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![[MCP 5.912] 临床皮肤病的蛋白质组学研究——牛皮癣](/images/icon1.jpg)
[MCP 5.912] 临床皮肤病的蛋白质组学研究——牛皮癣
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Proteomics of skin proteins in psoriasis: from discovery and verification in a mouse model to confirmation in humans. KC Lundberg,Y Fritz.Molecular & Cellular Proteomics,2015,14(1):109-119 文献来源：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25351201 研究背景：皮肤病是一种非常常见的慢性病，尤其统计发现，约2-3%的人群会患上牛皮癣这种由免疫反应介导的炎症性皮肤病，给病人的工作和生活带来极大的困扰。有研究证明，牛皮癣与抗原特异性的T淋巴细胞有关，但是参与其中的抗原并不为人所知。 样本来源：KC-Tie2牛皮癣小鼠模型 研究方法：基于LC MS/MS的Gel-Label free差异蛋白质组学 验证方法：qPCR，基于LC-MS/MS的Solution-Label-free（同样的蛋白经过两次label-free结果，倍数有所不同哦，大家可以学习一下如果遇到这种情况时，应该如何挑选结果） 研究结果： 1.筛选出模型鼠和正常鼠皮肤样本间的蛋白组变化情况。 Workflow summaries for the gel based label-free discovery and verification of target proteins approaches. 2. 利用RT-PCR，在mRNA水平对几个重点关注的差异蛋白质：Serpinb3b,KLK6,StefinA1,Slc25a5,Rab18等，进行了表达量的检测，发现差异具有显著性。 Candidate molecules identified from the gel-based label-free expression experiments are verified at the RNA level in control and KC-Tie2 mouse skin using qRT-PCR. 3. 利用临床上牛皮癣病人和正常人的皮肤样本（未展示），包括最初的角质细胞（见下图），对几个差异蛋白进行了表达差异的确证。 Human psoriatic keratinocytes express higher levels of candidate gene transcripts compared with healthy control keratinocytes. 4. 最后利用免疫组织化学的方法，对几个差异蛋白在组织内的分布情况进行了检测，进一步确定了差异的存在。 Candidate proteins identified from gel-based label-f
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一种新型细胞划痕实验方法的简要介绍
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一.传统细胞迁移实验技术—划痕实验 1.基本原理 细胞划痕（修复）法是简捷测定细胞迁移运动与修复能力的方法，类似体外伤口愈合模型，在体外培养皿或平板培养的单层贴壁细胞上， 用微量枪头或其它硬物在细胞生长的中央区域划线，去除中央部分的细胞，然后继续培养细胞至实验设定的时间（例如72h），取出细胞培养板，观察周边细胞是否生长（修复）至中央划痕区，以此判断细胞的生长迁移能力，实验通常需设定正常对照组和实验组，实验组是加了某种处理因素或药物、外源性基因等的组别，通过不同分组之间的细胞对于划痕区的修复能力，可以判断各组细胞的迁移与修复能力。 实验材料 细胞样品 试剂、试剂盒 无血清培养基 PBS 仪器、耗材 6孔板 maker笔 直尺 枪头 实验步骤 准备： 所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔等在操作前，需紫外照射30min（超净台内） 流程 1.先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5-1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 2.在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。 3.第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。 4.用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 5.放入37度5%CO2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。 2、操作步骤 （1）先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀的划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。 （2）在孔中加入约5×105个细胞，具体数量因细胞种类不同而不同，接种原则为过夜后融合率达到100%。 （3）第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜(不同孔之间**使用同一只枪头)。 （4）PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。 （5）放入37℃ 5% CO2培养箱，培养。可按0，6，12，24h时间点取样
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大分子量蛋白转印的5个技巧
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
做western blot印迹膜时，较大的蛋白质众所周知是难以处理的。 特别是，您可能很难实现良好的转印效率。 在某些方面，蛋白质难以朝着你想要的方向前进。 我们将给5点建议，帮助胶上大分子量蛋白的转印。 01 牺牲胶的韧性来提高效率 低浓度的丙烯酰胺凝胶可能难以操作。一旦手指触摸它就会撕裂？ 但是，与高浓度的凝胶相比，大蛋白将更有效地从较低浓度的凝胶中移出（分辨率更好）。因此，提高你的灵活性和耐心，尝试6-7.5％的凝胶。 或者可以尝试使用梯度凝胶，可以同时分辨小分子量和大分子量蛋白质。 02 去除去垢剂 较大的蛋白质可能在凝胶中沉淀，抑制转印。 在SDS-PAGE期间添加的SDS通常会解决这个问题，但较大的蛋白质可能需要更多的SDS。 您可以在转印缓冲液中添加最多0.1％的SDS以阻止沉淀的产生。因为SDS抑制蛋白质与膜的结合，因此请尝试从低浓度的SDS开始（例如0.0375％），然后逐步提高。 如果确实在转印缓冲液中添加了SDS，则需要重新优化其他转印条件，如转印时间和电流，以防止蛋白透过膜。 03 降低甲醇浓度 甲醇与SDS具有相反的作用。 虽然甲醇增加蛋白与膜的结合，但它从蛋白质中剥离SDS。 因此，降低转印缓冲液中的甲醇浓度也有助于防止蛋白沉淀。 您可以将浓度降低到10％或更低。 如果您使用的是PVDF膜，则可以完全省去甲醇。 在使用之前，不要忘记用甲醇将膜激活！ 甲醇也会导致凝胶收缩，所以如果减少甲醇，你的凝胶会膨胀得更多。 这也有助于转移大分子量蛋白。 但您可能需要使用比正常情况稍大的滤纸和膜。 04 慢速转印大分子量蛋白 大分子量蛋白想要获得良好的转移效率可能需要更多时间。 快速移动那些大分子可能很困难。 尝试以较低的电压过夜转印。 只是不要忘记保持转印要在低温环境！ 05 使用湿转 虽然半干转印可能更适合设置并且需要较少的缓冲液，但它确实有其缺点。 半干转印通常比湿转移效率低，并且不能增加转印时间以适应更大的蛋白。 转移大蛋白时**坚持使用湿转
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如何避免进口ELISA检测试剂盒出现假阳性的现象
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
进口ELISA检测试剂盒出现假阳性的现象一般是与错误的操作有关 进口ELISA检测试剂盒出现假阳性的现象一般是与错误的操作有关，本文与大家聊一聊如何避免假阳性现象。 1、加样 对于间接进口ELISA检测试剂盒标本一般都要进行稀释，如果加样不准就会造成误差，尤其当稀释倍数大时，很小的绝对误差，会导致较大的相对误差，使阴性（或弱阳性）标本呈阳性（或阴性）。加样时应将所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。目前，大部分血站都已使用全自动酶免加样系统处理标本，可较好地避免以上误差。 2、洗涤 在进口ELISA检测试剂盒中正确的洗涤是保证得到可重复结果的关健一步，应引起操作者重视。无论是手工操作还是机器操作，得出不正确的结果常与不正确的洗涤有关，ELISA就是靠洗涤来达到分离游离和结合的酶标记物的目的。通过洗涤以消除残留在板孔中没能与固体抗原或抗体结合的物质，以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 3、 温育 每种试剂都有其*合适的反应模式，其中温度和温育时间控制是重要因素。因孵育温度高，反应时间长，会造成整板本底高，阳性率高。温育一般用湿盒或水浴，反应板不宜叠放，以保证各板温度都能迅速平衡，为避免蒸发，板上应加盖。 4、酶标仪判读 作为记录测定结果的仪器，酶标仪的性能稳定与否，决定结果的可靠度。首先酶标仪应定期进行保养，对滤光片要定期校正；其次酶标仪波长设置要正确，使用双波长，一个检测波长，一个参比波长，以消除微孔板底部划痕、不平、指印或液面高度差异造成的光干扰。此外，在用酶标仪读数时先擦试微孔板底部并压平板条。由于各种酶标仪性能有所不同，使用中应详细阅读说明书 由于酶联免疫吸附技术目前在技术上缺乏标准化，尽管目前上以及我国有了部分标准血清或参比血清（血清盘）。但由于受方法学及技术条件的限制，在酶联吸附测定中有时不可避免的会出现一定的非特异性，但我们可以通过以上
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C57/BL6 小鼠中的竞争性骨髓移植实验简述
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
造血干细胞 (HSC) 能够分化形成血液系统的全部细胞，是维持血液系统所必需的细胞。造血干细胞是一种多能干细胞，具有自我更新的能力，并能够通过层次过程生成各种血细胞系统的中期细胞，从而再生成机体血细胞。 为研究干细胞龛，研究人员必须能够确定在受控条件下细胞群生成成体细胞系统的能力。实验中采用的典型策略是将富含 HSC 的骨髓移植到受体小鼠血液系统之中，而受体小鼠的血液系统经亚致死剂量照射后人为清除。在这些小鼠中，成体血细胞以及干细胞、前体细胞均将在 照射 2 周后死亡。经过移植的细胞可以分化新的血液系统，从而解救小鼠。HSC 可基于其短期 (ST- HSC)、长期 (LT-HSC) 以及中期 (IT- HSC) 重建能力实现再次分裂 。在大多数报告中，研究人员确定 LT-HSC 的方式是：在移植术后 16-44 周的不同时间点，对其生成循环单核细胞、粒细胞和淋巴细胞的能力进行测定。对移植后细胞进行的第一次竞争性分析应在移植术后 4-6 周予以完成。 在移植研究中，通常采用野生型近交 C57/BL6 小鼠，但前提是：这些小鼠携带Ptprcb 白细胞标记 (CD45.2/Ly5.2) 等位基因。Sloan Kettering 研究所 通过回交 SJL 小鼠与野生型 C57/BL6 小鼠的方式，培养出了一种被称为 C57BL/6-Ly5.1 的同类品系小鼠。这些小鼠携带 Ptprcb 白细胞标记 (CD45.1/Ly5.1) 等位基因。使用常用的抗 CD45.1 和 CD45.2抗体，研究人员可以轻松鉴定宿主和移植细胞，并确定 HSC 在竞争性实验中发挥的作用。 在本文中，我们概括性地描述了一项简单的实验，这项实验的具体内容是：对经照射小鼠进行移植后，对其外周血中Cd45.2- 供体与 CD45.1- 宿主白细胞进行测定。
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国自然冲刺2：蛋白翻译后修饰的基金申请解析与研究注意点
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
每年三月初，都是科研界的“高考”倒计时，因为距离国自然基金申请的截止日期已不到半月。纵观历年国自然申请情况，蛋白的翻译后修饰都是申请中重大研究方向之一。2018年国自然统计表明，磷酸化、泛素化、乙酰化等修饰的相关基金项目，总研究资助金额超过2亿。 继上周的肠道微生物研究方案解析后（国自然冲刺：打通菌群多样性与功能的研究策略），本周我们再抓紧时间为各位老师分享一下国自然中各类修饰的趋势分析及组学研究的注意事项，以期为各位老师提供帮助。下面我们主要关注三种最常规研究的修饰类型——磷酸化修饰、泛素化修饰和乙酰化修饰。 表现稳定：磷酸化——全能调控之王 磷酸化是修饰中的全能调控之王，其研究最早，且分布广，修饰量最多。在真核细胞中，约1/3的蛋白随时都可以被磷酸化，几乎参与所有的生理、病理过程。因此，磷酸化修饰是所有修饰中最被广泛认知和重点研究的。 ▲ 磷酸化修饰在历年国自然基金中的申请情况 综上这些特点，在国自然基金申请中，与磷酸化、激酶相关的研究历年所获的资助项目数目均较多、且金额较高。然而，其成熟的研究基础也使得其每年的基金资助趋势稳定平缓。2018年的基金统计结果表明，与磷酸化相关的项目数有105个，资助金额4768万，而与激酶相关的项目数140个，资助金额高达6414.9万，其中重点项目有2个。因此，磷酸化可以说是修饰的基金申请中一个表现非常稳定的方向。 图1.国自然基金项目统计-磷酸化 ▲ 磷酸化修饰组学研究方案的技术注意点： ● 磷酸化修饰肽段富集方法如何选择？ 由于发生磷酸化修饰的氨基酸有三种--丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸，故根据研究目的的不同，磷酸化修饰肽段的富集方法也不同。目前，比较成熟的磷酸化富集方法主要有：金属螯合物富集（如TiO2、IMAC富集）和抗体富集两类。 对于三种氨基酸位点上的修饰均关注的老师来说，金属螯合物富集是最常用的富集介质。其富集效率较高，通常可以达到90%以上，其中一些商品化的IMAC试剂盒具备很理想
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多肽荧光标记——FITC修饰和AMC修饰
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
荧光标记所依赖的化合物称为荧光物质。荧光物质是指具有共轭双键体系化学结构的化合物，受到紫外光或蓝紫光照射时，可激发成为激发态，当从激发态恢复基态时，发出荧光。荧光标记技术指利用荧光物质共价结合或物理吸附在所要研究分子的某个基团上，利用它的荧光特性来提供被研究对象的信息。荧光标记的无放射物污染，操作简便等优点，使得荧光标记物在许多研究领域的应用日趋广泛。 荧光标记物质在蛋白的功能研究、药物筛选等领域也有着广泛的应用。人们利用利用荧光标记的多肽来检测目标蛋白的活性，并将其发展的高通量活性筛选方法应用于疾病**靶点蛋白的药物筛选和药物开发（例如，各种激酶、磷酸酶、肽酶等）。因此，多肽的荧光修饰，同样是多肽合成领域的重要内容。 下面是一些常用的多肽修饰荧光物质： 下面是一些荧光物质的激发光波长和发射光波长 1.FITC修饰 异硫氰酸荧光素（FITC）具有比较高的活性，通常来说，在固相合成过程中引入该种荧光基团相对于其他荧光素要更容易，并且反应过程中不需要加入活化试剂。 我们公司合成的FITC修饰的多肽通常主要有两种形式： （1）在整条肽链末端接入FITC，并且在FITC之前接入一分子的Acp（6-氨基己酸），也称烷基间隔器。反应中FITC与肽链上裸露的-NH2反应，Acp的接入提供了六个碳的直链空间，大大降低了反应的空间位阻，提高了反应效率，降低了反应难度。其次，FITC还与多肽结构中的-SH，侧链-NH2反应，Acp的加入也降低了这种副反应发生的可能。此外，多肽在酸性环境条件下切割时，在N端接入FITC的多肽需要经历环化作用来形成荧光素，这种过程通常都会伴随最后一个氨基酸的切除，而烷基间隔器Acp的接入就避免了这一情况的发生。 （2）在整条肽中的某个Lys侧链接入FITC，Lys侧链为末端为-NH2的四碳直链烷基，直接起到了降低空间位阻的作用。这种修饰方式能够灵活的在整条肽中任何位置进行FITC修饰，而不仅仅局限于末端。 我们所采用的FITC修饰多肽的两种形式，都具有
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国标：蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇残留量的测定方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
国标：蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇残留量的测定方法 . 中 华 人 民 共 和 国 国 家 标 准GB/T 18932. 26-2005 蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇 残留量的测定方法 液相色谱法 Method for the determination of metronidazole, ronidazole and dimetridazole residues i n honey 蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇 残留量的测定方法 液相色谱法 范围 GB/T 18 9 32的本部分规定了蜂蜜中甲硝哒哇、洛硝哒哩、二甲硝咪哇残留量的液相色谱测定 方法 。 本部分适用于蜂蜜中甲硝哒哇、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哩残留量的测定。 本部分的方法检出限: 甲硝哒4、 洛硝哒哇、 二甲硝咪哇均为。. 010 mg /kg. 2 规范性 引用文件 下列文件中的条款通过 GB/丁1 89 32的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件， 其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本部分， 然而， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的zui新版本。凡是不注日期的引用文件， 其zui新版本适用于本 部分 。 GB/T 6 37 9 测试方法的精密度 通过实验室间试验确定标准测试方法 的重复性和再现性 ( GB/T 63 79 -19 86, neq I S O 57 25; 1 98 1) GB/T 6 68 2 分析实验室用水规格和试验方法( GB/T 66 8 2-19 92, n eq I SO 369 6: 19 87) 3 原理 试样中硝基咪哩类药物残留用乙酸乙醋提取， 提取液蒸干后， 用水溶解， 经过 Oas i s HLB固相萃取 柱和BAKERBOND Carboxylic Acid固相萃取柱净化， 液相色谱仪紫外检测器测定， 外标法定量。 4 试剂和材料 除另有说明外， 所用试剂均为分析纯， 水为GB/T 6 68 2规定的一级水。 4 .1 甲醇: 色谱纯。 42 乙睛: 色谱纯。 4 .3 乙酸乙醋: 色谱纯。 4 .4 无水乙酸钠: 分析纯。 4 .5 bing乙酸: 优级纯。 4 .6 甲醇十水( (5 +95) : 量取 5 mL甲醇与 95 mL水混合。 4 .7 乙酸
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如何正确制备微生物检测培养基
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
如何正确制备微生物检测培养基 微生物培养基的制备步骤总共分为九步，每一步是如何操作的呢？接下来小编就给大家细细分解一下。 一、称取 用精确度1/100的电子天平称取培养基所需药品。先根据配方计算出配制一定量培养基所需各种成分药品的量，然后用天平准确称取。称量时用称量纸折叠成簸箕状盛放药品。称量纸折叠方法如图所示。 二、溶化 培养基放入烧杯中，慢慢加入少量所需水，边加入边用玻棒搅拌。如果培养基中不含有琼脂，培养基不需要加热;如果含有琼脂，则需要用本生灯或电磁炉加热煮沸，完全溶解后，再补齐所需水，并搅拌均匀(如图3所示)。如果配制的培养基量很大，可用不锈钢锅加热溶化，可先用温水加热并随时搅动，防止焦化，如有焦化现象，配制的培养基就不能使用，要重新配制。 配制培养基时不可用铜或铁的容器溶化，因铜或铁制容器可能会使培养基中的铜和铁的含量超标，影响实验(培养基中铜含量大于0.3mg/L，细菌不宜生长，铁含量超过0.14mg/L，妨碍细菌产毒素)。对容易发生反应，产生沉淀的药品，要分开溶解，zui后加入培养基，如磷酸氢二钾和硫酸镁。 三、调pH 虽然培养基中含有缓冲物质成分，能使培养基的pH尽可能的保持在要求的范围内，但是配出的培养基若不符合要求，就要进行必要的调整。如果有已校准pH计，可用pH计，如果没有，可用精密的pH试纸，再根据需要用1 mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸(微调可用0.1氢氧化钠或0.1mol/L盐酸)调制所需的pH。 培基的pH一般为7.4～7.6，也有酸性或碱性的。用氢氧化钠调整的需要高压灭菌的培养基，在调整pH时要调至高出所需0.1个～0.2个单位，因用氢氧化钠调整时，高压灭菌后，培养基的pH要降低0.1~0.2。如培养基中含有碳酸钙成分，可不用调pH。 四、过滤 配成的培养基，若无特殊要求，可省略此步。若有沉淀或浑浊需要澄清的液体培养基可用油纸过滤。而固体培养基可用中间夹一薄层脱脂棉的双层纱布过滤。如果过滤法还不能达到澄清的要求，则可用蛋清澄清法，即培养基
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多肽修饰合成常用策略
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种。多肽在调节机体各系统、器官、组织和细胞的功能活动以及在生命活动中发挥重要作用，并且常被应用于功能分析、抗体研究、药物研发等领域。随着生物技术与多肽合成技术的日臻成熟，越来越多的多肽药物被开发并应用于临床。 多肽修饰种类繁多，可以简单划分为后修饰和过程修饰（利用衍生化的氨基酸修饰），从修饰位点不同则可分为N端修饰、C端修饰、侧链修饰、氨基酸修饰、骨架修饰等（图1）。作为一种改变肽链主链结构或侧链基团的重要手段，多肽修饰可有效改变肽类化合物的理化性质、增加水溶性、延长体内作用时间、改变其生物分布状况、消除免疫原性、降低毒副作用等。本文主要介绍几种最主要的多肽修饰策略及特点。 1、环化 环肽在生物医学中具有诸多应用，而且许多具有生物活性的天然多肽都是环状多肽。由于环肽往往比线性肽更具有刚性，因此它们对消化系统具有极强的抵抗力，可以在消化道中存活，并且对靶受体表现出更强的亲和力。环化是合成环状多肽最直接的途径，尤其对于结构骨架较大的多肽。根据环化方式可以分为侧链-侧链式、终端-侧链式、终端-终端式（头尾相连式）。 （1）侧链-侧链式（sidechain-to-sidechain） 侧链-侧链式环化最常见类型是半胱氨酸残基间的二硫桥接，引入这种环化的方法是通过一对半胱氨酸残基脱保护然后氧化构成二硫键。通过选择性地移除巯基保护基可以实现多环的合成。环化既可以在解离后的溶剂里完成，也可以在解离前的树脂上完成。由于树脂上的多肽不易形成可环化的构象，因此在树脂上环化可能要比在溶剂中环化低效。侧链-侧链式环化的另一种类型是在门冬氨酸或谷氨酸残基与基础氨基酸之间形成酰胺结构，它要求多肽无论是在树脂上还是解离后，侧链保护基都必须能够选择性移除。第三种侧链-侧链式环化是通过酪氨酸或对羟基苯甘氨酸形成联苯醚。天然产物中这种类型的环
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微生物样品的处理方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
微生物样品的处理方法 一、初级（初始）样品混悬液 样品通过称取一定重量后或量取一定体积后，加入9倍重量或体积的特定稀释液，经过外力作用充分均质混匀后，得到悬浊液、溶液或者乳浊液。 有的初始混悬液中含有较大的样品颗粒时，应将其水平静置沉淀。这样得到的是初级(初始)混悬液(10-1)。 二、次级十倍梯度稀释 取一特定体积的初级混悬液，加入9倍特定体积的稀释液充分混匀，这样就将初级混悬液进行了十倍稀释操作(10-2),然后依次再进行下去(10-3，10-4....10-n),得到一系列的稀释液，直至得到满足目标微生物培养要求的稀释液。这样的操作叫次级十倍梯度稀释，得到的一系列稀释液被统称为次级十倍梯度稀释液。 三、稀释操作的原则 初级混悬液的制备是为了让样品中的微生物尽可能均匀分布，然后在接下来的次级十倍梯度稀释液中，微生物的数量能按指数进行均匀规则的递减，这样通过培养之后，方便用于菌落计数操作。 为了严格每一个稀释度的计数范围，提高计数的准确性，应先对样品的微生物污染程度做一次大体的评估，然后至少选取合适的两个连续稀释度的稀释液，每个稀释度至少接种两个培养基平板进行培养。无论是初级样品混悬液还是次级十倍梯度稀释样品溶液，都应振荡均匀，保证其微生物在溶液中均匀分布之后再进行接下来的操作。 振荡时应该在涡旋混和器上进行(见图)。用右手拇指和中指夹紧试管，右手食指抵住试管帽，防止振动时试管帽飞出，三个手指用力将试管底部顶住涡旋混和器的橡胶振动头上。涡旋混和器运转时通常有两档：一个是振动头持续振动，一个是只有物品顶住振动头才会振动，通常选用后者。如果没有涡旋混和器，可以采用手心振动混匀的方法。 四、稀释液 ⒈配制稀释液的通常原则 为了使结果更具可重复性，建议配制稀释液时，无论用脱水的单种试剂逐一称量配制还是使用脱水的商业成品培养基，实验室人员在配制稀释液时必须严格按照以下原则： (1)配制稀释液的各种试剂或脱水成品培养基干粉一定要保证质量
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多肽、蛋白质药物缓释制剂的类型及评价方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
蛋白多肽 随着生物技术的高速发展，多肽、蛋白质类药物不断涌现。目前已有35种重要**药物上市，生物技术与生物制药企业的发展也日益全球化。生物技术药物研究的重点是应用DNA重组技术开发可应用于临床的多肽、蛋白、酶、激素、疫苗、细胞生长因子及单克隆抗体等。据Parexl's Pharmaceutical R&D Statistical Source Book报道，目前已有723种生物技术药物正在接受FDA审评(包括Ⅰ～Ⅲ期临床及FDA评估)，700种药物处于早期研究阶段(研究与临床前)，还有200种以上药物已进入最后批准阶段(Ⅲ期临床与FDA评估)。 剂型介绍 生物技术药物的基本剂型是冻干剂。常规制剂尽管其疗效早为临床所证实，但由于半衰期短，需要长期频繁注射给药，从患者的心理与经济负担角度看，这些都是难以接受的问题。 为此，各国学者主要从两方面着手研究开发方便合理的给药途径和新制剂：①埋植剂和缓释注射剂。②非注射剂型，如呼吸道吸入、直肠给药、鼻腔、口服和透皮给药等。缓释生物技术药物的注射制剂，是很有应用前景的新剂型，有一些品种如能缓释1至3个月的黄体生成素释放激素(LHRH)类似物微球注射剂已经上市，本文着重介绍这类制剂。 主要类型 多肽、蛋白质药物缓释制剂的主要类型 多肽、蛋白质药物缓释制剂的研究与开发，从发展过程及剂型看，主要分埋植剂和微球注射剂两类。 埋植剂(implant) 细棒型埋植剂 埋植剂外形为一空心微型细棒，一头封闭，另一头开口，棒材为聚四氟乙烯等非生物降解聚合物。腔内灌入药物与硅胶(silastic,聚二甲基硅氧烷)混合物。 埋植剂埋入人体皮下，药物通过硅胶基质开口处缓慢释放。美国内科医生手册(PDR)上收载了商品名为Norplant?的埋植剂，药物为左旋-18乙基炔诺酮，用于计划生育。 该制剂每根直径2.4 mm，长34 mm，医生通过手术将6根细棒状物埋植在患者上臂内侧，药物可在体内按零级模式释药达5年，药物释完后再经手术取出。 微型渗透泵埋植剂 20世纪70年代开发了外形像胶囊的埋植剂，该制剂埋植于皮下或其它
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占领C位！云序生物解析如何做到快速同时检测各类癌症当中RNA甲基化相关酶&RNA甲基化水平(下)
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
又到了一周云序生物课堂开讲时间！你，准备好了吗？ 上一期文章当中，云序通过引用这样一张表格给大家传递了一个重要信息：表中的METLL3、METTL14、NSun2、FTO、ALKBH5、YTHDF2均是RNA甲基化重要的酶，而且这些酶在不同疾病当中意义有所不同，例如METTL3在AML、BC、HCC当中都是原癌基因，而到了GBM当中竟然变成了抑癌基因；同样是甲基化酶，在HCC当中，METTL3是原癌基因而METTL14是抑癌基因。不管怎样这些酶都在疾病当中扮演重要角色，对疾病细胞的侵袭、增殖能力都有所影响，那么如何做到围绕一个酶把故事的来龙去脉讲清楚呢？ RNA甲基化从酶入手，高分文章立刻拥有，截至目前，RNA甲基化相关领域的研究仍在起步阶段，但围绕甲基化酶研究的思路已经是高分文章的**策略。云序生物课堂，今天就想跟大家聊聊，如何从酶入手打造高分RNA甲基化文章： 1. 确定相应疾病背景下的酶 RNA甲基化相关的酶包括甲基化酶、去甲基化酶、识别蛋白三大类，到底选哪一个酶来做？良好的开端是成功的一半，哪个酶最值得研究成了首要问题。 RNA-seq检测相关酶的表达量改变 （DOI: 10.1111/acel.12753） 倍数表达变化改变总结 （DOI: 10.1002/hep.29683） 1）云序生物推荐mRNA测序结合qPCR的方式检测酶变化 mRNA测序能给出疾病模型或疾病样本中异常表达的所有基因，其中包括RNA甲基化相关的METTL14、METTL3、FTO和ALKBH5等重要的酶在RNA水平上的变化检测。在设置生物学重复的前体下优先选择倍数表达变化高的并且p值较小的酶作为潜在的研究靶点。qPCR技术可以对选择的靶点酶进行扩大样本量验证用于确定该酶的异常表达。 相关酶的WB蛋白检测 （https://doi.org/10.1038/s41590-018-0275-z） 2）蛋白检测 不仅局限于RNA水平，云序推荐结合Western Blot技术检测酶在蛋白水平上的变化，如果在RNA水平和蛋白水平都提供有力的证据证明酶表达量改变，则为接下来的实验奠定了坚实的基础。 大样本qPCR验证ALKBH5高
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树木年轮定年原理、取样方法和分析方法
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
定年是考古分析中的一个重要方面之一。在考古领域有许多断代测年方法，而树轮定年是最精确的一种定年方法，可以精确到年，甚至到某个季节。树轮年代学（Dendrochronology），也叫树轮定年（Tree–ring Dating），是对树木年轮年代序列的研究，科学的树轮年代学是美国的天文学者道格拉斯（Douglass）博士于二十世纪初研究建立起来的。他用树轮定年法测定了印第安人遗址中残留树木的树轮，明确了遗址的年代，于是这种方法在美国的史前年代学研究中得以确立。自从科学的树轮年代学建立以来，树轮年代学有了长足的发展。在建立长序列的年轮年表方面，许多国家已经建立了不同长度的年表，其中有两条长序列的年轮年表，一条是利用美国西南部考古遗址出土的木材样本，构建了这一地区的史前年代学框架，建立了上万年的刺果松（Pinus aristata）年轮年表，另一条是德国建立了不间断的可延续到整个全新世的10430年的栎树（Quercus）年轮年表。利用长序列年轮年表不但对新石器时代的遗存进行了定年，对古建、古美术的木材样本进行定年，而且对14C 年代进行了校正，推测过去一些事件的年代，河流的改道，推测过去社会经济和文化状况，聚落的居住史和建筑史等。总之，在考古学领域，树轮年代学主要有两方面的作用，一方面是利用树木年轮分析判定过去人类文化遗存的年代，另一方面是对过去气候（包括温度、降水）和环境进行重建和研究。因此，为了尽快地建立长序列的年轮年表，有必要对树轮年代学的原理、分析方法和取样方法几个方面系统介绍，使考古工作者了解和掌握，以便取到比较理想的木材样本。 一 树轮年代学的原理 树木树干的形成层每年都有生长活动，春季形成层细胞分裂快，个大壁薄，在材质上表现疏松而色浅，称为春材；由夏季到秋季，形成层的活动渐次减低，细胞分裂和生长渐慢，个小壁厚，材质上致密而色深称为秋材。树木的年轮，就是树干横截面上木质疏密相间的同心圆圈。每一个年轮的宽度包括当年的春材和秋材。多数温带
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培养细胞时需要注意的事项
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
培养细胞时需要注意的事项 细胞培养在生命科研的地位举足轻重。实验君的很多成果可谓是成也细胞培养，败也细胞培养。然而细胞虐我千百遍，我待细胞如初恋！科研人是不会这么被轻易打败的。各大平台上讨论细胞培养的帖子不胜枚举，百家争辨。本文收集整理了相关书籍以及行业平台关于细胞培养的注意事项，希望对大家有所帮助。 一、新买或惠赠的细胞 1.新买的或惠赠的细胞如何处理？ 不管买的细胞、惠赠的细胞，刚拿到手应赶紧做这几件事：检测瓶子是否破裂；培养基是否漏出，是否浑浊；是否有支原体污染；迅速扩增冻存。 2.能否使用与原先培养条件不同的培养基？ 不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应的细胞培养基，若骤然使用和原先提供培养条件不同的培养基，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。 3.购买的细胞死亡或存活率不佳可能原因？ 常见原因可能有： 培养基使用错误或培养基品质不佳；血清使用错误或血清的品质不佳；解冻过程错误；冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心；悬浮细胞误认为死细胞；培养温度使用错误；培养箱气体浓度达不到要求；细胞置于 –80 ℃ 太久。 二、复苏冻存的细胞 4.收到的冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落的原因？ 冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，是因热胀冷缩的物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧。 5.冷冻管应如何解冻？ 将冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意安全，可佩戴防护眼镜和手套预防冷冻管的爆裂。取出冷冻管后，须立即放入 37 ℃ 水浴环境中快速解冻，轻摇冷冻管使其在 1 分钟内全部融化，避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内形成胞内再结晶对细胞造成损害。并注意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情形。 6.细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除 DMSO？ 现在大多数实验室会在
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