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高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
高通量的PCR模板植物基因组DNA制备方法 王慧娜 初志战 马兴亮 李日清 刘耀光* 亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室 / 华南农业大学生命科学学院，广东广州510642 摘 要：制备大量生物样品的模板DNA用于PCR检测是费时费人工的工作。本文介绍一种高通量的植物基因组DNA(gDNA)快速制备及其用于PCR基因型检测的操作方法。将一小段单子叶植物苗叶片(长度约30 mm或40 mm，与96方孔板的孔深大致相同) 或一小块(约2~4 mg)双子叶植物叶片放入96方孔板的各孔中、放入一粒钨合金珠和150 µL制备缓冲液，盖好硅橡胶盖，在涡旋器振动3~5 min破碎组织。用96针复制器(或多通道移液器)转移每样品约0.5~1 µL此粗制gDNA溶液(含有2~3 ng gDNA µL-1)到96孔PCR板的反应液中，适合用各种类型的PCR标记(如简单序列重复SSR，插入缺失InDel等)进行基因型检测，或较大的DNA片段(>1 kb)的扩增，可以得到良好的效果。本方法的关键是控制合适的破碎叶片量与制备溶液量比例(约2~5 mg, 但不超过10 mg 150 µL-1溶液)，以及不要加入过多量的gDNA(不超过PCR反应液量的1/10)，以免带入过量的杂质抑制PCR。因此，这种从种植材料，制备gDNA, 转移样品gDNA，到PCR都是96格式化操作的高通量、低成本方法适合于大量植物样品的规模化的基因型检测。 关键词：基因组DNA制备；PCR；基因分型 A High Through-Put Protocol of Plant Genomic DNA Preparation for PCR WANG Hui-Na, CHU Zhi-Zhan, MA Xing-Liang, LI Ri-Qing, and LIU Yao-Guang* State Key Laboratory for Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources; College of Life Sciences, South China Agricultural University, Guangzhou 510642, China Abstract: Preparation of large numbers of plant genomic DNA (gDNA) samples for PCR in basic researches and molecular breeding in crops is a time-consuming and laborious work. In this study we de
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关于生物安全柜的熏蒸消毒的介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
生物安全柜对于广大的科研实验人员来说是非常熟悉的常规设备，但对其使用维护，特别是在特定条件下的彻底熏蒸消毒却不一定很了解，由于多方面方因，大多数实验室的生物安全柜自投入使用以后，甚至多年，也没有经过必要的的维护，有的甚至已经在不正常状态仍在使用。这给实验室生物安全留下了隐患，特别是在一些特定情况下，如使用3~5年后需要更换排风高效过滤器时，安全柜发生故障需要打开维修之前，生物安全柜受到严重污染时需要进行彻底的熏蒸消毒。 一般常用的熏蒸用消毒剂包括甲醛、过氧化氢、二氧化氯等，甲醛虽然成本最为低廉，但因其致癌作用已经越来越受到使用限制，而且做过甲醛熏蒸的人大多会头痛不已，因为要将整个安全柜用塑料布封闭起来、计算需要的消毒剂用量、布置生物指示剂、中和消毒剂、等待漫长的十几小时等，最担心的恐怕还是甲醛的泄漏，以及生物挑战实验的成败等安全问题。 现在有一种新的方法可完全代替传统的甲醛熏蒸，既采用过氧化氢蒸汽对生物安全柜进行消毒，通常发生器通过一个喷射接口与主舱体连接，已经有部分型号的安全柜提供此接口，同时有门封板将前面的操作口进行密封。如果这两个配置都没有的话，可以使用一个临时的门封板，并且已经预装好了合适的连接接口，将其安装在前面操作口上，通过门封上的接口将过氧化氢蒸汽喷入生物安全柜内。 通常蒸汽回路连接于安全柜排风过滤器的后面，当然确切的连接类型和位置取决于带消毒的生物安全柜的型号。在更换过滤器或对安全柜进行维护时，这种连接会推送过氧化氢蒸汽穿过安全柜的排风过滤器并将其彻底消毒。 只对主舱体进行消毒也是可行的，可以用于准备下一个实验前杀灭舱内及工作台下面的所有微生物，避免交叉污染。这种方案相比对主过滤器消毒循环时间变短，使用的过氧化氢也更少。 所有的生物安全柜都有或多或少的气体泄漏，为了确保过程的安全，过氧化氢发生器可以保持一个不大的负压状态，保证在灭菌过
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离心机内溢洒的妥善处理办法
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
1 在离心感染性物质时，要使用密封管以及密封的转子或安全桶。每次使用前，检查并确认所有密封圈都在位并状态良好。 2 离心结束后，至少再等候5 min打开离心机盖。 3 如果打开盖子后发现离心机已经被污染，立即小心关上。如果离心期间发生离心管破碎，立即关机，不要打开盖子。切断离心机的电源，至少30 min后开始清理工作。 4 穿着适当的个体防护装备，准备好清理工具。必要时，清理人员需要佩戴呼吸保护装置。 5 消毒灭菌后小心将转子转移到生物安全柜内，浸泡在适当的非腐蚀性消毒灭菌液内，建议浸泡60 min以上。 6 小心将离心管转移到专用的收集容器中。一定要用镊子夹取破碎物，可以用镊子夹着棉花收集细小的破碎物。 7 通过用适当的消毒灭菌剂擦拭和喷雾的方式消毒灭菌离心转子仓室和其他可能被污染的部位，空气晾干。 8 如果溢洒物流入离心机的内部，需要评估后采取适用的措施。 9评估与报告 10对溢洒处理过程和效果进行评估，必要时对实验室进行彻底的消毒灭菌处理和对暴露人员进行医学评估。 11按程序记录相关过程和报告。
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激光粒度仪在静电喷涂粉末涂料业的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
激光粒度仪在静电喷涂粉末涂料业的应用 前言 近年来，粉末涂料的应用范围不断扩大，应用者对粉末涂料和涂敷设备的要求也越来越高。现今除了环氧粉末外，又出现了聚酯改性的环氧粉末和聚酯粉末，这样大大提高了粉末涂膜的耐户外性能；在色彩上，目前的粉末涂料的种类更加丰富，能满足不同的需要。因此，粉末涂料已从过去的厚涂膜高性能的防腐用途发展到当前的薄涂膜华丽的装饰用途。是我国粉末涂料品种上一个质的飞跃。 粉末涂料当前绝大部分采用静电喷涂工艺—粉末的冷涂敷技术热固化后成膜。粉末涂料的静电喷涂工艺，实质上包括两大部分：粉末涂料的性能和静电喷涂设备（包括喷涂工艺）。这两大部分是相互依存又是相互促进的，只有具有理想的（适合静电喷涂的）粉末涂料，又具备设备良好的静电喷涂设备，才能得到高质量的粉末涂膜。 粒度分布对涂料性能的影响 1、外观、流平性 一般来说，粉末粒径越小，涂料固化时流平性就越好，涂膜的外观也越平整、光滑，但是粉末的带电性与粒径的平方成正比，粉末太细带电性降低，涂装施工效率就会下降，超细粉（粒径＜10μm）基本上不带电。 2、上粉率 上粉率与粉末涂料本身的带电性能有重要关系。提高涂料颗粒的带电量，上粉率将提高。颗粒的带电量和颗粒粒径的平方成正比。增大颗粒粒径，涂料颗粒带电量增加，上粉率提高。但颗粒的粒径也不能太大，粒径太大，涂料颗粒的重力作用超过空气动力和静电力，反而使上粉率降低。 3、回收率 粉末涂料在生产和使用过程中都存在回收粉末的问题，通常，粉末粒径＜10μm的超细粉回收率低，当粉末粒径＞10μm时粉末涂料回收率迅速上升，并且粉末的回收率随着粒径的增大而增加。 基于以上几点，可见，粉末涂料颗粒的粒度分布很大程度上影响了粉末涂料的使用性能和使用效率。因此，需要有粒度检测设备监控产品质量及协助新产品技术研发。 济南微纳粒度仪应用 济南微纳颗粒仪器股份有限公司开发对应粉末涂料粒度测试的Winner318分体式是
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制胶过程中需要注意的细节及操作指南
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
说到Western Blotting，估计所有技术员都会联想到蓝底上的黑色条带，或者是仪器扫描的白底黑条图片。经过了漫长的实验流程，得到的会是清晰的、符合实验理论的完美结果，或者更多的是其他让自己略感失望的结局。 比起其他分子生物学实验，Western Blotting实验似乎更加冗长、更加考验技术，从实验准备，到最后曝光结果，任何一个步骤的丝毫疏忽，结果可能就差之千里。 在这里，BioTNT我先放下之后繁琐复杂的操作步骤，和大家聊聊Western Blotting实验基础中的基础——制胶。 不要小看制胶这件小事哦！Western实验是从电泳跑胶开始的（之前的样本处理算在实验准备里哈），因此电泳跑胶的质量直接影响到最终的实验结果，其中，聚丙烯酰胺凝胶的质量起到了决定性的作用。 要是在制胶时出现了瑕疵，会有怎样的结果呢？ 好不容易配好的分离胶在凝固时居然只剩下了一半！没法用了，只能重制！那你一定是个新手，漏胶什么的最容易出现了。 曝光结束，发现条带不在同一水平线上，原本应在同一kDa值的条带却上上下下如同波浪线一般，好吧，那这块儿胶在配制的时候一定不匀。悲剧，从头开始吧！ 还是在曝光结束，发现在垂直方向上有那么一小条出现了空白（或者说是黑色曝光细斑），不巧的，影响到了目的条带。嗯，那就是你在制胶的时候混了那么一点儿小气泡进去，蛋白们在跑胶时碰到气泡都绕道啦！ 继续的，曝光结束，发现目的条带和非特异条带挤作一团，难舍难分，没法作为数据，这种情况比较复杂，可能原因是电泳时间不够，抗体质量不佳，样本中的蛋白过量，etc. 但是，你有没有想过，可能是你选错了胶的浓度？ 还有诸如胶不凝、曝光条带大小不均、拔泳梳时坏胶、上样电泳时样本溢出等等问题，可能都与你制胶的小细节有问题哦！ 怎么样，小瞧了制胶，吃大亏了吧！还是好好的、严肃的来看待制胶这个问题吧！ 说到这个制胶，很多的少年们还不知道制的是什么胶吧（啊喂，前面说了，是聚丙烯酰胺凝胶啦！）？，在分子生物学
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如购低温恒温槽的策略分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
我们在选择低温恒温槽的时候常常有这样的迷惑，品牌这么多，参数又相似。怎么样选择一个好的低温恒温槽厂家呢？ 首先，我们自身要了解低温恒温槽的产品特性，选择最适合自己的温度和精度。再好的产品，如果不适合你，那买回去也是浪费资金，占用空间。 恒温槽要求对槽内液体的温度精确控温（控温精度是0.1 ℃甚至是0.01℃）。最常用的是用电阻丝加热、压缩机制冷的方法，辅以PID微机自整定精确温度控制方式，将恒温槽的温度稳定在所需要的设定温度上。 其次，看厂家的知名度，市场占有率。就像买电冰箱，电视机一样，好的知名品牌，一定比杂牌的品质，来得要稳当。至少不会买回去了总坏，总修。多的这部分钱，买的是一个安心，一个方便。厂家直销，全国都有售后网点，买回去放心。 再次，恒温槽一般都配备有高稳定的铂电阻PRT或其他温度传感器，以分别用来实现对恒温槽的温度控制和自动保护功能。控制器使用特殊的噪声抑制电路，因此能够检测出高稳定性恒温槽所要求的微小的电阻变化。仪器内部使用交流电桥测量温度来减小热电势。定制的、高精度、低温度系数的电阻保证了温度设定点的短期和长期稳定性。因此一旦传感器失灵，恒温槽就跟水槽没有区别，上海知信采用的是进口PT100传感器，拒绝假冒伪劣充斥。 最后，在噪声方面。先进的滤波技术克服了电源噪声干扰和杂散的电磁干扰和无线电干扰。采用比例积分控制功能来控制供给恒温槽加热器的功率，精密的工厂调试几乎消除了过冲的影响，使得恒温槽能够在到达温度设定点之后迅速达到其最高的温度稳定性。人在使用的过程中，就会感觉舒适。并且有防静电保护功能，加大整机的安全性，即使机子出现故障，仍然以人为本，以安全为本。 核心技术，是低温恒温槽取胜的关键，恒温槽性能卓越我们的热端口技术。它将制冷螺旋管和加热器呈夹层形安装在恒温槽不锈钢筒的侧面，钢筒的底部变成了热交换端口，大部分热量通过这个端口进出恒温槽。钢筒周围良好的绝缘设计最大限度地减少
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ELISA试剂盒的测定方式
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
要使ELISA试剂盒测定得到准确的结果，不论是定性的还是定量的，必须严格按照规定的方法制备试剂和实施测定。主要试剂的制备要点已如前述，其他一般性试剂，如包被缓冲液、洗涤液、标本稀释液、结合物稀释液、底物工作液和酶反应终止液等，配制时不可掉以轻心。 (一)加样 在ELISA试剂盒中除了包被外，一般需进行45加样。在定性测定中有时不强调加样量的准确性，例如规定为加样一滴。此时应该使用相同口径的滴管，保持准确的加样姿势，使每滴液体的体积基本相同。在定量测定中则加样量应力求准确。标本和结合物的稀释液应按规定配制。加样时应将液体加在孔底，避免加在孔壁上部，并注意不可出现气泡。 (二)保温 在ELISA试剂盒中一般有二次抗原抗体反应，即加标本后和加结合物后，此时反应的温度和时间应按规定的要求，保温容器**是水浴箱，可使温度迅速平衡。各ELISA板不应叠在一起。为避免蒸发，板上应加盖，或将板平放在底部垫有湿纱布的湿盒中。湿盒应该是金属的，传热容易。如用保温箱，空湿盒应预先放在其中，以平衡温度，这在室温较低时更为重要。加入底物后，反应的时间和温度通常不做严格要求。如室温高于20℃，ELISA板可避光放在实验台上，以便不时观察，待对照管显色适当时，即可终止酶反应 (三)洗涤 洗涤在ELISA试剂盒过程中不是反应聚，但却是决定实验成败的关键。洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。聚苯乙烯待塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA试剂盒测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。在标本和结合物的稀释液和洗涤液中加入聚山梨酯一类物质即右达到此目的。聚山梨酯是聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯，为非离子型的表面张力物质，常作为助溶剂。根据脂肪酸的种类而对聚山梨酯编号，结合月桂酸的为聚山梨酯20，在ELISA中最为常
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高速抛光机的操作及保养方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
高速抛光机的操作及保养方法提要：检查电源线外观完好无损坏、裸露现象后，再插上电源（指示灯亮）后，方可启动。启动时人应站在抛光机后，避免电源线卷入或滑倒现象。 高速抛光机的操作及保养方法 （1）将高速抛光机放倒在地，把磨片安装在高速抛光机的底盘上，检查电源外观无损坏、裸露现象。然后扶正高速抛光机。 （2）双手抓紧抛光机把手，将把手调节到腰部至腹部适当位置，以便于操作。 （3）检查电源线外观完好无损坏、裸露现象后，再插上电源（指示灯亮）后，方可启动。启动时人应站在抛光机后，避免电源线卷入或滑倒现象。 （4）具体操作方法与洗地机相同。 （5）抛光机在地面重叠旋转，按照顺时针方向从左至右进行操作。直到地面光洁、明亮。 （6）抛光完毕后，应用毛刷刷净抛光垫，再用毛巾擦净机器，放到仓库指定地点。 （7）抛光机不能用于有水的地方，只能在干燥的胶地板、大理石、花刚石等地方使用。
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金相镶嵌机的工作原理及使用方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
金相镶嵌机冷镶嵌的应用，是由金相胶粉和金相固化剂构成。在室温前提下将药水和药粉夹杂,充沛搅拌,5-10分钟后即可固化成为通明硬质资料,并可以对资料进行打磨、抛光等加工，它具有固化放热低、热纠缩性小、耐热性好等长处，适合于电子行业做微切片固化胶运用，合用于各类细小金相试样的冷镶嵌制样。 冷镶嵌的运用办法：1、取样：除去需求镶嵌的样品外表的油污并将其固定的模具中；2、灌胶：取一只塑料烧杯和一根玻璃棒，先将固化剂倒进塑料烧杯中，再向个中参加1.4倍分量的胶粉（分量比1：1.4，容积比1：2），敏捷用玻璃棒搅拌，使之充沛夹杂成稀浆状，注入预先预备好的制样模具中，静置，约5－10分钟该夹杂料固化；3、后加工：从模具中取中固化树脂，依据需求进行打磨、抛光等加工； 冷镶嵌的留意事项：情况温度是决议固化质量的首要要素，普通温度应节制在19－23℃的局限内，每次夹杂料不超越50g，浇注样品厚度小于3cm为好，以免引超不良结果；当所剖析的样品含有很小的闲暇时，建议将浇注了夹杂料试样放在密封性好的钢质容器中，冲入3－5atm气压或抽真空，可使胶液优越地充入闲暇中并削减气泡。
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热鼓风干燥箱操作规程
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
（1）燥箱用于试样的烘熔、干燥或其他加热用。最高工作温度为300℃。干燥箱在环境温度不大于40℃，空气相对湿度不大于85%条件下工作。 （2）用专用的插头插座，并用比电源线粗一倍之导线接地。使用前检查电气绝缘性能，并注意有否断路、短路及漏电现象。 （3）箱上放入温度计，打开电源调节温控旋钮到设定温度，至交流接触开关刚好断开时检查温度计的读数与设定值是否相符，如果有出入则进行微调，直至恒温温度符合设置温度。 （4）打开顶部或底部排气孔排除箱内湿气。 （5）试品钢板最大平均负荷为15Kg,，放置切勿过重、过密，一定要留有空隙，工作室底板上不能放置试品。 （6）干燥箱内严禁放入易燃、易挥发物品，以防爆炸。 （7）通上电源，绿色指示灯亮，开启鼓风开关，鼓风电机运转，开启加热电源，干燥箱即进入工作状态。 （8）工作时，箱门不宜经常打开，以免影响恒温场。 （9）本设备无超温保护装置，故工作时应有专人监测箱内温度，一旦温度失控，应及时断电检查，以免发生事故。
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基因组DNA甲基化分析方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
早期的基因组DNA甲基化分析技术，如SssI甲基转移酶分析法、氯乙醛反应法、免疫学抗体技术等，已经不能满足现代表观遗传学研究的需求。今年来常用的基因组甲基化的方法有以下两种。 1. 甲基化敏感扩增多态性实验 甲基化敏感扩增多态性实验技术被用于检测双向型真菌的DNA甲基化，它是在扩增片段长度多态性技术的基础上建立起来、基本程序是：提取高质量的基因组DNA，分别用EcoRⅠ/HpaⅡ，EcoRⅠ/MspⅠ两种酶组合对基因组DNA进行双酶切，并连上相应的限制性内切酶的接头，然后以接头序列设计的预扩增引物，进行PCR扩增。扩增产物稀释后，再加入带有选择性碱基的引物，进行第二次PCR扩增，扩增产物变性后在6%的序列胶上进行电泳，最后采用银染或同位素放射 自显影方法处理序列胶，统计和分析DNA条带。这种方法在研究动植物基因组甲基化上有广泛应用。NSAP技术相对其他测定DNA甲基化程度的技术有如下优点： ① 不需要知道被测DNA序列信息，在不同生物上具有通用性，可用于DNA序列背景知识未知的生物。 ② 操作相对简便，在AFLP技术体系的基础上无需改进，即可操作。 ③ 可在全基因组范围检测CCGG位点的胞嘧啶甲基化变化。 MSAPjishu的局限性在于不能完成非CCGG位点的胞嘧啶甲基化。 2. 高效液相层析及相关方法 高效液相层析能够定量测定基因组整体甲基化水平，其过程是：先将DNA样品经盐酸或氢氟酸水解成碱基，水解产物通过色谱柱，将结果与标准品比较，紫外光测定吸收峰值，计算5rrC/(5rrC+5C)的积分面积得出基因组整体的甲基化水平。 此法相对HPLC，更为简便、快速、经济。测定甲基化的敏感性较高。
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质粒DNA限制性酶切图谱分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
一、DNA的限制性酶切实验原理 核酸限制性内切酶 是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现，它们的功能犹似高等功物的免疫系统， 用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。 限制性内切酶 以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。 1. 限制性内切酶的类型 根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。 第一类（I型）限制性内切酶能识别专一的核苷酸 顺序，它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链，但是切割的核苷酸 顺序没有专一性，是随机的。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如EcoB、EcoK等。 第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应用于基因克隆。 第三类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内切酶. 它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段； Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序； Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端突出；３’端突出和平末端。 正是得益于限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生物学的兴旺和发展。 粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶 的作用而“粘合”。
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TRIzol RNA提取试剂盒操作说明
作者：德尔塔 日期：2022-04-28
TRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCO BRL公司推出专供提取RNA的产品，其操作方便、快捷。 在TRIzol中，RNA是隔离在RNA酶污染之外的。而对样品的后续操作会要求用无RNA 酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。玻璃器皿可以在150°C 的烘箱中烘烤4小时。塑料器皿可以在0.5 M NaOH 中浸泡10 分钟，用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。 （一）试剂准备 1．TRIzol试剂。 2．氯仿 3．异丙醇 4．75%乙醇（DEPC H2O配制） 5．DEPC H2O （二）操作步骤 1． 样品处理： （1）培养细胞：收获细胞1-5×107，移入1.5ml离心管中，加入1ml Trizol，混匀，室温静置5min。 （2）组织：取50-100mg组织（新鲜或-70℃及液氮中保存的组织均可）置1.5ml离心管中，加入1ml Trizol充分匀浆，室温静置５min。 2．加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min。 3．4℃离心，12000g×15min，取上清。 4．加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min。 5．4℃离心，12000g×10min，弃上清。 6．加入1ml 75%乙醇，轻轻洗涤沉淀。4℃，7500g×5min，弃上清。 7. 晾干，加入适量的DEPC H2O溶解（65℃促溶10-15min）。 （三）注意事项 1．样品量和Trizol的加入量一定要按步骤（1）的比例，不能随意增加样品量或减少Trizol量，否则会使内源性RNase的抑制不完全，导致RNA降解。 2．实验过程必须严格防止RNsae的污染。 二、总RNA定量 RNA定量方法与DNA定量相似。RNA在260nm波长处有最大的吸收峰。因此，可以用260nm波长分光测定RNA浓度，OD值为1相当于大约40μg/ml的单链RNA。如用1cm光径，用 ddH2O稀释DNA样品n倍并以ddH2O为空白对照，根据此时读出的OD260值即可计算出样品稀释前的浓度： RNA（mg/ml）=40×OD260读数×稀释倍数(n)/1000 RNA纯品的OD260/OD280的比值为2.0，故根据OD260/OD280的比值可以估计RNA的纯度。若比值较低，说明有残余蛋白质存在；比值太高，则提示RNA有降解。
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总RNA的提取和纯化的操作规程
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
完整RNA 的提取和纯化，是进行RNA 方面的研究工作，如Nothern杂交、mRNA 分离、RT-PCR、定量PCR、cDNA合成及体外翻译等的前提。所有ＲＮＡ的提取过程中都有五个关键点，即１）：样品细胞或组织的有效破碎；２），有效地使核蛋白复合体变性；３），对内源ＲＮＡ酶的有效抑制；４）有效地将ＲＮＡ从ＤＮＡ和蛋白混合物中分离；5），对于多糖含量高的样品还牵涉到多糖杂质的有效除去。但其中最关键的是抑制ＲＮＡ酶活性。RNA 的提取目前阶段主要可采用两种途径，1)，提取总核酸，再用氯化锂将RNA 沉淀出来；2)，直接在酸性条件下抽提，酸性下DNA与蛋白质进入有机相而RNA 留在水相。第一种提取方法将导致小分子量RNA 的丢失，目前该方法的使用频率已很低。 方法一:总RNA 的试剂盒快速提取 一些公司推出的总RNA 提取试剂盒，可以用来制备高质量的可用于建库的RNA 。该总RNA 纯化系统采用两种著名的RNA 酶抑制剂，异硫氰酸弧(GTC)和β-巯基乙醇，加上整个操作都在冰浴下进行，这样就能显著降低RNA 的降解速率。GTC和N-十二烷基肌氨酸钠的联合使用，将促使核蛋白复合体的解离，使RNA 与蛋白质分离，并将RNA 释放到溶液中。而进一步从复合体中纯化RNA ，则根据Chomc zynski和Sacchi的一步快速抽提法进行，采用酸性酚-氯仿混合液抽提。低pH值的酚将使RNA 进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和DNA分离。水相中的RNA 可用异丙醇沉淀浓缩。进一步将上述RNA 沉淀复溶于GTC溶液中，接着用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除所有残留的蛋白质和无机盐，而RNA 中如含无机盐，则有可能对以后操作中的一些酶促反应产生抑制。 一：仪器 恒温水浴，冷冻高速离心机，紫外分光光度计，取液器，电泳仪，电泳槽。 二：试剂 RNA 提取试剂盒，0.05%焦碳酸二乙酯(DEPC)，75%乙醇 操作步骤 (一):细胞或组织破碎 A:微生物材料 １：发酵３－４天(或对数生长期)的菌体，离心收集菌丝体(动植物材料无需此步处理) ２：用
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RNAi表达载体构建
作者：德尔塔 日期：2022-04-27
近年来的研究表明,一些短片断的双链RNA可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型, 称为RNA干扰（RNA interference,RNAi）.siRNA（small interfering RNAs）就是这种短片断双链RNA分子,能够以序列同源互补的mRNA为靶目标,降解特定的mRNA.RNAi的发现具有划时代的意义,它不仅深入揭示 了细胞内基因沉默的机制,而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具,极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程.现在越来越多的研究人员开始采用RNAi 来研究生物体的基因表达.RNAi技术可广泛应用到包括功能基因组学,药物靶点筛选,细胞信号传导通路分析,疾病**等等. 目前为止较为常用的5种制备siRNAs的方法包括： ·化学合成 ·体外转录 ·长片断dsRNAs经RNase III 类降解 (e.g. Dicer, E. coli, RNase III) ·siRNA表达载体或者病毒载体在细胞中表达siRNAs ·PCR制备的siRNA表达框在细胞中表达 获得高纯度的siRNA产物是进行实验的第一步,而转染的效率则是非常关键的因素. 一、基本概念 RNAi：（RNA interference）RNA干扰 内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导的能诱导细胞内与其序列同源的特异基因表达沉默或抑制的效应,诱使细胞表现出特定基因缺失的表型,称为RNA干扰,它也是体内抵御外在感染的一种重要保护机制. siRNA ：(small interfering RNAs)小干扰RNA 由长dsRNA裂解而成的一种19-25nt的短片断双链RNA分子,能够以同源互补序列的RNA为靶目标降解特定的mRNA, RNAi的关键效应分子. shRNAs:(small hairpin RNA )小发夹RNA 是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子,shRNA需通过载体导入细胞后,然后利用细胞内的酶切机制得到siRNA而最终发挥RNA干扰作用. Dicer：属于RNaseⅢ 家族,是dsRNA的特异性核酸内切酶 RISC：(RNA-inducing silencing complex) RNA诱导的沉默复合体,具有核酸内切、外切以及解旋酶活性 二、机制 目前普遍认为,共抑制、基因压制和RNAi很
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