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摘要 污染是科学家在细胞培养实验室工作中最担心的情况之一。细胞培养的生物污染几乎始终与实验次数、项目延期有关，有时候甚至和实验室关闭或损失了稀缺的细胞有关，导致浪费了宝贵的时间和资源。     图 1：细胞培养中污染物的大小范围从 100µm 到 50nm 不等，传统的光学显微镜很难观察到最小的污染物（病毒和支原体）。   通常，有许多生物体在细胞培养物内造成污染。它们包括： 细菌 真菌 病毒 酵母菌 支原体 真核细胞 这些污染物的表现方式各不相同，因此，需要不同的预防、检测和清除策略。真菌、细菌和酵母菌随着细胞一起快速生长，它们产生的污染不管是在宏观上还是微观上都很容易检测到。支原体和病毒会感染细胞，但是由于它们太小很难直接检测。真核细胞的污染常常表现为快速生长的细胞，用显微镜明显可见，但是很难把它们和培养细胞区分开来，并且它们会逐渐取代培养物 [1]。 实验室的污染来源也同样广泛。有时候，污染物在细胞进入实验室时就已经存在；这种情况最常见的是难以检测的污染物，如真核细胞和支原体。细胞培养基等试剂是另一种来源，特别 是内部制备和消毒的、多人使用的或是过期使用的。耗材也很 可能藏匿污染物，所以细胞培养时强调只使用一种无菌耗材的重要性。最后，无菌操作技术使用的疏忽也会引起污染。 在和污染的斗争中，研究人员十分注重预防，因为“ 防患胜过补救 ”。现在，许多防范措施是细胞培养实验室的标准操作规范，比如高压灭菌器消毒、使用预先制备的和预先消毒的培养基、无菌技术的培训、定期支原体检测以及往细胞培养基中添加抗生素。然而，后者在现代细胞培养中不太普遍使用，因为科学家们愈发意识到抗生素会影响细胞的生长和行为，因此偏向使用无抗生素培养基。 可是，即使实验室里采取最严苛的预防措施，仍然有很小的污 染风险影响细胞培养。如果发生这种情况，必须迅速采取行动， 并且按照针对这些情况制定的规程应对。尽管不同实验室的规程大不相同，但使用实验室的人采取的大多数行动都属于此处讨论的四个方面： 清除 确定污染程度 找出原因 后续执行 清除   为了防止污染在实验室内扩散或是再次发生，发现污染后最紧急的做法是进行彻底清除。细菌、酵母菌和真菌孢子会急速扩 散，常常无人注意，直到感染了其他培养基甚至是其他实验室。 清除的基本方面是追溯做过的步骤。即使是快速生长的污染物也需要一定时间才能生长到能检测出的水平，这意味着当污染物能在肉眼或显微镜下可见时，很可能它在培养基中已经超过24 小时了。为此，重要的是要快速确定过去几天和感染的培养基接触过的所有区域、基质、试剂和人。 首先，感染的培养器皿（多孔板、T 型培养瓶和培养皿）应经过高压蒸汽处理或消毒，然后丢弃。建议高压蒸汽处理所有的培养器皿，因为这种方法安全可靠，可确保无残留污染物遗留在培养器皿上。然后，按照正确的生物样品处置途径处置。 其次，清理感染的培养箱和生物安全柜。清理培养箱时，所有其他的培养物应提前移开，可是为了避免可能的更大程度污染， 建议勿将培养物移到其他培养箱里培养。如有可能，将所有培养物暂时移进生物安全柜或另一个培养箱，完成清理后放回原来的培养箱。 选择一种消毒剂，它对存疑的污染物都有效，并且与使用的物料都适合，这点很重要。许多情况下，使用酒精消毒剂（70% 酒精或异丙醇）进行日常清洁就很适合，但是某些情形可能需要用到其他的替代清洁剂（见表 1）。此外，有些培养箱有自动消毒功能，例如使用高温，有助于快速便捷净化污染后的培养箱（图2）。有些培养箱甚至可能设置自动提醒程序，确保定期清洁消毒设备。    图 2：针对在 180℃ 条件下对 CO2 培养箱进行消毒之前的标准化清洁程序，提供清晰的说明指导步骤，进一步减少用户操作失误的可能，还应使用可耐受高温的传感器。     表1：常用实验室消毒剂的优缺点（改编自[2]）   只要正确使用生物安全柜，每次使用后有效清洁，那么不同使用者的培养物间传染物的传播风险就低（图3）。但是， 如果有任何迹象表明安全柜仍遗留有污染物，例如来自同一安全柜的重复感染，强烈推荐再另外使用酒精等消毒剂彻底清洁。虽然建议在日常维护中对生物安全柜进行熏蒸，但除非有特殊情况，否则无需进行熏蒸以控制污染[3]。   图3：在细胞培养工作中，研究人员可以按照洁净和脏污的材料划分工作空间，从而降低污染的风险。 最后，需要清理可能携带污染物的其他设备或工具，如水浴摇床和移液管。尽管在现代的细胞培养中，大多数接触细胞和培养基的材料是一次性使用的，但**检查一下所有可能受到污染的物品是否已丢弃、经过高压蒸汽处理（如可能），或是另外消毒。   挽救稀有的培养物 绝大多数的污染情况会要求受污染的培养物做高压蒸汽处理然后立即丢弃。但是，可能有培养物十分稀缺的情况。在这种情况下，研究人员可能要准备好花费大量的时间和资源尝试“ 拯救 ”被污染的培养物。能否成功取决于污染的性质和程度。此外，重要的是了解这些方法有无可能对潜在的细胞有重大的、而且往往是永久的影响，例如应激信号级联的激活 [4]。 当一种细胞培养物受到快速生长的真核细胞一类的污染，比如 HeLa 或 HEK293 细胞系，有限稀释可能是一种处理选择。按低或甚至是单细胞密度稀释并完成细胞铺板可以帮助获得极少量但很纯净的培养物，然后可培养繁殖并测试，比如使用短串联重复序列分析（STR 分析）。 如果一种培养物受到了支原体的污染，有许多将其从培养细胞移除的方法可试。 尽管常用的抗生素（如盘尼西林和链霉素）无法杀死支原体，但也有可用的抗生素，比如四环素、大环内酯类和喹诺酮。然而，大多数用于去除支原体的抗生素制剂都存在强细胞毒性，通常需要进行数周进行处理 [5]。 其他类型的污染，如细菌和真菌，向培养基快速释放毒素，可以永久性地改变所有存活细胞的行为和代谢。这意味着从污染过的培养物取得的所有结果，其可靠性和复现性是存在质疑的。然而，有些制造商提供的抗生素和抗真菌剂，结合广泛的清洗和重新铺板过程，可能会去除早期的感染。虽然如此，因为细胞污染的负作用和进一步扩散的可能，这种方法不怎么建议使用。   确定污染程度 在清除后，甚至在清除时，有必要对污染程度进行评估，确认是否超出可接受程度。实验室成员间的沟通对此起到关键作用。实验室成员无论何时发现污染，都必须告知实验室责任管理人，他们可告知其他可能受影响的实验室使用者，并对之后的行动给出建议。这对大型公共平台来说尤其重要。 在确定污染程度时，最需要了解的是，一种类型的污染物可以以不同的速度在不同的时间污染培养物。这意味着，当一种培养物出现污染，其他培养物也可能有已经出现相同污染的风险，例如，同样的培养基污染多个培养瓶或细胞系⸺即使还未到可见的程度。 为此，必须对所有可能受到污染的培养物进行彻底检查，避免忽略低程度的污染物，然后对其进行隔离（如有可能）。这些措施应持续几天，避免有生长缓慢的生物体。至于支原体检测，观察活细胞的标准显微镜不太可能发现污染，因为其太小，这意味着有必要使用 PCR 进行检测。   找出原因 在采取所有控制污染传播的措施后，有时候任务的困难之处在于查明原因。尽管许多污染的例子是一次性的事件，比如不恰当无菌技术的后果，但还有许多其他情况是外部感染造成的，将来有可能还要感染其他培养物。为此，寻找源头的措施应立刻进行，并且务必彻底，且应由整个团队共同寻找，而非仅凭个人努力。 第一个需要问的问题是：有模式吗？是否有些培养物受污染了而有些没有，这可能是潜在源头的线索，可以是很小、容易忽视的细节（图 4）。如果整个实验室出现了这种问题，更可能是系统性的原因，比如通风管道、滤器问题、高压灭菌器问题等。 图4：细胞培养中的污染可能存在许多不同的源头。寻找一个模式可以有助于识别源头 另一个有用的问题是：有什么改变？实验室，特别是科研实验室，可能缺乏某些规范和标准操作程序，所以仔细检查实验室日志，看看最近采取的方法、采用的供应商和设备变化，是找到原因的另一个好方法。 不管原因是否出在培养基和试剂上，建议丢弃曾发生污染培养物的低价值储备溶液。这是因为污染有可能已经从培养物扩散到储备溶液里了。对于高价值储备溶液，应进行彻底的无菌检查，确保可以安全使用。做法是在 T 型培养瓶中培养样品，并将培养瓶放在隔离培养箱隔离（图 5）。 对原种进行检测是另一种例行程序，可以用来发现污染的原因，特别是当培养物刚刚从液氮原液中恢复活力。检测方法是另外从原种中冻融并铺板一小瓶培养物，检查是否存在污染。如果存在污染，应该从之前的流程或使用新购买的储备液重新开始培养。极少情况下，供应的原种就已经有污染，物应尽快联系供应商告知他们所遇到的问题。在联系供应商时，尽可能获取污染产品的信息很重要（准确的产品名称、产品号、批号等等），以便尽快解决所有的生产问题或物流问题。为了确保此批号始终可追踪，有必要在等分样时在每份样品上标记批号。 执行这些操作后就无需使用常规的抗生素，还可确保培养的细胞准确地代表了一种自然表型或疾病状态。 图5：隔离培养箱是限制污染传播的一个好方法，也能挽救可能未受污染的细胞和试剂。 后续执行   在所有的污染痕迹都被清理干净，原因也被确定之后，有助于防止未来发生污染的最后一步是检查是否需要做出任何整改措施？当问题可能来自于试剂或耗材时，着重检查所有物品是否从信誉良好的供应商处购买，是否无菌，是否属于细胞培养级别的物料，以及是否采用合适的方法运输、保存物料。 当污染很可能是因为操作失误发生时，检查并更新现有的规程可以帮助避免未来遇到这类问题。重要的是知晓错误可以在任何地方发生，以及对规程的简单调整，例如关键步骤加上警示，可以帮助防止错误。另外，用户培训有助于改善无菌工作效果，减少污染。 保存准确、详细的记录对任何实验室都是至关重要的，无论如何，查找污染原因有时可以发现保存记录中的问题。一次污染事件恰好可以成为一个契机，以确保整个实验室的操作人员以准确、标准的方式保存记录。 尽管抗生素对防止污染有潜在的好处，但不建议在细胞培养中例行使用抗生素。许多抗生素显示它们对细胞增殖和代谢有影响 [6]。当细菌污染不断发生时，有限使用抗生素有助于减少污染风险。然而，预防细胞培养物污染通常应通过培训和遵循良好的实验室管理规范实现。   总结   污染对所有细胞培养实验室都是一个持续风险。尽管预防是减少污染烦扰的关键，但在状况发生时，快速彻底且系统地行动在限制污染所造成的后果上是有帮助的。 尽管每个实验室处理污染会有不同的程序，但总体来说，分文概括的步骤对于最大限度减少污染的干扰，帮助实验室有效运作提供了一个好的开始。 参考文献 1. Neimark J. Line of attack. Science 2015; 347: 938–940. 2. Geraghty RJ et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. British Journal of Cancer 2014: 1–26. 3. Kennedy DA and Collins CH. Microbiological Safety Cabinets: Selection, Installation, Testing and Use. British Journal of Biomedical Science 2000; 57(4): 330–7. 4. Ji Y et al. Mycoplasma Infection of Cultured Cells Induces Oxidative Stress and Attenuates Cellular Base Excision Repair Activity. Mutation Research 2019; 845. 关于 Eppendorf Eppendorf 是一家领先的生命科学公司，专注于研发和销售实验室的液体处理、样品处理和细胞处理的仪器、耗材和服务。主要产品包括移液器、自动移液系统、分液器、离心机、混匀仪和分光光度计、 PCR 仪，以及超低温冰箱、发酵罐、生物反应器、二氧化碳培养箱、生物摇床和细胞显微操作系统。相关耗材，如移液器吸头、离心管、微量工作板和一次性生物反应器，为高质量的工作流程解决方案提供帮助。 Eppendorf 于 1945 年在德国汉堡成立，在全球拥有 3,600 多名员工。公司目前在 26 个国家设立了子公司，并在其他市场设立销售体系。 隔离和检疫 CO2 培