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Western Blot实验中各转膜方法优缺点分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
WB，蛋白质印迹(Western blotting)又称免疫印迹(immunoblotting)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。 转膜（Transmembran）是将电泳后分离的蛋白质转移到固相载体（PVDF膜或NC膜）上的过程。通常有两种方法，毛细管印迹法和电泳印迹法，常用的电泳印迹法有湿转和半干转两种。两者基本原理相同，只是在用于固定胶/膜叠层和施加电场的装置不同。近些年，有些公司也推出了快速转膜的仪器，有的也得到了一部分用户的认可。这些转膜方法各有什么优缺点，我们将从多方面分析一下。 湿转 湿转是将胶/膜叠层装置浸入缓冲液中，在胶/膜叠层的两侧加电场，电流会从胶/膜叠层中穿过，使带电的蛋白在电流的作用下转移到膜上。电流除了从胶/膜叠层穿过，还可以从缓冲液的其他区域流过，加上胶/膜叠层的电阻也比其他区域的电阻大，大部分电流优先从没有胶/膜叠层区域的缓冲液中流过，也就是说作用到胶/膜叠层的有效电流是很少的。再者，随着转膜时间的增加，缓冲液中的有效离子的浓度也会不断地降低，表现为恒流转膜时，电压会不断上升，恒压转膜时，电流会不断降低。这就导致了湿转的时间很长，一般在1-2个小时，但是慢也导致了结果的均匀和稳定。 半干转 半干转是用浸满转膜缓冲液的滤纸夹住胶/膜叠层装置，组成三明治结构，在这个三明治结构的两侧加上电极，形成电场。这时电场只作用在三明治结构上，因为三明治结构周围没有缓冲液，所以电流不会侧漏。几乎所有的电流都经过了胶/膜叠层，所以半干转的效率很高，速度很快，一般在半小时以内。但是，由于半干转用到的缓冲液很少，只有两侧滤纸浸入的一些缓冲液，这就导致了半干转缓冲液中有效离子的浓度衰
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基于无人驾驶航空器系统(UAS)的植物表型分析方法技术水平综述
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
无人驾驶航空器系统(UAS)是一种特别强大的植物表型分析工具，由于具有采购和部署价格公道、操控简便灵活、可以无缝融入各种规模的表型网络(Figure 1)、能够通过改变载荷轻松实现传感器多样化(Table 2)等优势，其在植物研究和育种中的应用愈发广泛。大多数用于植物表型的飞行器都可以归于由国际民用航空组织(ICAO)所定义的“遥控飞行器系统(RPAS)”概念之中，根据使用的国家和地区的不同，这些设备的名称略有不同。因此为了避免歧义，该文将“无人机”、“无人驾驶飞行器(UAV)”等统称为了“无人驾驶航空器系统(UAS)”。 近日,Plant Phenomics刊发了题为UAS-Based Plant Phenotyping for Research and Breeding Applications 的研究论文，该综述全面地介绍了当前基于无人机的表型分析方法的技术水平，降低了植物研究和育种领域研究者初次使用无人机进行表型分析的难度。 Figure 1: UAS across phenotyping scales, sensing levels, and ground sampling distance (GSD). Image is for illustration purposes and not to scale. Table 2: Main sensor types mounted as UAS payloads. 在使用无人驾驶航空器系统时，使用者必须从植物科学的角度出发做出多项技术决策，来确保在后续分析中可用的信息最大化。这些关键的技术决策包括但不限于：应该选择何种无人机及传感器套件？部署及数据处理的关键步骤有哪些？在这个方向里面有哪些工作已被完成？目前无人驾驶航空器系统在植物表型分析中最先进的应用是什么？有哪些问题、趋势和挑战？ 为了解答以上问题，该文章回顾了基于无人机的表型平台在设备部署、数据采集、数据管理、数据存储及分析方面(Figure 2)的最新技术，讨论了当下亟需解决的技术问题，确定了植物研究界需要了解的无人驾驶航空器表型方向的未来趋势，并指出了哪些关键的植物科学和农艺问题将会在下一代基于无人驾驶航空器的成像及数据分析方法中得到解决。 Figure 2: UAS workflow pipeline: dat
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图解线粒体基因的遗传多样性分析
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
遗传多样性又称基因多样性，是生物多样性的核心组成部分，也是物种多样性和生态多样性的基础。线粒体DNA (mitochondrial DNA, mtDNA) 为母系遗传(即细胞质遗传)，具有基因组结构简单，且不发生重组现象，突变固定后形成的多态性位点既能反映出群体遗传特征，用于分析种群分化和种属关系等。 01 服务流程 02 分析内容 序列多态性分析 群体遗传多样性 群体单倍型分析 遗传分化和基因流 Tajima's D和Fu's FS中性检测 03 分析方法 （方法较多，此处仅供参考） BioEdit和clustalx软件对Sanger测序结果进行分析整理； MEGA 4.0软件统计序列的碱基组成与含量、碱基信息位点数量，计算遗传距离，并构建基于K2-P的邻接(NJ)系统发育树； DNAsp 5.10软件制作核苷酸岐点分布图，统计变异位点位置，单倍型分布等； Arlequin 3.1软件精确计算Fst值，Tajima's D 和Fu's FS中性检验，以及进行AMOVA分析等； PopART 1.7 软件进行单倍型中介连接网络( median-joining) 分析。 04 分析案例 （以COI基因检测3个群体为例） 序列碱基组成：分析不同群体中基因序列的碱基组成差异。 分析结论：A+T含量(70.5%)明显高于C+G含量(29.5% )，碱基组成具有明显的偏向性。 表1.COI基因片段的序列组成 群体遗传多样性：通过对不同群体的基因序列突变类型进行分析，计算出群体间单倍型多样性及核苷酸多样性。 分析结论：共定义了33个单倍型，单倍型多样性平均为0.990，核苷酸多样性平均为0.10851。群体间遗传多样性大小差异不大。 表2.COI基因的遗传多样性指数 群体单倍型分析：在单倍型分析的基础上进行分析，主要体现单倍型在各个群体的分布情况，各个单倍型间的进化关系，各个群体间的关系。 分析结论：3个群体的COI基因序列明显聚为2个聚类簇，这3个群体间存在着一定的基因交流，并且POP1与POP2、POP3之间存在明显的遗传分化，POP2和POP3之间的遗传分化较小。 图1.基于COI基因序列的构建单倍
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检测抗体间接法操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本（测定其中的抗体或抗原）与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度. 间接法是检测抗体常用的方法。其原理为利用酶标记的抗抗体（抗人免疫球蛋白抗体）以检测与固相抗原结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下： 1）将特异性抗原与固相载体联结，形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 2）加稀释的受检血清，保温反应。血清中的特异抗体与固相抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体，血清中的其他成份在洗涤过程中被洗去。 3）加酶标抗抗体。可用酶标抗人Ig以检测总抗体，但一般多用酶标抗人IgG检测IgG抗体。固相免疫复合物中的抗体与酶标抗体抗体结合，从而间接地标记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量与标本中受检抗体的量正相关。 4）加底物显色 本法主要用于对病原体抗体的检测而进行传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。 间接法成功的关键在于抗原的纯度。虽然有时用粗提抗原包被也能取得实际有效的结果，但应尽可能予以纯化，以提高试验的特异性。特别应注意除去能与一般健康人血清发生反应的杂质，例如以E.Coli为工程酶的重组抗原，如其中含有E.Coli成份，很可能与受过E.Coli感染者血甭中的抗E.Coli抗体发生反应。抗原中也
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检测抗原最常用的双抗体夹心法操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下： 1）将特异性抗体与固相载体联结，形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2）加受检标本，保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合，形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 3）加酶标抗体，保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4）加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色，测知标本中抗原的量。在临床检验中，此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原，例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的异性抗体，就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。如抗体的来源为抗血清，包被和酶标用的抗体**分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体，一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗，分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性，而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应，作一步检测。 在一步法测定中，当标本中受检抗原的含量很高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象，此时反应后显色的吸光值（位于抗原过剩带上）与标准曲线（位于抗体过剩带上）某一抗原浓度的吸光值相同（参见1.3.2，图1-4），如按常法测读，所得结果将低于实际的含量，这种现象被称为钩状效应（hook effect），因为标准曲线到达高峰后呈钩状弯落。钩状效应严重时，反应甚至可不显色而出现假阴性结果。因此在使用一步法试剂测定标本中含量可异常增高的物质（例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等）时，应注意可测范围的最高值。用高亲和力的单克隆抗体制备此类试剂可削弱钩状效应。 假使在被测分子的不同位点上含有多个相同的决定簇，例如HBsAg的a决定簇，也可用针对此决定的同一单抗分别包被固相和制备酶结合物。但在HBsAg的检测中应注意亚型问题，H
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实验室抗凝收集血浆与选择抗凝的注意点
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
全血根据收集的条件，分成不抗凝和抗凝两种。同时，不抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血清；抗凝分离出的上层黄色的液体我们称之为血浆。 收集抗凝全血，轻轻颠倒充分抗凝后，可直接离心分离血浆待用或保存。根据不同抗凝剂的性能特征，选择合适的抗凝剂。实验室常用的抗凝剂有肝素的各种盐、EDTA及枸橼酸钠。 抗凝收集血浆： 1、肝素抗凝： 最常用的抗凝剂，一般情况下对相关指标都不会有干扰，同时抗凝比例较大（抗凝剂：全血=1:30），对血液基本没有稀释影响。 肝素是一种含有硫酸基团的粘多糖，带有强大的负电荷，具有加强抗凝血酶III灭活丝氨酸蛋白酶的作用，从而阻止凝血酶的形成，并有阻止血小板聚集等多种抗凝作用。肝素管一般用于生化及血流变的检测，是电解质检测的最佳选择，检验血标本中的钠离子时，不能使用肝素钠，以免影响检测结果。也不能用于白细胞计数和分类，因肝素会引起白细胞聚集。 尽管用肝素的三种盐抗凝所得电解质浓度无显著差别，但肝素锂还是被认为是**的。这主要是人们认为肝素钠可使钠的测定值偏高，肝素铵可使血氨测定值偏高（尿素酶法测定）。 肝素可抑制分子生物学中常用的一些工具酶，如限制性内切酶、Taq酶等，可影响PCR的实验结果。可采用一些方法消除肝素的抑制效应，如利用肝素酶，或在分离白细胞后用缓冲液洗涤白细胞两次以上等。然而，许多实验工作者仍不愿意在进行分子生物学实验时采用肝素作抗凝剂。 2、EDTA抗凝： 乙二胺四乙酸是一种氨基多羧基酸，可以有效地鳌合血液中的钙离子，鳌合钙会将钙从反应点移走将阻止和终止内源性或外源性凝血过程，从而防止血液凝固，与其他抗凝剂比较而言，其对血球的凝集及血细胞的形态影响较小，故通常使用EDTA盐(2K、3K、2Na)作为抗凝剂。用于一般血液学检查，不能用于血凝、微量元素及PCR检查。 由于EDTA会螯合重金属离子，用该抗凝剂的话，部分带有金属离子的大分子酶都会有大量损失，具体看客户测定的指标来选择，做血常规的话
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病毒疫苗的基本分类和其特点
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
2020 年 12 月以来，我国开始了对重点人群新型冠状病毒灭活疫苗的接种工作。现阶段，全国各地都平稳而有序地开展了新冠疫苗接种工作，截至 1 月 26 日，我国新冠疫苗已接种 2276.7 万剂次。那么，关于不同种的疫苗你了解多少？ 说到疫苗，其种类可谓十分丰富，大类上包括：病毒疫苗 (Virus vaccines)、蛋白疫苗 (Protein-based vaccines)、病毒载体疫苗 (Viral-vector vaccines)、核酸疫苗 (Nucleic-acid vaccines)——它们都是些什么样的疫苗呢？又有怎样的优缺点呢？ 我们可以这样简单地理解：疫苗其实就是去除或减弱毒性 (感染繁殖能力) 的病毒。在还未感染时，把它拿给 B 细胞、T 细胞“看”，让获得性免疫系统提前产生对抗它的武器 (记忆细胞)。而这 4 大类疫苗，其实就是四种不同形式的去除了毒性的病毒组分。 病毒疫苗 病毒疫苗是最早应用的疫苗类型，包括减毒疫苗 (Weakened virus) 和灭活疫苗 (Inactivated virus)。通过一些物理化学生物学手段 (包括加热、甲醛、基因改造等) 去减轻 (减毒疫苗) 甚至完全消除病毒 (灭活疫苗) 的毒性，就得到了病毒疫苗。一般灭活疫苗免疫应答较弱，而减活疫苗存在一定的安全隐患。国药集团及科兴中维研发的新冠疫苗就属于灭活疫苗。 减毒疫苗 (Weakened virus)：在获得病毒之后，人工培育使其变异，然后筛选其中毒性较小的毒株，要求接触人体后无反应或是只有轻微的反应，制成疫苗。所以这种减毒疫苗，实际上是“活病毒”，只是毒力较小，只引起免疫反应而不会致病。 灭活疫苗 (Inactivated virus)：在获得病毒之后，通过高温或化学试剂使其失去活性，只保留外部特征，再接种给人体。免疫系统会识别灭活病毒的特征，当再次遇到同种活病毒，就会激活特异性免疫，对病毒进行清除。 图 2. 病毒疫苗[1] 蛋白疫苗 蛋白疫苗是用病毒的蛋白组分做成疫苗，包括类病毒疫苗 (Virus-like particles, VLP) 和蛋白组分疫苗 (Protein
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小分子药物研发新视角：靶向相分离
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
细胞是生物体结构和功能的基本单位，是一个“人口”密集的小型社会，里面的组分和分子各司其职，而这种井然有序离不开一个热门词汇——相分离。相分离是什么呢？相分离有什么作用呢？相分离的研究又有什么意义呢？快跟萌 Cece 一起来学习一下吧~ 第一次看到 Molecular Biology of the Cell 上的这张图 (图 1) 时萌 Cece 十分吃惊——在细胞里，100 nm 尺度 (相当于头发丝直径的 1/500！) 竞能容纳下如此多的分子，其拥挤程度不亚于十一黄金周的外滩。更让人惊叹的是，在如此拥挤的环境里，这些生物大分子仍能高效地行使各自的职能。 图 1. 细胞质构成 (黄棕色：RNA；紫色：核糖体；绿色：蛋白质)[1] 细胞是个拥挤而有序的地方 细胞内的各种组分如何在正确的时间、地点上聚集并执行其相应的功能，是生命科学领域内的一大问题。近些年来，细胞内一些没有细胞膜结构包被的“细胞器” (Membrane-less organelles/condensates)——又称生物分子凝聚体 (Biomolecular condensates) 逐渐引起了人们的注意。 与此同时，液-液相分离 (Liquid-liquid phase separation, LLPS) 的概念火了起来：近几年的研究表明，相分离是细胞形成无膜细胞器的物理化学基础。通过相分离，细胞内分子可以实现特异性的聚集，从而在看似“拥挤而混乱”的细胞内部形成一定的秩序。 这么火的相分离能干些什么？ 相分离 (或相变) 是细胞内类似于油水分离的现象，细胞中某些可以发生相互作用的分子 (油水混合物中的油)，可以聚集形成液滴，从“水相”中分离出来。这看似简单的“分离”，却可以帮助细胞实现“不简单”的生物学功能：可以提高蛋白局部浓度，从而激活细胞信号转导；可以隔离蛋白与其底物，从而抑制细胞内的某些生化反应；还可以感受、并快速响应环境的变化，如温度、pH、细胞外源 DNA；细胞还能以相分离的形式将高浓度的蛋白存储起来，在需要的时候再次释放…… 图 2. 相分离具有多样的生物学功能[2] 我的课题能蹭个相分离的热
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细胞培养实验室中生物污染的来源、分类和消除方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
摘要 污染是科学家在细胞培养实验室工作中最担心的情况之一。细胞培养的生物污染几乎始终与实验次数、项目延期有关，有时候甚至和实验室关闭或损失了稀缺的细胞有关，导致浪费了宝贵的时间和资源。 图 1：细胞培养中污染物的大小范围从 100µm 到 50nm 不等，传统的光学显微镜很难观察到最小的污染物（病毒和支原体）。 通常，有许多生物体在细胞培养物内造成污染。它们包括： 细菌 真菌 病毒 酵母菌 支原体 真核细胞 这些污染物的表现方式各不相同，因此，需要不同的预防、检测和清除策略。真菌、细菌和酵母菌随着细胞一起快速生长，它们产生的污染不管是在宏观上还是微观上都很容易检测到。支原体和病毒会感染细胞，但是由于它们太小很难直接检测。真核细胞的污染常常表现为快速生长的细胞，用显微镜明显可见，但是很难把它们和培养细胞区分开来，并且它们会逐渐取代培养物 [1]。 实验室的污染来源也同样广泛。有时候，污染物在细胞进入实验室时就已经存在；这种情况最常见的是难以检测的污染物，如真核细胞和支原体。细胞培养基等试剂是另一种来源，特别 是内部制备和消毒的、多人使用的或是过期使用的。耗材也很 可能藏匿污染物，所以细胞培养时强调只使用一种无菌耗材的重要性。最后，无菌操作技术使用的疏忽也会引起污染。 在和污染的斗争中，研究人员十分注重预防，因为“ 防患胜过补救 ”。现在，许多防范措施是细胞培养实验室的标准操作规范，比如高压灭菌器消毒、使用预先制备的和预先消毒的培养基、无菌技术的培训、定期支原体检测以及往细胞培养基中添加抗生素。然而，后者在现代细胞培养中不太普遍使用，因为科学家们愈发意识到抗生素会影响细胞的生长和行为，因此偏向使用无抗生素培养基。 可是，即使实验室里采取最严苛的预防措施，仍然有很小的污 染风险影响细胞培养。如果发生这种情况，必须迅速采取行动， 并且按照针对这些情况制定的规程应对。尽管不同实验室的规程大不相同，但使用实验室的
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Western Blot中可能遇到的问题的具体解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
“我明明按照操作步骤来，为什么就是跑不出？”“为什么我的 WB 总是跑得不干净？”“日常羡慕文献里漂亮的 WB 结果”，小小 Western Blot 难倒一片科研党，又泡了一年实验室的萌 Cece 已略有经验~~好东西当然要分享啊~~ 元气满满的一天，相信今天一定会跑出漂亮的条带。我的小幸福就是看到目的蛋白的那一刻！ 看我一顿操作猛如虎： 电泳 → 转膜 → 封闭 → 孵一抗 → 孵二抗 → 检测，剩下的就是等待。 图 1. Western blot 操作流程简介[1] 理想很丰满，现实很骨感，像在某宝买东西写差评：跟想象中不一样。顺便再晒几张“辣眼”买家秀以证现实的残酷。我的实验结果中出现了各种稀奇古怪的玩意儿？？？ ■ 古怪一：高背景 萌 Cece 分析： 1、洗涤不充分，膜没有洗干净。 2、封闭不充分，一抗可能直接结合到膜上，造成二抗孵育时在非特异性位点发生结合。 3、一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合。 措施： 1、对于洗涤不充分，可适当增加洗涤次数和时间，也可尝试提高洗涤液中 Tween-20 的含量 (如提高至 0.5-1%) 。 2、要解决封闭不充分这个问题，可尝试延长封闭时间，也可更换封闭液。常用的封闭剂有 5% 脱脂奶粉、5% BSA、血清和明胶等，推荐室温封闭 1 小时以减少背景。另外，脱脂奶粉常含有酪蛋白，由于酪蛋白会结合磷酸化抗体而易产生高背景。因此，检测磷酸化蛋白时建议用 BSA 作为封闭剂。 3、如果一抗/二抗浓度太高，出现非特异性结合，洗涤也无法完全去除，建议设置多个抗体稀释梯度，从而筛选出合适的抗体比例。 ■ 古怪二：斑点 萌 Cece 分析： 封闭液中出现了不溶性物质。 措施： 建议将封闭液充分溶解后进行过滤。 ■ 古怪三：最头疼的，没有按照预期结果出现令人满意的条带，如：加入 p38 抑制剂，但 p-p38 表达量没有变化。 萌 Cece 分析： p38 虽然在不同的细胞中广泛表达，但是在没有诱导的情况下，表达量很低。 措施： 为了成功检测
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衰老过程中的信号途径中最具有抗衰潜力的信号通路
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
如同爱情是文学永恒的话题，长生不老也是人类永恒的话题。 近年来，与抗衰老相关的各类“神药”甚嚣尘上，如李嘉诚投资的烟酰胺核糖 (Nicotinamide Riboside; NR)。NR 是烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD+) 前体之一，可以提高人体内 NAD+ 水平。众所周知，NAD+ 在衰老过程中会下降，这是为什么呢？上个月 Nature Metabolism 同期两篇研究揭示了其中的一项重要原因：衰老诱导的炎症会促进 CD38 在免疫细胞中的积累或激活，增加了 NAD+ 消耗，从而引起 NAD+ 水平下降。 其实，衰老过程与许多其他生物学过程一样，受到经典信号通路和转录因子的调控。事实上，科学家们通过对不同生物系统和信号通路的干预，已经在多种动物模型中改变衰老的进程，延缓与衰老相关的多种疾病的发生。 目前，已经确定了几种衰老相关的关键信号通路，包括 Insulin/IGF-1 signaling (IIS)、mTOR、AMPK、NF-κB 和 Sirtuins 通路。这些信号传导途径感应营养物质或代谢产物，调节葡萄糖、氨基酸、cAMP 和 NAD+ 的水平，并形成复杂的与长寿和衰老相关的网络。 图 1. 衰老相关的信号网络[4] ■ Insulin/IGF-1 signaling (IIS) 信号传导 IIS 信号传导途径是在模型生物中最早定义的与衰老和年龄有关的途径。胰岛素/胰岛素样肽 (ILP) 与目标细胞表面表达的胰岛素受体结合，从而触发经由 IIS 途径的信号转导。这将启动细胞内激酶级联反应，最终导致激酶 AKT 的激活。AKT 激活后则磷酸化下游转录因子 FOXO，这会抑制 FOXO 的转录功能，从而促进细胞存活、生长和增殖。另外，IIS 信号通路还与 mTOR、AMPK 等通路相互关联，形成一个复杂的调控寿命和衰老的网络。 越来越多的证据表明，生长激素/胰岛素样生长因子-1 (GH/IGF-1) 信号通路也在调节衰老和疾病中起重要作用。在哺乳动物中，生长激素可诱导肝脏中 IGF-1 的释放，IGF-1 通过与细胞表面的高亲和性 IGF-1R 结合，并激活胰岛素受体底物分子 (IRS) 磷酸化和 PI3K-Akt 途径及 MAPK 信号级联，来
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行为学实验手册｜学习记忆系列之水迷宫实验方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
学习与记忆 学习是高等生物接受外界环境变化获得新行为和经验的过程，常见的学习形式有非联合型学习和联合型学习两种。人或动物受到一次或多次单一刺激后形成的、并不需要将两个以上刺激或刺激与反应之间形成明确联系的过程，如习惯化（习以为常），称为非联合型学习；人或动物受到一系列事物刺激、且在时间上很靠近地重复发生，最后在脑内逐渐形成联系，如操作性条件反射，称为联合型学习。 记忆是对学习获得的经验或行为的保持，包括获得、巩固、再现及再巩固四个环节，常见的有程序性记忆与陈述性记忆。程序性记忆即无意识情况下建立的无法用语言描述的记忆，如使用筷子；陈述性记忆指可以用语言描述的关于过去经历或事件的记忆，包括事实、事件、情景以及他们间的相互关系等，如回忆并说出事情经过。 学习与记忆二者是互相联系的神经活动过程，学习过程中必然包含记忆，记忆也总是需要以学习为先决条件。以实验动物为对象，采集并分析动物的行为信息是学习与记忆的常规研究手段之一。例如：利用动物自发活动特性进行研究、通过奖惩等操纵进行研究等。今天我们主要介绍利用动物自发活动进行研究的最常用手段之一：Morris水迷宫中的平台探查实验研究方法（常规的水迷宫实验包括Morris水迷宫、通道式水迷宫等，由于Morris水迷宫最常用，本文主要介绍Morris水迷宫）。后续我们还会介绍：T/Y迷宫、放射性迷宫（八臂迷宫）、物体识别（新物体识别、位置物体识别）、操作性条件反射（斯金纳箱）、穿梭箱、跳台、避暗箱、巴恩斯迷宫等。 实验方法步骤 1.原理 1981年，Morris基于动物厌恶水环境的特性建立了水迷宫方法，实验动物被迫游泳，学习寻找隐藏在水中的平台。通过记录实验动物在目标象限（原先放置平台的象限）所花的时间和进入该象限的次数，以此作为空间记忆的检测指标。 2.文献 Partial loss of psychiatric risk gene Mir137 in mice causes repetitive behavior and impairs sociability and learning vi
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转化生长因子TGF-β与肿瘤发生和免疫调节的关系
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
转化生长因子 (Transforming growth factor beta，TGF-β) 是一类多功能的细胞因子，可由多种组织细胞产生。TGF-β 信号通路是由众多成员的多功能细胞因子，与相应的受体、细胞内信号转导分子组成的通路，能影响疾病发生和发展，调节基因的转录，控制着细胞周期，影响细胞的增殖、分化、黏附、转移和凋亡。值得注意的是，TGF-β 与肿瘤以及免疫系统疾病的发生密切相关。 图 1. TGF-β 细胞信号通路[4] ■ TGF-β 与肿瘤的发生与发展 TGF-β 在肿瘤发生过程中有双重作用。在肿瘤形成早期，TGF-β 主要通过触发癌细胞的细胞停滞和凋亡程序，从而抑制肿瘤的生长；在肿瘤发展过程中，TGF-β 对肿瘤细胞的抑制增殖作用会降低甚至消失，并分泌出大量的 TGF-β，而此时的 TGF-β 就能成为肿瘤细胞生长的促进因子。 TGF-β 通过多种机制实现其肿瘤促进作用。例如，TGF-β 通过抑制一些免疫细胞，如 T 细胞的增殖和功能实现免疫抑制；TGF-β 诱导分泌结缔组织生长因子 (CTGF)、内皮素-1 和血管内皮生长因子 (VEGF) 的分泌，促进血管、肿瘤纤维间质的形成。 重要的是，肿瘤上皮细胞中的 TGF-β 信号还可以诱导形成有利于肿瘤转移的微环境 (TME)，通过诱导 Snail1/2、ZEB1/2 和 HMGA2 等转录因子的表达，促进了肿瘤的上皮细胞间充质转化 (EMT)，这些转录因子又抑制了上皮细胞粘附蛋白的表达，并诱导了间充质蛋白的表达。EMT 转化与肿瘤转移和化疗耐药有关。 图 2. TGF-β 信号的抑癌和促癌功能[9] ■ TGF-β 与免疫调节 研究表明，TGF-β 在免疫调节方面发挥着重要功能。TGF-β1 是淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞等免疫细胞表达转化生长因子的主要形式。它可以通过旁分泌和自分泌方式调节这些细胞的增殖、分化和活化。TGF-β 还可以调节粘附分子的表达，进而调节粒细胞以及其他参与的炎性反应的细胞趋化作用。 图 3. TGF-β 在 T 细胞分化中的作用[10] T 淋巴细胞能够产生 TGF-β，参与调节 T 淋巴细胞的生长。T 细胞
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甘露糖醛酸寡糖作为非甾体抗炎药**实验性关节炎的研究
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸（M）及其C5差向异构体α-L-古罗糖醛酸（G）通过糖苷键连接而成的高分子聚合物。甘露糖醛酸寡糖具有抗氧化、抗老年痴呆、增强免疫力、降血糖等多种生理功能。本试验研究甘露糖醛酸寡糖作为非甾体抗炎药对佐剂诱导的关节炎的**作用。 试验按每只Lewis右足跖皮内注射0.1ml含0.3mg灭活结核分枝杆菌的弗氏不完全佐剂进行关节炎大鼠造模。注射佐剂14天后，测量足垫体积。选择足垫体积比正常的大0.37ml的大鼠为造模成功并随机分成**组。从给予佐药后第15天开始口服或注射试验药物（甘露糖醛酸寡糖给药量为40/mg/kg/天，吲哚美辛给药量为2/mg/kg/天），至第25天结束。解剖左后肢进行组织学检查。测定小鼠WEHI-164细胞系的耐受性和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)活性。在动物模型基础上进行药物毒理学研究，测定血清和尿液，进行肾脏的组织学检查，胃肠道和体温检查。结果表明，口服和腹腔注射甘露糖醛酸寡糖能明显减轻关节炎大鼠的足爪水肿。组织病理学评价显示，通过甘露糖醛酸寡糖**后减少了大鼠关节炎症细胞浸润，以及软骨下骨的破骨细胞数量、组织水肿并明显减轻足爪骨侵蚀。细胞毒性分析结果显示甘露糖醛酸寡糖其耐受量比其他测试药物（双氯芬酸、吡罗昔康和地塞米松）高得多。在浓度为200μg/ml时，甘露糖醛酸寡糖对MMP-2活性的抑制作用显著优于地塞米松和吡罗昔康。毒理学研究表明，甘露糖醛酸寡糖对血清（血尿素氮，肌酐，甘油三酯和胆固醇）、尿液（尿素和尿蛋白排泄率）、肾脏的组织学检查、体温、胃肠道无影响。 本试验结果表明，甘露糖醛酸寡糖作为新型的非甾体抗炎药，是一种有效的可长期服用的安全的抗炎药。 相关产品： D-甘露糖醛酸单糖 D-Mannuronic Acid Sodium Salt D-甘露糖醛酸二糖 Di-Mannuronic Acid Sodium Salt 甘露糖醛酸三糖 trimannuronic acid trisodium salt 甘露糖醛酸四糖 tetramannuronic acid tetrasodium salt D-甘露糖醛酸五糖 D-Pentamannuron
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荧光蛋白的起源-GFP绿色荧光蛋白的广泛应用发展史
作者：德尔塔 日期：2022-04-14
绿色荧光蛋白(简称GFP)，是一个由约238个氨基酸组成的蛋白质，从蓝光到紫外线都能使其激发，发出绿色荧光。GFP的荧光非常稳定，在激发光照射下，其抗光漂白能力比荧光素强很多。因此GFP及其变种被广泛地用作分子标记；此外，GFP还被用作砷和一些重金属的传感器。 1962年，下村脩和约翰逊在一篇纯化水母素的文章提到从水母中发现了荧光蛋白（GFP），正式开启了生物发光研究的大门。2008年10月8日，日本科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。而萤光蛋白的故事要从53年前讲起。 1955年Davenport和Nicol发现水母可以发绿光，但不知其因，未深入研究，错过了一次获得诺奖的机会。 1956年，下村修从海萤体内提取出一种蛋白质，发光亮度比海萤本身强3.7万倍。因为这项发现，下村修不仅被名古屋大学破例授予博士学位，晋升助理教授，还引起美国普林斯顿大学学者弗兰克・约翰逊的强烈兴趣，1960年，在约翰逊的邀请下，下村修前往美国。 1962年，下村修和约翰森在那篇纯化水母素的文章中，有个注脚，说还发现了另一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下发强烈绿色。其后他们仔细研究了其发光特性，从十万只小水母中纯化出5毫克发光蛋白。同时被分离出来的还有另一种“绿蛋白”，在紫外光的照耀下会发出绿色荧光。下村修和约翰逊发表论文，宣告发现“绿色发光蛋白”，这个蛋白就是后来大名鼎鼎的绿色荧光蛋白GFP。 1969年，哈佛大学的伍迪·哈斯廷和詹姆斯·莫林在研究腔肠动物发光蛋白质特性时再次“发现”了多管水母“绿色蛋白质”，并将其命名为“Green Fluorescent Protein”，即绿色荧光蛋白，简称GFP。 1979年，下村修阐明绿色荧光蛋白发光部分的化学构造。但他当时认为这项发现没有多大实际应用价值。 1992年，格拉斯·普拉舍成功地从多管水母的DNA中分离出了GFP基因，并对其进行了复制与测序，为GFP在
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