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Digital PCR 技术的发展与应用详述
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Digital PCR，绽放正当时！ dPCR发展历史 1992年，Sykes等从非淋巴细胞和正常体细胞背景中鉴定突变的白血病细胞，检测了复杂背景下低丰度的IgH重链突变基因。该研究中提出了三个重要的原则：有限稀释、终点信号的有或无及对数据泊松分布的统计处理，为以后dPCR的发展奠定了基础。 1997年，有研究利用玻璃毛细管作为载体进行PCR反应，可以对模板分子进行定量，验证了Taq-Man探针可以检测模板单分子，尤其在微小的反应体系中，发展了单分子定量技术，为dPCR单模板扩增提供了技术支持。 1999年，Bert Vogelstein和Kenneth W. Kinzler正式提出了dPCR的概念，他们在结肠癌患者粪便中检测KRAS基因突变时，首先把样本分配到384孔板中，然后分别用不同荧光检测突变基因和正常基因，通过计算突变基因和正常基因的比例来得出突变率。 2003 年 Dressman 等 发 明 了 一 种BEAMing 方法(珠子、乳剂、扩增与磁力) 。BEAMing 将模板、引物、PCR 试剂和磁珠的混合物分至小滴中，其中大多数的小滴不含有或只含有一个模板。PCR 完成后，其中扩增产物会通过生物素——链酶亲和素的键合关联在磁珠上，乳化物随之会被打散，珠子就能通过与检测寡核苷酸和流式细胞仪的杂交物所读取。 2006年 Fluidigm公司推出了第一台基于芯片的商品化数字PCR系统。随后，QuantaLife 利用油包水微滴生成技术开发了微滴式数字PCR技术。2011年，QuantaLife 公司被Bio-Rad公司收购，其微滴式数字PCR仪产品更名为QX100型号仪，2013年该公司又推出了升级型号QX200。2013年下半年，Life-technologies推出了QuantStudio 3D数字PCR系统。 商业化数字PCR平台的概述 类型 供应商 生产时间 仪器型号 分液数目 特点 芯片式 Fluidigm 2006 EP1 36,960 基于集成流体通路芯片，快速准确地将流体分成独立的单元。操作耗时，反应成本高。 2006 BioMark HD 9180 Life
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细菌耐药性检测方法-中国微生物菌种查询网
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细菌耐药性检测方法-中国微生物菌种查询网 1、细菌耐药表型检测：判断细菌对抗菌药物的耐药性可根据NCCLS标准，通过测量纸片扩散法、肉汤稀释法和E试验的抑菌圈直径、MIC值和IC值获得。也可通过以下方法进行检测： （1）耐药筛选试验：以单一药物的单一浓度检测细菌的耐药性被称为耐药筛选试验，临床上常用于筛选耐甲氧西林葡萄球菌、万古霉素中介的葡萄球菌、耐万古霉素肠球菌及氨基糖苷类高水平耐药的肠球菌等。 （2）折点敏感试验：仅用特定的抗菌药物浓度（敏感、中介或耐药折点MIC），而不使用测定MIC时所用的系列对倍稀释抗生素浓度测试细菌对抗菌药物的敏感性，称为折点敏感试验。 （3）双纸片协同试验：双纸片协同试验是主要用于筛选产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）革兰阴性杆菌的纸片琼脂扩散试验。若指示药敏纸片在朝向阿莫西林/克拉维酸方向有抑菌圈扩大现象（协同），说明测试菌产生超广谱β-内酰胺酶 （4）药敏试验的仪器化和自动化：全自动细菌鉴定及药敏分析仪如：Vitek-2、BD-Pheonix、Microscan等运用折点敏感试验的原理可半定量测定抗菌药物的MIC值。 2．β-内酰胺酶检测：主要有碘淀粉测定法（iodometric test）和头孢硝噻吩纸片法（nitrocefin test）。临床常用头孢硝噻吩纸片法，β-内酰胺酶试验可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和肠球菌对青霉素的耐药性。如β-内酰胺酶阳性，表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药；表示葡萄球菌和肠球菌对青霉素（包括氨基、羧基和脲基青霉素）耐药。 3．耐药基因检测：临床可检测的耐药基因主要有：葡萄球菌与甲氧西林耐药有关的MecA基因,大肠埃希菌与β-内酰胺类耐药有关的blaTEM、blaSHV、blaOXA基因，肠球菌与万古霉素耐药有关的vanA、vanB、vanC、vanD基因。检测抗菌药物耐药基因的方法主要有： PCR扩增、PCR-RFLP分析、PCR-SSCP 分析、PCR-线性探针分析、生物芯片技术 、自动DNA测序 4．特殊耐药菌检测 （1）耐甲氧西林葡萄球菌检测
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幽门螺杆菌空泡毒素VacA研究进展
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
ATCC菌种 幽门螺杆菌（Hp）是1983年由Marshall和Warren首次分离得到的一种革兰染色阴性的、螺旋状、微需氧、主要定居在人胃黏膜、引起人类消化道疾病发生发展的重要病原菌。幽门螺杆菌的感染呈全球性分布，其感染率与当地公共卫生状况有关，据报道，在西方国家大约30%～50%的成人感染Hp；在中国，其感染率更高，达50%～80%，并有报道指出人群中感染Hp的比例随年龄增长而提高，而且Hp一旦在人胃内定居，如不采取抗菌**，可以持续几十年,严重危害着人群健康。尽管大多数Hp感染者无症状，但有近似10％的感染者患上了胃十二指肠溃疡，胃癌或黏膜相关组织（MALT）淋巴瘤。1994年Hp被WHO定为第I类致癌因子，而其分泌的蛋白毒素VacA作为单一毒力因子可引起靶细胞空泡化、细胞凋亡、细胞骨架重排，最终导致细胞死亡，因此是Hp重要的毒力因子。仅仅发现于1983年的Hp现在是研究得最深入的病原体之一,现就近几年来研究较多的Hp毒力因子VacA综述如下。 1 VacA蛋白基因结构和基因型 1.1 VacA的基因结构 T.L.Cover于1993年克隆出了VacA的基因，发现其由3864个碱基对组成，编码1287个氨基酸，编码的蛋白质分子量为139kDa，此为VacA的前体分子，包括三个区域：（1）N-末端为33个氨基酸残基组成的前导信号序列；（2）中间区域为成熟的空泡毒素；（3）C-末端为50kDa的多肽，其氨基酸顺序与许多G＋细菌的外膜蛋白有同源性。在去掉N末端的信号肽，C末端的类似于IgA蛋白酶前体的肽链等修饰后，成为成熟的87kDa的VacA。该活性毒素可降解为37kDa及58kDa两个亚单位。 VacA可能是具有A-B结构的细菌毒素家族，B亚单位与靶细胞表面的膜受体结合并介导A亚单位进入胞浆，A亚单位与细胞内靶分子特异性共价结合后，导致细胞重要功能的破坏，从而发挥毒素活性［1］。 从液体培养上清中提纯的VacA是一个分子量大于900kDa的寡聚复合物，完整的VacA分子呈花瓣状或雪花状，由6～7个沿半径对称的95kDa的VacA单体组成［2］。VacA暴露于酸性pH
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细胞有丝分裂的实验操作步骤
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
细胞有丝割裂指数(mitotic index，MI)是指归于割裂期的细胞占总细胞数的百分率．用于表明细胞增殖旺盛的程度，也可用于检查药物对细胞增殖能力的影响。用盖玻片培育法培育细胞，做固定和染色后，镜下调查和计数1000个细胞中处于割裂期的细胞数并核算MI。 (一)材料 1．待检资料(药物)。 2．细胞培育成层的贴壁细胞。 3．试剂 甲醇、3％吉姆萨染液。 4．器材CO2培育箱、倒置显微镜、盖玻片(2．2 cm×2．2 cm，需预先清洁和灭菌处理)、塑料培育皿(3．5 cm)、载玻片、封片用盖玻片、中性树胶。 (二)试验办法 1．将细胞消化成单个细胞悬液，将细胞悬液分瓶培育，分红不加药的对照组和加人不一样剂量药物的试验组。 2．细胞传代培育的办法培育细胞，并制成浓度为105／ml的细胞悬液。 3．将清洁和灭菌处理的盖玻片放置在塑料培育皿中，将细胞悬液摇匀后接种于培育皿中，各皿中接种量一样。 4．别离于培育24 h、48ht和72h后从培育皿中取出盖玻片，在Hanks液中漂洗2～3次。 5．先用甲醇固定30 min，再用吉姆萨染液染色。晒干后用中性树胶封片。 6．油镜下或高倍镜下计数1000个细胞中处于割裂期的细胞数。 7．核算MI按下列公式核算MI。 (三)成果与分析 将对照组和药物组的试验成果绘制成直方图并加以比较，也可绘制成MI曲线进行比较： (四)注意事项 1．为了削减误差，试验者有必要了解各期割裂象细胞的形状特征，该试验从头到尾**由一人完结，当两人以上调查时，应把握一样的标准。 2．MI曲线与细胞生长曲线趋势根本相似，但不彻底一样。如果在细胞增长达饱和密壁并进入中止期后．细胞数量许多，而割裂象细胞可彻底消失。 3．细胞在盖玻片上的密度常不均匀，细胞密集区与稀疏区的割裂象细胞数目也许不一样。计数时要挑选密度近似区，以削减试验误差。
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必备技能！云序生物教你巧用IGV轻松实现基因组的可视化
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Itegrative Genomics Viewer (IGV)是由Broad研究院的研究人员开发的一款功能强大的综合性基因组学可视化工具，借助于此工具，从事生物信息的科研工作者就可以轻松的分析查看多种基因组数据。除了直观的查看序列信息及遗传密码中的序列变化或突变外，还可以查看拷贝数变化、染色质沉淀数据和表观遗传学修饰等。使用者可以选择多种显示模式，以heat map、柱状图、散点图或其他形式查看他们的数据。更为吸引人的是IGV的使用是免费的哟！ 测序数据reads通过与参考基因组比对可以直观的查看序列信息及遗传密码中的序列变化或突变，还可以查看拷贝数变化、染色质沉淀数据和表观遗传学修饰等。 前期准备工具： IGV软件 参考基因组：例人参考基因组Homo_sapiens_HG19.sorted.gtf 测序数据文件：例bam、bw等 一、IGV下载及安装 1.请打开您常用的浏览器，在http://www.broadinstiute.org/igv/ (需注册)下载IGV(Integrative Genomics Viewer)。如果您不想注册，请使用直接地址下载适用于所有平台的二进制发行版,这可能需要几分钟。 2. 下载IGV_2.3.59.zip(或任何其他版本)后，首先解压文件，双击“igv.bat”。在你自己的电脑(windows系统)上运行IGV。需要一段时间初始化IGV(链接到web，下载一些基因组注释文件)。 二、操作步骤 1. 参考基因组文件导入 在IGV软件的储存中已经包含了部分的参考基因组信息，可以在方框1中下拉选择，如果有目标基因组可以直接点击，系统将自动下载并导入；如果没有的话，可以选择Genomes→Load Genomes From Files导入本地的基因组fa文件。 图1. IGV界面 2. 测序数据的导入 以bam或bw文件类型为例，导入路径：File→Load form File, 选择bam或bw文件；注意的是bam一定要sort，而且在bam文件所在的目录下一定要有bam文件对应.bai索引文件。 bam文件排序：samtools、sort、A.bam、A.sort bam文件构建索引：samtools index A.sort.bam 导入后可以在方框2的位置选择感兴趣的染色体，也可以在
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内六角教你如何进行PCR仪测温
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
PCR测温服务 PCR是分子生物学领域的关键技术。 不管是在基础研究还是临床诊断领域， PCR 的应用越来越广泛。 一个稳定的温度循环是成功实现PCR所必须的， 在PCR反应过程中 对温度控制的要求很高， 良好的温度控制 是PCR仪质量好坏的关键。 为什么要对PCR仪进行测温 1、PCR仪的温度条件和状态对于PCR试剂盒的研发和应用来说，是必不可少的条件之一 2、根据测温的结果可以避免某些试剂盒对某些特定品牌型号仪器的依赖，拓宽试剂盒的应用范围 3、在合格的仪器上做实验可以极大的节约人力物力 4、对于拥有老旧仪器和高强度使用的实验室来说，节省效果尤为明显 5、良好的实验室管理中包含了对仪器的定期质控 6、定期对PCR仪进行温度测定可以完善实验室的质量管理体系 PCR仪测温服务对象： 大专院校 科研院所 国家各级疾控中心（CDC） 国家各级检验检疫部门 企业用户 内六角的PCR仪温度检测服务 内六角科技提供的PCR仪温度检测服务，采用国际主流的15通道实时动态温度记录的温度检测系统，结合自主研发的温度分析软件，创新的在传统的分析温度准确性、均匀性等基础上，对温度过冲的过程进行了详细的分析，并尝试推出了PCR仪温控状态的分类标准和对每台检测过的PCR仪进行温度和时间值修正指导的服务。 内六角的PCR仪温度主要检测项目： ●升降温速率 ●准确性 ●当匀性 ●过冲情况 ●个性化检测要求 内六角的PCR仪测温服务特色 15通道实时动态温度记录 自主研发的温度分析软件 对温度过冲的过程进行分析 对PCR仪温控状态进行分类 对过检PCR仪进行温度和时间值的修正指导 经国家计量部门检定的专业检测工具 联 系 方 式 北京内六角网络科技有限公司 联系人：李先生 电话：010-62907632、400-9606180 Email：info@neiliujiao.com 网址：http://neiliujiao.com/
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瓦楞纸箱胶黏剂粘度测试方案
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
瓦楞纸箱胶黏剂是瓦楞纸板和纸箱生产过程中zui重要的材料，纸板和纸箱的各项质量指标几乎与胶黏剂有关，因此胶黏剂的作用非常关键，瓦楞纸板生产所用产品，因其制作工艺方法配比辅料不同其质量不同。 在瓦楞纸箱的生产实践中，各种纸张之间的粘合是生产中的一个关键环节，各层纸业之间是否紧密牢固严重影响瓦楞纸板的质量，在瓦楞纸板生产线产生的废次品中，因粘合问题造成占大多数，主要表面为瓦楞纸板出现起泡、脱胶、假粒等现象。一般，粘合性能良好的瓦楞纸板表面平整，不起泡、无褶皱、不翘曲，粘合后的瓦楞纸之间不会产生分离、外观硬挺，具有较好的抗压和抗缓冲性能。 粘度是胶黏剂最关键指标之一，粘度过大，涂胶困难，对被粘粘部件润湿性差，胶接弱度差，粘度大小，流胶现象也差。需要达到胶层厚度，必须增加涂胶次数，推荐粘度计来做粘度测量方案。 推荐型号 博勒飞RVDV2T粘度计 为什么要推荐BROOKFIELD粘度计？ 说到粘度测量，行业用的最多是美国Brookfield粘度计来监控。由此可见控制粘度很重要。生产行业中通常使用Brookfield粘度计来检测控制产品粘度。Brookfield粘度计精度可达测量范围的±1%，而重现性在±0.2%，使用Brookfield粘度计可以精准的控制泡沫粘度，是生产和产品开发不可或缺的工具。 美国Brookfield粘度计是全qiu粘度计的泰斗，发明了全qiu第yi台旋转粘度计，率先创造了粘度测量的世界标准。80年的生产经验，使得Brookfield的名字在粘度测量和控制领域成为zui佳信誉和精确的代名词。Brookfield粘度计已成为粘度计的行业标杆，市场占有率达70%以上。Brookfield粘度计质量稳定可靠，精确度高，重复性好。通过精准的Brookfield粘度计测量后，可以精确的控制泡沫粘度在合适的粘度范围，让泡沫粘度的性能发挥到极zhi。
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焦磷酸测序技术原理及应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
焦磷酸测序（Pyrosequencing）技术 焦磷酸测序技术(pyrosequencing)是由Nyren等人于1987年发展起来的一种新型的酶联级联测序技术，焦磷酸测序法适于对已知的短序列的测序分析，其可重复性和精确性能与SangerDNA测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行DNA甲基化、SNP等单个/连续多个核苷酸变异进行实时定量检测提供了非常理想的技术操作平台。 一. 焦磷酸测序技术原理 焦磷酸测序技术是由4种酶催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。焦磷酸测序技术的原理是：引物与模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)．荧光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase)4种酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，通过检测荧光的释放和强度，达到实时测定DNA序列的目的。焦磷酸测序技术的反应体系由反应底物、待测单链、测序引物和4种酶构成。反应底物为5’-磷酰硫酸(adenosine- 5’-phosphosulfat，APS)、荧光素(1uciferin)。 1.每次加入一个dNTP, 在聚合酶作用下产生一个焦磷酸（PPi）； 2. 硫酸化酶转化PPi为ATP，ATP使荧光素酶发出荧光(产生的光强度与结合的核苷数量成正比). 3. 多余的dNTP被降解，开始新一个循环. 4. 测序结果 技术平台： QIAGEN公司PyroMark Q24，PyroMark Q48 Autoprep，PyroMark Q96 ID焦磷酸测序仪 焦磷酸测序实验流程 焦磷酸测序技术应用 DNA甲基化检测 全基因组甲基化水平检测：LUMA法 SNP定量检测/等位基因差异表达检测 技术咨询请联系上海希匹吉生物技术有限公司021-54480369
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全基因组甲基化定量检测技术-ＬＵＭＡ
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
全基因组甲基化定量技术—LUMA LUMA介绍 基因组DNA甲基化(Genomic DNA Methylation, GDM)的变化被认为是正常和病理细胞过程中的重要的事件，有助于正常发育和分化以及癌症和其他疾病。在此，我们介绍一种新的方法评估全基因组DNA甲基化，称为荧光甲基化检测(Luminometric Methylation Assay，LUMA)。该方法采用甲基敏感限制性内切酶DNA裂解法联合焦磷酸测序的聚合酶延伸分析。该方法是一种定量检测技术，重现性高，易于推广。 其优点是：无需亚硫酸盐修饰，无需引物，无需PCR过程，测序反应无需磁珠等试剂，十分钟左右即可完成测序反应，方便快捷。而且，该实验只需要200-500 ng的基因组DNA，并包含一个内控以消除起始DNA数量不同的问题。整个实验过程能够在6个小时内完成。 技术原理 此方法由Karimiet等人于2006年建立，采用DNA甲基敏感或不敏感的限制性内切酶进行DNA裂解，随后进行生物荧光聚合酶延伸试验，以定量限制性裂解的程度。此实验使用了对CpG甲基敏感的限制酶HpaII及其对甲基不敏感的同裂酶MspI做平行反应。EcoRI被用在所有反应中作为内参。 MspI和HpaII酶切靶序列为CCGG，其CpG位点数量占整个基因组中CpG位点的8%，可以作为评估全基因组甲基化水平的一个标志物。MspI和HpaII裂解后形成5’CG粘末端,而EcoRI生产5′AATT粘末断,然后通过聚合酶延伸逐步填充苷酸。随着dNTP的成功延伸，无机焦磷酸(PPi)被释放并通过ATP硫酸化酶和5’磷酰硫酸腺苷（APS)作用下转化为ATP。随后荧光素通过荧光素酶和ATP产生一定比例的可见光并由CCD检测。 实验步骤 1. 酶切：每例样本分为2份DNA，分别用HpaII+EcoRI或MspI+EcoRI双酶切，酶切约4hr。 2. 纯化：酶切产物纯化回收。 3. 焦磷酸测序（Pyrosequencing），反应过程如下： dNTPs按四个步骤添加(步骤1:dATPαS,第二步:dGTP + dCTP,第三步:dTTP和步骤4:dGTP +dCTP)。峰值对应dATPαS(步骤1)和dTTP(步骤3)的添加，都代表EcoRI裂解，因此两者应该是等值的。因此,dTTP峰用作dATPα
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隐球菌病分子生物学研究进展
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
一、核酸提取技术的改进 中国微生物菌种查询网 进行分子生物学研究的前提是取得高数量和高质量的核酸，即DNA和RNA。由于隐球菌细胞壁外有一层厚厚的荚膜，为破除真菌细胞壁造成很大困难。可靠地提取隐球菌DNA的方法建立于20世纪80年代后期，研究者先后建立了玻璃珠方法、超声粉碎、液氮冷冻研磨等破壁技术。后来，发展酶学方法取代物理方法，用生物酶消化荚膜和细胞壁、制备原生质体，然后再用去污剂溶解细胞膜、释放DNA。目前常用的酶为Novozyme234，具有1，3-a-及1，3-b-萄聚糖酶、几丁质酶、蛋白酶、地衣酶、木聚糖酶等多种活性，破壁效果好。另外新生隐球菌能够产生细胞外DNA酶，在反应体系中始终保持高浓度的EDTA，可以有效地抑制DNA酶，防止DNA被降解。 二、基因克隆 已掌握的新生隐球菌的遗传图谱相当少，而且也相当不精确。目前还没有完成新生隐球菌全基因组的序列测定，只确定和报道了少数基因在染色体上的定位。 1、毒性基因 新生隐球菌的主要致病因素有四个：多糖荚膜、产黒色素、a接合型和37℃能存活。Still和Chang等应用经典的遗传学方法和基因互补技术分离，并鉴定了参于荚膜形成的基因----CAP59, 该基因编码458个氨基酸，含有6个内含子，经杂交分析确定CAP59基因定位于新生隐球菌的染色体Ⅰ上。二个克隆的荚膜形成必需基因----CAP64，其DNA全长1.9kb，预计编码522个氨基酸，有8个内含子，定位于染色体Ⅲ上。新生隐球菌的产黒素基因----CNLAC1也已克隆，该基因编码642个氨基酸，含14个内含子。a-接合型和a-接合型是一对等位基因，与新生隐球菌的性生殖有关，遗传公析显示a-接合型和菌株毒性增加存在关联，Moore等应用差异克隆技术获得了a-接合型相关基因----MFa,内含一个零拥有114bp的开放阅读框架（ORF)。 2、结构基因 Edman等应用大肠杆菌互补技术克隆了编码新生隐球菌乳清酸核苷-单磷酸-焦磷酸化酶（OMPase）的基因----URA5，该基因包括675个核苷酸和2个内含子，定位于1500kb左右的染色体上。
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FluorCam多光谱荧光成像技术
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
FluorCam多光谱荧光成像系统作为FluorCam叶绿素荧光成像系统的最高级型号，是目前唯一有能力实现了一台仪器上同时完成叶绿素荧光、UV-MCF多光谱荧光、NDVI归一化植被指数以及GFP、YFP、BFP、RFP、CFP、DAPI等荧光蛋白与荧光染料的成像分析功能。同时也可以加装RGB真彩成像和热成像模块。如果在搭配上高光谱成像模块，其成像分析功能已经几乎可与PlantScreen高通量植物表型分析系统的成像单元相媲美。 Specim高光谱技术用于玉米种子品质检测鉴定（引自：Application of Hyperspectral Imaging and Chemometric Calibrations for Variety Discrimination of Maize Seeds. Sensors, 2012） Specim高光谱技术用于研究分析植物病害（引自：Detection of early blight and late blight diseases on tomato leaves using hyperspectral imaging. Nature, 2015） 模块式植物表型分析技术方案推荐： 1． FluorCam开放式多光谱荧光成像系统 2． 易科泰WIC红外热成像分析技术 3． 易科泰Specim高光谱成像分析技术 4． RGB彩色成像分析单元
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看表观新修饰-6mA甲基化如何助力IF飙升!
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
DNA甲基化修饰是表观遗传研究的热点之一，我们通常认为DNA甲基化就是胞嘧啶甲基化（5-methylcytosine, 5mC），却不知道随着测序技术的快速发展，科研者们已经在真核生物中（果蝇 、真菌、莱茵衣藻、秀丽隐杆线虫等）发现了一种新的DNA甲基化修饰—DNA-6mA甲基化，且DNA-6mA甲基化能影响基因表达，在动植物的生长发育过程中发挥着关键的调控作用，同时与包括癌症在内的多种人类疾病密切相关。这些发现成功地掀起了科学家们对DNA-6mA的研究热潮，使DNA-6mA成为表观遗传学领域的研究热点中的热点。接下来就以几篇经典案例为大家介绍DNA-6mA。 DNA methylation on N6-adenine in mammalian embryonic stem cells.NATURE, IF: 44.958 作者以SMRT-ChIP、RNA-seq和6mA-IP seq三种技术相结合的方法研究小鼠基因组甲基化。研究发现小鼠胚胎干细胞中存在另一种DNA甲基化修饰—6mA甲基化；Alkbh1是腺嘌呤甲基化修饰的一种去甲基化酶，在Alkbh1基因缺失突变小鼠细胞中腺嘌呤甲基化水平增加，进而导致转录沉默。揭示了哺乳动物表观修饰的重要组成部分—6mA甲基化，在哺乳动物中发挥沉默基因表达的功能，而不是如其他生物体中激活基因表达的作用。 6mA分析 6mA与基因表达的关系 6mA-IP seq分析 N6-Methyladenine DNA Modification in Drosophila.Cell, IF: 31.398 作者以果蝇胚胎干细胞为材料，对其基因组中6mA修饰进行研究，发现在果蝇基因组中6mA修饰广泛存在，这种修饰受內源去甲基化酶DMAD调控，在胚胎发育过程中呈动态变化。进一步研究发现，DMAD酶作为果蝇胚胎发育所必须的一种酶，它作用于转座子的6mA位点，去甲基化后，转座子的表达受到抑制。该文章发现果蝇中DNA甲基化修饰新类型-6mA，并且初步探究了6mA甲基化的调控机制。 6mA分布 mA体外去甲基化分析 6mA-IP seq与RNA-seq联
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Westernblot成像中得到完美荧光印迹的方法：湿膜快速转干膜
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
Westernblot荧光印迹膜成像：干膜or湿膜 ？ 干膜，还是湿膜成像：这是一个问题。 经过漫长的一天实验做荧光蛋白印迹，首先成像，以便可以看到实验成果。 这项工作流程没有任何问题，但这可能无法生成最佳图像。 如果您正在进行定性实验或具有高丰度的蛋白，那么对膜进行成像是很好的。 然而，许多研究人员已经转向荧光蛋白印迹法来定量分析低表达目的蛋白。 湿膜不适合成像，因为它们在成像过程中会慢慢变干，导致数据不一致。 由于湿膜的自发荧光与干膜不同，因此需要特别注意防止膜在成像过程中变干。 这意味着在成像过程添加缓冲液或将印迹膜放在塑料包装中以防止干燥。 如果您曾经对湿的印迹进行成像，您就知道在长时间曝光期间防止膜干燥是一件麻烦事。 使用荧光印迹的一大优势是随时可进行成像。湿膜经历长时间曝光时，看到高背景并不罕见。 高背景对灵敏度产生负面影响，使低丰度目标的检测更具挑战性。 湿膜成像显然是不方便的，并且不太理想，但这并不意味着您需要等待数小时才能使膜干燥。 荧光蛋白印迹后快速干燥膜的方法是将其浸入甲醇中。 所需要的是PVDF膜在100％甲醇中快速浸泡15秒。 硝酸纤维素膜不耐化学品，因此使用20％甲醇代替。 酒精会从膜的孔隙中代出水分，加速干燥，让您更快地对印迹进行成像。 这个快速提示将立即为您提供一个完美的印迹! 荧光干膜成像提高灵敏度
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DNA损伤修复机制——非同源末端链接NHEJ和同源重组HR
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
【干货】拯救你受伤的DNA-NHEJ与HR 生命极其脆弱，我们每天在电子辐射、紫外线、雾霾等等各种外部环境及细胞代谢产物等内源因素影响下，我们生命的核心-DNA都会受到不同程度的损伤，其中DNA双链断裂（DSBs，Double strand breaks）是损伤中最为严重的一种，然而生命却又极其强大，我们无时无刻不在受伤，也无时无刻不在自我修复。那么我们的身体里是用什么样的机制修复DNA损伤呢？且听我们慢慢道来~ 对于DSBs损伤，主要有非同源末端链接（Non-homologous end joining，NHEJ）和同源重组(Homologous recombination，HR）两种，单链退火修复一般发生在串联同源DNA序列中，研究较少[1]（图1）。下面小编就给大家具体介绍一下日常体内是如何通过这两种方式修复拯救我们受伤的DNA的。 图1. DSBs 修复途径 Alternative pathways of DNA double-strand break repair. Homologous recombination is the preferred route in yeast. It involves invasion of the broken DNA strands into a homologous DNA duplex molecule. This process requires Rad52 (a DNA end-binding protein), Rad51 (which forms filaments along the unwound DNA strands), DNA polymerases and other less well-characterized gene products. The DNA ends are ligated by DNA ligase I and the interwound DNA strands are separated, probably by another protein complex, with no loss of genetic information. Only one of many possible recombination products is shown here. Single-strand annealing takes place between two homologous DNA sequences in tandem (yellow and orange boxes) by a less well-studied mechanism. It also requires Rad52, and extensive degradation of the two unannealed strands results in considerable loss of genetic material. Nonhomologous end joining rejoins the two broken ends directl
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Southern blot检测技术在模式动物制备中的应用
作者：德尔塔 日期：2022-04-19
哈喽，小伙伴们！走过不要错过，又到了科普知识的时间了，喜欢做分子实验的小伙伴一定听说过Southern blot这门检测技术，但大家知道为什么叫Southern吗？今天小编就为大家科普一下这门实验技术。 Southern Blot是最早出现的blot（印迹）技术，它是检测DNA的一种方法。这项技术之所以被命名为“Southern”，主要是因为此技术在20世纪70年代由一位叫Edwin Southern的英国生物学家（见图1）发明，科学界为纪念该技术的诞生便以发明者的名字来命名，即Southern Blot[1]。 图1. Edwin Southern[7] （埃德温·迈勒·萨瑟恩） Southern blot 实验原理及步骤 了解了Southern 的由来，接下来小编带大家一起学习Southern blot实验原理及步骤。 Southern blot基本原理：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则特异性地杂交形成双链。其操作过程是利用特定酶将DNA消化成片段，再进行电泳分离，然后将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的DIG标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA片段分子的含量（见图2）[2]。 blot 操作过程[2] Southern blot 检测技术在模式动物制备中的应用 虽然距离这项技术发明已经过去很多年，但这项检测技术仍被广泛的应用在各种生物实验研究中。 如下图所示，为了鉴定携带条件性Satb1等位基因的供体质粒通过同源重组方式整合到小鼠的Satb1特异性位点上（见图3a），研究者们提取供体小鼠与wild小鼠肝脏基因组DNA，经限制性内切酶Eco RV (b) or Spe I (c,d)酶切，同时选择用于Southern印迹分析的DNA探针。探针位于待靶向的基因中，但在靶向载体外部设计5’与3’外源探针（5’ external probe与3’external probe）以及内源eGFP探针（GFP internal probe）。通过Southern blot检测显示，5’与3’外源探针分别与酶切后对应基因组片段发生杂交，说明供体质粒在5’与3’端与靶基
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