600 = 0.6 - 0.8。取10ul 样品用于SDS-PAGE 分析。 3. 加入IPTG至终浓度0.5 mmol/l, 37℃继续培养1-3h. 4. 12，000rpm 离心10 min, 弃上清，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃冰箱中。 二、氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化 1. NTA层析柱的准备：在层析柱中加入1mL NTA介质，并
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蛋白质技术专题：免疫共沉淀(Co-IP)详细步骤教程
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
一、原理：免疫共沉淀（Co-Immunoprecipitation）是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。是确定两种蛋白质在完整细胞内生理性相互作用的有效方法。其原理是：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。目前多用精制的prorein A预先结合固化在argarose的beads上，使之与含有抗原的溶液及抗体反应后，beads上的prorein A就能吸附抗原达到精制的目的。这种方法常用于测定两种目标蛋白质是否在体内结合；也可用于确定一种特定蛋白质的新的作用搭档。 其优点为：（1）相互作用的蛋白质都是经翻译后修饰的，处于天然状态；（2）蛋白的相互作用是在自然状态下进行的，可以避免人为的影响；（3）可以分离得到天然状态的相互作用蛋白复合物。缺点为：（1）可能检测不到低亲和力和瞬间的蛋白质－蛋白质相互作用；（2）两种蛋白质的结合可能不是直接结合，而可能有第三者在中间起桥梁作用；（3）必须在实验前预测目的蛋白是什么，以选择最后检测的抗体，所以，若预测不正确，实验就得不到结果，方法本身具有冒险性。 二、准备工作： 预冷PBS，RIPA Buffer，细胞刮子（用保鲜膜包好后，埋冰下），离心机 1. 用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS； 2. 加入预冷的RIPA Buffer(1ml/107个细胞、10cm培养皿或150cm2培养瓶，0.5ml/5×106个细胞、6cm培养皿、75cm2培养瓶) 3. 用预冷的细胞刮子将细胞从培养皿或培养瓶上刮下，把悬液转到1.5EP管中，4℃，缓慢晃动15min（EP管插冰上，置水平摇床上） 4. 4℃，14000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管中 5. 准备Protein A agarose，用PBS 洗两遍珠子，然后用PBS配制成50%浓度，建议减掉枪尖部分，避免在涉及琼脂糖珠的操作中破坏琼脂糖珠 6. 每1ml总蛋白中加入100μl Protein A琼脂糖珠（50%），4℃摇晃10mi
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2013第六届生命科学与医学新技术系列讲座资料下载
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
由第二军医大学主办，中国生物器材网承办的“2013第六届生命科学与医学新技术系列讲座暨仪器展示会”于2013年11月22日-23日在第二军医大学成功举行。 本次讲座由徕卡、奥林巴斯、伯腾、量子科学仪器、Nanosurf China、蔡司、尼康、帝肯、美谷分子仪器、安捷伦、通用电气、中科新生命、罗氏、赛默飞、上海万格、柏辰、默克密理博等业内知名公司的应用科学家，产品专家和技术支持围绕显微成像、细胞培养/分析、无标记检测、生物分子相互作用分析、样本库管理等领域的最新技术做了精彩的报告，讲座现场学术气氛浓厚，讨论和交流热烈。应广大师生的强烈要求，现将各公司讲座内容予以公布，以供下载学习。 友情提示：1、请在注册“个人用户”后再下载讲座PDF资料。 2、由于部分文件较大，请耐心等待下载完成。3、讲座资料尚在陆续整理上传中，请持续关注此下载页面。 2013第六届生命科学与医学新技术系列讲座 资料下载 相关链接： 2013生命科学与医学新技术系列讲座暨展示会成功举办历届会议资料下载：
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蛋白质技术专题：双向电泳操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
水化上样( 被动上样) 1. 从冰箱中取出 IPG 胶条，室温放置 10min。 2. 沿水化盘槽的边缘从左向右线性加入样品，槽两端各 1cm 左右不加样，中间的样品液一定要连贯。注意：不要产生气泡，否则会影响胶条中蛋白质的分布。 3. 用镊子轻轻撕去 IPG 胶条上的保护层。注意：碱性端较脆弱，应小心操作。 4. 将IPG胶条胶面朝下轻轻置于水化盘中样品溶液上。注意：不要将样品溶液弄到胶条背面，因为这些溶液不会被胶条吸收； 还使胶条下面的溶液产生气泡。如产 生了气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶走。 5. 放置 30~45min 大部分样品被胶条吸收，沿着胶条缓慢加入矿物油，每根胶条 约 3ml(17cmIPG)，防止胶条水化过程中液体蒸发。 6. 置等电聚焦仪于- 20℃水化 11~15h。 第一向 等电聚焦 1. 将纸电极置于聚焦盘的正负极上，加 ddH2O 5~8μl 润湿。 2. 取出水化好的胶条，提起一端将矿物油沥干，胶面朝下，将其置于刚好润湿 的滤纸片上杂交以去除表面上的不溶物。 3. 将 IPG 胶条胶面朝下置于聚焦盘中，胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正 极，确保胶条与电极紧密接触。 4. 在每根胶条上覆盖 2- 3ml 矿物油。 5. 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序。 6. 聚焦结束的胶条，立即进行平衡、第二向 SDS-PAGE电泳。或将胶条置于样 品水化盘中，- 20℃冰箱保存，电泳前取出胶条， 室温放置10 分钟，使其溶解。 第二向 SDS-PAGE电泳 1. 配制 12%的凝胶。 2. 待凝胶凝固后， 倒去分离胶表面的MilliQ水、 乙醇或水饱和正丁醇，用MilliQ 水冲洗。 3. 配制胶条平衡缓冲液 I 4. 在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另 一份厚滤纸用 MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸 干胶条上的矿物油及多余样品，这样可以减少凝胶染色时出现的纵条纹。 5. 将胶条转移至样品水化盘中，加入 6ml(17cmIPG)平衡缓冲液 I ，在水平摇床 上缓慢摇晃 15
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蛋白质技术专题：蛋白质凝胶电泳凝胶的制备
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
【材料与试剂】 （1）30%的：分别称取29g ，1g N,N -亚甲双加温热的去离子水60ml，加热至37℃溶解，补加水至终体积为100ml,过滤，即配成30%（w/v）贮存溶液。和双在贮存过程中缓慢转变为丙烯酸和双丙烯酸，这一脱氨基反应是光催化或碱催化，故溶液的pH值不超过7.0，应置于棕色瓶中4℃保存。 （2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：称取10gSDS加去离子水90ml加热至68℃，加几滴浓盐酸调节至pH7.2加水至100ml，即为10%（w/v）SDS。 （3）浓缩胶缓冲液（1mol/L Tris-HCl pH 6.8）：12.12g Tris溶解在80ml去离子水中，用浓盐酸调节pH至6.8,再加去离子水至100ml。4℃保存。 （4）分离胶缓冲液（1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8）：18.16g Tris溶解在80ml去离子水中，用浓盐酸调节pH至8.8, 再加去离子水至100ml。4℃保存。 （5）10%过硫酸胺（AP）：过硫酸胺提供催化和双聚合所必需的自由基，可用去离子水配制小量10%（W/V）贮存液并4℃保存。由于过硫酸胺会缓慢分解，故应隔周新鲜配制。 （6）TEMED（N ， N ， N, N -四甲基乙二胺）TEMED通过催化过硫酸胺形成自由基而加速和双的聚合，由于TEMED只能以游离碱的形式发挥作用，因此pH值较低时聚合反应受到抑制。 （7）Tris-甘氨酸电泳缓冲液：分别称取15.1g Tris 和94g甘氨酸，溶解在900 ml去离子水中，然后加入50 ml 10%（w/v）SDS，再加去离子水至1000 ml则成5?贮存液。使用时稀释5倍，终浓度Tris为25mmol/L、甘氨酸为250mmol/L、0.1%SDS，缓冲液pH为（8.3）。 （8）聚凝胶电泳槽和电泳仪 （9）加样器和吸头等 【操作方法】 （1） 根据垂直电泳槽说明书安装玻璃板，确定需配制分离胶的浓度和体积，按“配制Tris-甘氨酸SDS聚凝胶电泳分离胶所用溶液”所列成分（见书末附录）配制所需分离胶； （2） 迅速将分离胶注入两玻璃板间隙中，留出灌注积层胶所需空间（梳子的齿长再加1cm，用滴管小心地在分离胶上覆盖一层0.1% SDS（当浓度≤8%时）或异丁醇或水（当浓度≥10%时），覆盖层可
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蛋白质技术专题：凝胶层析法脱盐和分离蛋白质
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
（一）原理 凡盐析所获得的粗制蛋白质（盐析得到的IgG）中均含有硫酸铵等盐类，这类将影响以后的纯化，所以纯化前均应除去，此过程称为“脱盐”（desalthing）。脱盐常用透析法和凝胶过滤法，这两种方法各有利弊。前者的优点是透析后析品终体积较小，但所需时间较长，且盐不易除尽；凝胶过滤法则能将盐除尽，所需时间也短，但其凝胶过滤后样品体积较大。所以，要根据具体情况选择使用。前实验中样品体积较小，凝胶达滤后样品体积不会太增加，所以选用凝胶过滤法。 （二）试剂与器材 （1）Sephadex G-25。 （2）0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液。 （3）奈氏（Nessler）试剂：于500ml锥形瓶内加入碘化钾150g，碘110g，汞150g及蒸馏水100ml。用力振荡7～15min，至碘的棕色开始转变时，混合液温度升高，将此瓶浸于冷水内继续振荡，直到棕色的碘转变为带绿色的碘化钾汞液为止。将上清液倾入2000ml量筒内，加蒸馏水至2000ml，混匀备用。 （4）20%（W/V）磺基水杨酸溶液。 （5）1.5cm×20cm层析柱。 （6）黑、白比色磁盘。 （三）操作 （1）取层析柱1支（1.5cm×20cm），垂直固定在支架上，关闭下端出口。将已经溶胀好的Sephadex G-25中的水倾倒出去，加入2倍体积的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并搅拌成悬浮液，然后灌注入柱，打开柱的下端出口，继续加入搅匀的Sephadex G-25，使凝胶自然沉降高度到17cm左右，关闭出口。待凝胶柱形成后，在洗脱瓶中加入0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液以3倍柱体积的磷酸盐缓冲流过凝胶柱，以平衡凝胶。 （2）凝胶平衡后，用皮头滴管除去凝胶柱面的溶液，将盐析所得全部IgG样品加到凝胶柱表面，打开柱下口，控制流速让IgG样品溶液慢慢浸入凝胶内。凝胶柱面上加一层的0.0175mol/L，pH6.7磷酸盐缓冲液，并用此缓冲液洗脱，控制流速为0.5ml/min左右。用试管收集洗脱液，每管10滴。 （3）在开始收集洗脱液的同时检查蛋白质是否已开始流出。为此，由每支收集管中取出1滴溶液置于黑色比色
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蛋白质技术专题：重组DNA技术与基因工程(组图)
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
重组DNA技术是现代分子生物技术发展中最重要的成就之一。即是基因工程(Gene Engineering)的核心技术。 重组DNA技术（Recombinant DNA Technique）是人类根据需要选择目的基因（DNA片段）在体外与基因运载体重组，转移至另一细胞或生物体内，以达到改良和创造新的物种和**人类疾病的目的。 这一技术的发展和应用，关键在于限制酶的发现和应用。 一、限制酶 限制性内切核酸酶(restrictive endonucleases)，又称限制酶。是特异性地切断DNA链中磷酸二酯键的核酸酶（“分子手术刀”）。 发现于原核生物体内，现已分离出100多种，几乎所有的原核生物都含有这种酶。是重组DNA技术和基因诊断中重要的一类工具酶。 1、限制酶的命名 根据其来源命名。如： EcoRI来源于大肠杆菌E.coli的RY13菌株,I指在该菌株中分离的第一个限制酶。 2、限制酶识别序列和切割形成 每种限制酶能识别和切割的通常4～8个核苷酸序列，称为限制性位点或切点。 部分常用限制酶及切点 互补末端连接 产生相同序列的突出末端的不同片段 可有三种方式： 1)用同一种限制酶切割； 2)用识别相同靶序列的不同限制酶切割； 3)用识别不同靶序列但可产生一致的粘性末端的限制酶切割。 3、特点： 根据上述限制酶的特点，在基因工程和基因诊断中的重要用途： 1) 不论DNA的来源如何，同一种限制酶切割后产生的粘性末端容易重新连接。因此可将不同种属的DNA重组。如人和质粒DNA等。 2) 用于人类基因组的DNA分析，具特定的酶切位点。 3) Gene突变改变酶切位点的消失或新产生将改变酶切片段长度。应用于限制性片段多态性分析。 二、基因运载体及其选择 载体（Vector）:将外源目的DNA导入受体细胞，并能自我复制和增殖的工具。 载体具以下特征： 1)分子量小，便于携带较大的DNA片段，能进入宿主细胞并在其中增殖； 2)有多种限制酶切点，每种限制酶**只有单一切点； 3)被切割后的载体，插入外源DNA后，不影响其复制能力，并有可选择的标记基因（如，抗
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蛋白质技术专题：蛋白标准品（Marker）知识汇总
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
相关专题 蛋白Marker可分为：一、未预染的Marker即宽 量蛋白标准、高分子量蛋白标准以及低分子量蛋白标准;二、预染的Marker即单色预染和多色预染。 在 过程中，分子量Marker就像个螺丝钉一样没虽然是个小细节，然而就是这样一个小细节对实验结果有着不可忽视的作用。这个 Western Blot参照家族的一员的作用主要是用来指示蛋白条带所对应的分子量大小，只有标准量精确无误了，实验结果才有说服力，除此之外，蛋白标准还有表示转移成功或者蛋白在凝胶上的电泳程度等等的作用，所以选择正确的蛋白Marker也是western blot实验成功的必要条件之一。 总体来说，蛋白 量标准可以分成未染蛋白分子量标准、预染蛋白分子量标准二个级别。以下是关于蛋白分子量标准的小叙： 一. 未染色(pre mixed)蛋白 量标准 未染色的蛋白 量标准是最简单，也是最准确的一种。由于没有附带染料分子或者是标记分子，所示大小正好是蛋白原本的大小，是精确判断蛋白大小必须的。现在的Marker多数都选用预混和的Marker，方便不同大小的蛋白比较。预混的Marker通常有几条带加倍浓度作为指示，因为混合的条带越多，越不好记，谁知道哪条是那条!数到眼都花了。所以当看到特别浓的那几条标志带就记得是哪里了。不过要记得，小带通常都不那么容易看清楚的。在选择上来说，当然是选择其中至少有一条条带和自己的目的蛋白大小相近的**，越近越好。如果你的蛋白不幸在两条跨度较大Marker条带之间，选别的Marker吧。预混的Marker使用上不如预染Marker(pre-stained)好用，因为电泳过程中完全看不到，要和目标蛋白一起等到最后染色才“开蛊”，无法对实验起预示参照作用。完全属于“后知后觉”型的，当然还是比“不知不觉”不做对照的要好。 ① 宽分子量蛋白标准 如果从实验室总体考虑的，就选范围尽量宽，条带分布比较均匀的，这样你的蛋白无论在哪个区间都容易判断，避免正好落在一段空白区的危险。不过条带越多，每次上样量也就越费。拿到Marker后，如果买的是
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蛋白质技术专题：高效液相色谱之高效反相液相色谱
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
反相色谱（reversed phasc chromatography, RPC）是基于溶质、极性流动相和非极性固定相表面间的疏水效应建立的一种色谱模式，任何一种有机分子的结构中都有非极性的疏水部分，这部分越大，一般保留值越高，在高效液相色谱中这是应用面最广的一种分离模式，在生物大分子的反相液相色谱条件下，流动相多采用酸性的、低离子强度的水溶液，并加一定比例的能与水互溶的异丙醇、乙腈或甲醇等有机改性剂，大量使用的填料为孔径在30纳米以上的硅胶烷基键合相，除此之外，也有少量高聚物微球。实验表明，烷基链长对蛋白质的反相保留没有显著的影响，但在蛋白质的活性回收上短链烃基（如C4，C8，苯基）和长链烷基（如C18，C22）反相填料是有区别的。表现在烷基链越长，固定相的疏水性越强，因而为使蛋白质较快洗脱下来，需要增加流动相的有机成分。过强的疏水性和过多的有机溶剂会导致蛋白质的不可逆吸附和生物活性的损失。总起来说，在烷基键合硅胶上的反相色谱，由于其柱效高、分离度好、保留机制清楚，是蛋白质的分离、分析、纯化和结构阐明广泛使用的一种方法。 由于在反相色谱中，使用了乙腈、甲醇等价格高且有一定毒性的试剂，在一定程度上使该方法的使用受到限制。例如可使部分蛋白失活。因此，该方法用在分析鉴定方面更多一些，特别是对有机溶剂具有耐受性的样品。例如多肽样品，可用HPRPC对合成的肽huBPP进行分析。 （一）实验目的 用HPRPC对huBPP进行纯度鉴定。 （二）材料和试剂 1，仪器：高效液相色谱仪，Beckman公司gold system. 2，色谱柱：⑴ 名称：Diamonsil TM（钻石） C18柱，5цm ⑵ 规格：250×4.6mm 3，试剂：甲醇（HPLC级）、三氟己酸（TFA）、乙腈 （HPLC级）、双蒸水 （三）样品准备 取待分析的huBPP，称量，用0.1%的TFA液溶解，配制成浓度大于1mg/ml的液体。必要时过滤或离心。 （四）操作 1、液体准备：A液0.1%TFA，B液液，99.9%乙腈，0.1%TFA，脱气。 2、开机 3、上柱 4
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老化试验箱试验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
老化试验箱是针对高性能电子产品（如：计算机整机，显示器，终端机，车用电子产品，电源供应器，主机板、监视器、交换式充电器等）仿真出一种高温、恶劣环境测试的设备，是提高产品稳定性、可靠性的重要实验设备、是各生产企业提高产品质量和竞争性的重要生产流程，该设备广泛应用于电源电子、电脑、通讯、生物制药等领域。试样在恒定或交变湿热条件下，经规定的湿热试验周期后，测定其外观、物理或力学性能的变化。 老化试验箱操作要求： 1、试验箱内温度、湿度应由装在箱内工作空间的传感器加以监测和控制。 2、在（1.5~2.5）h内温度变化范围应在（25±2）℃~（60±2）℃。 3、在温度不变或温度上升期间，相对湿度应保持在（93±3）%；在降温期间，相对湿度应保持在80%~96%。 4、试验箱内工作空间各处温度、湿度必须均匀，且尽量与传感器紧邻处的条件相近。箱内空气必须持续搅动，试样周围空气层内任意部位的空气流速应保持在（0.5~1.0）m/s。 5、试验箱在调节过程中，不得对试样产生热辐射影响。 6、箱壁和箱顶上的冷凝水应及时排除，不允许滴在试样上，未经纯化处理的冷凝水不得再使用。 7、用蒸馏水或去离子水调节箱内湿度。仲裁试验时，水的电阻率不得小于500Ω.m。 8、每次试验前应更换湿球纱布，但纱布使用期不得超过30天。 文章链接：
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金塔仪器的高频红外碳硫分析仪技术功能与特点
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
红外碳硫分析仪的概述与其主要技术、功能、特点等。 JTY-668系列红外碳硫分析仪是我公司应用光、机、电、计算机于一体的高新技术产品。 主要配套红外集成测量箱，高频感应炉，万分之一天平，名牌商业电脑，彩色显示屏，打印 机等。 高频红外碳硫分析仪主要适用于黑色金属，有色金属，非金属如钢、铁、冶金、铸造、 机械制造、矿石、水泥、玻璃等诸多行业检测相关材质中的碳硫两元素百分含量的分析。 其主要功能特点： 1.测量材质范围广泛 2.测量精度准确，可靠 3.测量时间快速高效 4.该仪器测量时，图文并茂，中英文操作说明 5.仪器智能化、人性化，数据采集计算机精确高速化是国内外诸多制造行业中的理化室、实 验室、质量检验品质部最理想的分析设备 （1）测量范围： 碳：0.0001%-6.0000%（可扩至99.999%） 硫：0.0001%-0.3500%（可扩至99.999%） （2）准确度及精密度： 准确度：碳符合ISO9556-94标准 硫符合ISO9435-94标准 精密度：符合国家计量检定规程JJG395-97标准 （3）分析时间：20-60S可调，一般在35S左右 （4）最小读数：0.00001% （5）电子天平：称量范围：210g 读数精度：0.001g
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多功能酶标仪的新发展 －滤光片和光栅以外的新滤光技术！！
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
多功能酶标仪是现今生物技术和研究中不可缺少的工具。随着高通量检测和微孔板技术的日渐成熟，多功能酶标仪已渐渐成为现今实验室必备的系统。市场上有很多多功能酶标仪的厂家，可谓百花齐放。消费者往往会花多眼乱，很难取舍。其实，现今的酶标仪主要有两种光学技术：一种是利用滤光片技术；另一种是光栅技术。 前者的技术发展比较早，后者则是较近期的技术。但是两者其实各有好处，可以互补不足。而不论是哪种技术，选择酶标仪的第一原则是选择有**的信噪比（Signal to Noise Ratio, SNR）。 滤光片原理: 滤光片是玻璃片再加入特定的染料制成的。当加入染料后，滤片的分子结构和折射率发生了变化，使滤光片对某些色光(也就是波长)的通过有了变化。例如一个480/20nm的滤光片可以让470nm到490nm波长的光通过，在这个波长范围以外的光就会被挡住和吸收。在酶标仪内，光源会从氙灯或卤钨灯发出，通过特定的滤片，把不需要的波长隔开，然后再照射到样本中。样本中的荧光染料会被激发，放出发射光，再透过特定的滤片把杂光隔开，然后被检测器收集。这就是滤光片系统酶标仪的荧光检测过程。 滤光片的好处： 滤光片具有非常好的透光率 (可高于90%)，也就是说光能量的损失比较少。如下图(图1)，在一个荧光检测中，经过滤光片进入样本的激发光和从样本透过滤光片进入检测器的发射光都只有少量的损失(大约10%)。光的损失较少，光的能量自然较大，荧光的信号自然很容易检测。这是获得高信噪比（SNR）的最初始保证。 所以，由于有高的信噪比（SNR）保证，滤光片系统从酶标仪诞生以来一直就是高灵敏度检测的黄金标准。我们也不难发现很多有光栅型酶标仪的厂家在一些检测灵敏度要求比较高的高端应用(如：TRF、TR-FRET、等)中，都会有另外配上滤光片模块的设计。因为这些高端的应用，光栅系统未能有满意的效果或干脆做不到。 滤光片的缺点： 当然，滤光片也有其缺点。当检测不同波长的荧光
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蛋白质技术专题：蛋白质纯化胶体过滤法
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
不同大小的蛋白质分子进入胶体过滤管柱，可依其分子量差异分离；是一种广泛应用的partition色析法 （Pharmacia操作手册， Gel Filtration）。 仪器设备：色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；部分收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；浓缩用离心机 （低速5,000 rpm）；浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 请注意其使用方法 药品试剂：胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。b. 胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1,350） 方法步骤： 管柱装填： 1） 以纯水冲洗玻璃管柱 （以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。 2） 依预估量取出Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡；将瓶中的胶体上下震荡，使的完全悬浮，但勿产生太多气泡。 3） 在管柱内加入约10 cm 高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约90 cm. 4） 胶体完全沈降后，小心以buffer A-150 加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并
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