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如何选择离心管和离心瓶
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
如何选择离心管和离心瓶 离心管主要用玻璃、塑料和不锈钢制成，塑料离心管常用材料有聚乙烯（PE），聚碳酸酯（PC），聚丙烯（PP）等，其中PP管性能较好。塑料离心管的优点是透明（或半透明），硬度小，可用穿刺法取出梯度。缺点是易变形，抗有机溶剂腐蚀性差，使用寿命短。 不锈钢管强度大，不变形，能抗热，抗冻，抗化学腐蚀。但用时也应避免接触强腐蚀性的化学药品，如强酸、强碱等。 塑料离心管都有管盖，离心前管盖必须盖严，倒置不漏液。管盖有三种作用：①防止样品外泄。用于有放射性或强腐蚀性的样品时，这点尤其重要。②防止样品挥发。③支持离心管，防止离心管变形。使用玻璃管时离心力不宜过大,需要垫橡胶垫,防止管子破碎,高速离心机一般不选用玻璃管. 离心管(瓶)的材料、物理特性和化学稳定性见下表： 离心管材料 材料(中英)名称 简称 使用性能 聚乙烯(Polyethylene) PE 耐化学药品佳 聚碳酸脂(Polycarbonate) PC 透明强度高,耐高、温消毒 聚丙烯(Polypropylene) PP 强度中等, 耐高温高压消毒,4℃以下脆性半透明 纤维素(Cellulose) CAB 透明 多聚物(Polyallomer) PA 半透明,抗化学品好、耐高温、高压消毒 不锈钢(Stainless) SS 强度高、耐高温高压消毒 常见塑料离心管的物理性能 材 料 项 目 PE PP PA PC 密度 0.94～0.97 0.9～0.92 0.9 1.2 热变形温度℃ 60～80 99～104 130 132～138 吸水率％
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新HIV整合酶与侵入抑制剂**相关的耐药性和嗜性新观点
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
454 测序研究揭示新HIV 整合酶与侵入抑制剂**相关的耐药性和嗜性新观点 研究结果也许能作为未来**HIV病患的潜在**方案 加拿大蒙特利尔召开的第16届逆转录病毒及机会性感染会议（CROI）上公布的两项研究的最新数据证明，罗氏旗下454生命科学公司Genome Sequencer FLX系统的超深度测序（ultra-deep sequencing）与传统方法相结合，有望加深对病毒抗性和嗜性的基本了解，从而促进未来可供HIV病人选择的新药开发。用于综合**的有效药物筛选是确保病人可以最佳方式长期抑制HIV及防止疾病向艾滋病（AIDS）方向发展的关键。 逆转录病毒及机会性感染会议（CROI）上公布的研究结果由罗马大学Tor Vergata和Virco BVBA的科学家在Virco实验室最新进行的系列联合研究中完成。研究人员分析和解释了用Genome Sequencer FLX系统对HIV感染样品进行测序所得到的结果。这项研究探讨了HIV对一种叫做整合酶抑制剂的新型药物的耐药性，并且深入研究了病毒嗜性。454测序系统的超深度方法比较于传统的测序方法，能显著提高检测低频病毒变异--即病毒准种的灵敏性。 第一项研究分析了长期接受抗逆转录病毒**的患者在接受整合酶抑制剂raltegravir和优化核心疗法的综合**的情况。这项研究在多个时间点对样品同时进行多种分析，包括传统Sanger基因分型、体外表型分型和超深度测序。结果研究人员发现，**失败的病人体内存在多种病毒准种，其水平远低于常规检测下限，而**成功的病患体内这样的病毒准种数量要少得多。研究人员推测许多不同株的病毒共存或许有利于耐药性的发展，并最终导致**失败。 研究人员进一步提出，在基线水平上鉴别的病毒准种与**失败之间的相关性可能以一种更复杂的途径发生，其复杂性超过了目前已知的由单纯药物驱动的初级突变选择。Vergata大学Perno教授表示，“454测序技术的这种可识别极低水平突变的能力，为研究HIV如何对新药（比如整合酶抑制剂）产生耐药性提供了新观点”，他的同事Ceccherini-Silberstein博士补充道，“这
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酶标记抗体技术方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
酶标记物包括酶标记抗原、酶标记抗体和酶标记SPA等。酶标记物质量的好坏直接关系到免疫酶技术的成功与否，因此被称为关键的试剂。酶标记物中最常用的是酶标记抗体，它是将酶与特异性抗体经适当方法连接而成。酶标记抗体的质量主要取决于纯度好、活性强及亲和力高的酶和抗体，其次要有良好的制备方法。目前，高质量的酶(如辣根过氧化物酶，简称HRP)国内已有商品供应。高质量的抗体则可通过提取纯化而获得。在制备方法上，宜选用产率高、不影响结合物的活性和不混杂干扰性物质且操作简便易行的方法。 一、工作浓度的选择 在免疫酶技术中，首先要确定的变异因素就是酶标记物的工作浓度。因为酶标记物浓度的很小变化，便可导致试验结果产生很大的波动。另外，由于浓度过高，可使非特异性反应增加，而浓度过低又可影响测定的敏感性。因此，正式试验前必须准确滴定其工作浓度。 酶标记抗体的滴定方法是：将抗原(或抗体)物理吸附于固相载体上，然后将经过一系列稀释的酶标抗体(或抗Ig抗体)与吸附在载体上的抗原(或抗体)起反应，以酶与底物的显色反应程度来确定酶标记抗体的效价，或称工作浓度。 其步骤为：先将抗原(或抗体)用0.05M PH9.6包被缓冲液稀释为10μg／ml左右，于聚苯乙烯板孔内加0.1ml，4℃过夜，次日以洗涤缓冲液洗涤3次。酶标记抗体用1％BSA-PBS液依次稀释成1∶100，1∶200，1∶400，1∶800，1∶1600……(根据据抗体的滴度而定)，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔0.1ml，37℃孵育1小时后洗涤。然后加底物液，每孔0.1ml，37℃10～30分钟。以2M H２SO４ 0.05ml终止反应。 结果判定主要以ELISA比色仪读取各孔OD值。并以OD为纵座标，结合物浓度为横座标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的工作浓度。 有关试验的试剂及器材均见ELISA部分。 要说明的是，本法为ELISA直接法，所测的工作浓度与在实际应用中的最适浓度可相差几
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454测序识别早期HIV耐药性突变—低水平突变对临床结果意义重大
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
454测序识别早期HIV耐药性突变—低水平突变对临床结果意义重大 回顾性研究分析表明即使最低水平的耐药性突变也会导致早期**失败 2月17日《传染病杂志》（Journal of Infectious Disease）在线公布的一项研究称HIV病毒群体中少至1％的HIV耐药性突变会对临床结果产生显著影响。这篇论文由罗氏旗下454生命科学公司与耶鲁大学医学院研究人员合作完成，文章利用454测序系统对一个早期进行的临床试验FIRST Study（1）中获得研究样品进行分析，以鉴别之前无法检测到的耐药性HIV变异。 这项研究由耶鲁大学医学院以及VA康涅狄格医疗保健体系（VA Connecticut Health Care System）的Michael Kozal医学博士领导完成，研究人员在研究目的药物**之前，对264个来自HIV感染个体的血液样品进行了盲回溯性（blinded-retrospectives）分析。研究人员利用可灵敏检测低频突变的Genome Sequencer FLX系统对FIRST Study样品进行超深度测序分析。令人惊讶的是，结果表明携带耐药性突变的病人是原本预期的两倍。这项研究回答的第二个问题就是现有方法未检测到的低水平突变是否会影响病患**结果。显然，研究显示从统计学角度看，耐药病毒株水平低至1％都会造成早期抗逆转录病毒**失败。 文章的通讯作者Michael Koza医学博士表示，“现有临床技术仅能检测到占病人循环体系中病毒水平20%或以上的耐药性突变株。因此，现有临床检测很可能遗漏了许多低水平耐药性HIV株，这些病毒突变株在药物选择性压力下会快速生长，最终导致**失败”，“这一回顾性研究表明即使耐药性突变株的水平低至1％都会导致早期**失败”，“将来，临床医师有望利用这一研究结果来选择更好的抗逆转录病毒药物组合，从而抑制这些耐药性HIV株，以求在病人体内获得更好的临床效果。” 虽然在过去的十年当中，HIV病人存活率大幅度增加，但也有许多病人在开始**之后不久就有了耐药性。这一点在抗逆转录病毒药物被广泛应用多年的发达国家尤其如此。随着更多**进入HIV感染高度流行的
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ELISA试验条件的选择
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
1．固相载体的选择 载体的种类很多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。 聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。 由于聚苯乙烯的工艺过程不够稳定,造成各批次差异较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。检查方法： ⑴ 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，最后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的±10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另一侧孔OD值相差较大均属不合格。 ⑵ 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。 板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应弃去不用。 2．载体的吸附条件 载体的吸附均为物理吸附。吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间等。 较好的吸附条件是：离子强度为0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为1µg/ml~100µg/ml，4℃过夜或37℃3h。 3．酶标抗体使用浓度的确定 于聚苯乙烯板孔中加足够量的抗体包被,温育一定时间，冲洗、把酶标结合物倍比稀释，每个稀释度加2孔,温育、冲洗、再加底物显色、比色。以OD值为纵坐标,酶标结合物的稀释度为横坐标，制作曲线。找出OD值为1时，相对应的酶标抗体稀释度为最适酶标抗体稀释度。 这个稀释度是指在这种条件下的最适稀释度，换个条件就不是最适的了。如1﹕400的酶标抗体稀释度温育6h可与1︰6 400稀释度温育24h结果相同。所以一旦条件确定之后，就不要变更，以保证结果的重复性和相对的准确性。 此最适酶标抗体稀释度可做为工作浓度，也可提高半个
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ELISA实验质量控制问题
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
1.1 基本概念 1.1.1 质量控制（Quaility Control,Q.C） 质量控制是监视全过程，排除误差，防止变化，维持标准化现状的一个管理过程。这 一过程是通过一个反馈环路进行的。 1）确定控制的对象； 2）规定控制对象的标准（预期值）； 3）制定或选择控制方法和手段； 3）测量实际数据； 4）比较或较对实际数据与预期值之间的差异，并说明产生这一差异的原因。超出预 定误差范围，报警系发出信号，反馈通道中断。 5）采取行动，解决差异。恢复原状（原标准状态）的手段发挥作用。 质量控制主要采用质控图进行。质控图是把某一检验的性能数据与所计算出来的预期 的"控制限"进行比较的图。这种性能数据是在按规程正常进行时，按时间顺序而抽选出来 的，其目的是检测检验过程中变异的"可追查"性原因。"可追逆"性的误差原因，是指除去 随机误差以外的其他原因。"控制限"是通过统计计算出来的，在后我们将详细介绍（见 1.3.室内质控程序）。 1.1.2 误差 实验误差分为三种：系统误差、随机误差和过失误差。 系统误差是指一系列测定结果与真值或靶值存在有同一倾向的误差，有明显的规律 性，可在一定条件下重复出现，是可以通过质控预防和校正的。 随机误差又称偶然误差，是一种偶然的、未能预料到的误差，是难以避免和校正的误 差。检验工作中随机误差的分布符合正态分布规律。 过失误差是人为的责任误差。通过加强实验室管理和开展质量控制工作是可以避免 的。 1.1.3 正态分布及标准差 ELISA试验中，检验同一样本达20次以上时，就会发现这组数据（指测定结果的吸光 值）分布在均值两侧，大部分集中在均值附近。如果以测定值为横坐标，以出现的频率为 纵坐标作图，就可绘出一个呈钟形的曲线图。如图5-1，钟顶处为均值，其他值以均值为 中心对称分布，这就是正态分布。 换言之，当ELSIA检测同一样本达一定次数后所得的一组数据，其中靠近均值（X）的 ±1SD范围内的数
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ELISA（双抗体夹心法）—检测HBsAg
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
以已知抗体(抗HBs)包被载体，然后将含有抗原的待检标本加入，共同孵育后，抗原结合于包被抗体上，再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs)，酶标抗体连接到抗原上，最后加入底物溶液，根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】HBsAg试剂盒，本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1：20稀释 1瓶 6、显色剂（TMB）A 1瓶 7、显色剂（TMB）B 1瓶 8、终止液 1瓶 【方法】 1、加入待测标本每孔0.05ml，并设HBsAg阳性对照2孔，HBsAg阴性对照2孔，空白对照1孔，然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加)，充分混匀后置37℃孵育30分钟。 2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔，弃去拍干，反复五次后拍干。 3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml)，然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml)，混匀，37℃孵育10分钟。 4、每孔加终止液1滴(0.05ml)，混匀。 【结果】 比色法:波长450nm，先用空白孔校零点，然后读取各孔光密度值。 样品OD值/阴性对照平均OD值≥ 2.1判断为阳性，否则为阴性。 备注：阴性对照平均OD值低于0.05作0.05计算，高于0.05按实际OD值计算。阳性对照OD值≥0.8，实验结果有效。 【注意事项】 1、试剂盒置2℃～8℃保存。 2、使用前试剂应摇匀，并弃去1～2滴后垂直滴加。 3、从冷藏环境中取出试剂盒内全部瓶装试剂及待测标本所需微孔条，置室温平衡30分钟后再行测试，余者应及时封存于冰箱中以备后用。 4、待测标本不可用NaN3防腐。 5、不同批号试剂请勿通用。 6、结果判断须在10分钟内完成。 7、若浓缩洗涤液出现结晶时，请置37℃至溶解。
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小鼠胚胎干细胞培养实验步骤
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
一般培养-保持处于未分化状态 培养基 细胞复苏 冻存细胞 明胶包被 细胞传代 体外分化 培养基 包被有多聚鸟氨酸/纤维结合蛋白的培养板（使用或不使用盖玻片） 体外分化方法 注：以下培养针对于小鼠的R1系，其它的培养可以参考。不过人的胚胎干不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。 一般培养--维持ES细胞处于未分化状态 ES用含有LIF（抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。 培养基 ES: 配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基--见下文）。分装在50ml 离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450ml DMEM中制备培养基，0.22 μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。 贮存液 DMEM(高糖) 马血清（HS） L-谷氨酰胺（200mM） MEM NEAA（10mM） HEPES（1M） β-巯基乙醇（55Mm） PEST LIF 复苏细胞 细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。 步骤： 1．从液氮中取出一管细胞； 2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）； 3．将细胞转移到一15ml Falcon管中； 4．加入5ml ES培养基
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细胞膜蛋白质提取方法--蛋白质沉淀法
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
1．热变性及酸碱变性沉淀法 用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。 2．有机溶剂沉淀法 多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。 3．等电点沉淀法 用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。 4．非离子多聚体沉淀法 用于分离生物大分子。 5．生成盐复合物沉淀 用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。 6．盐析法 多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。 第一节 盐析法 一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中,许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段。 盐析法分为两类，第一类叫Ks分段盐析法，在一定PH和温度下通过改变离子强度实现，用于早期的粗提液；第二种叫b分段盐析法，在一定离子强度下通过改变PH和温度来实现，用于后期进一步分离纯化和结晶。 一．影响盐析的若干因素 1．蛋白质浓度 高浓度蛋白溶液可以节约盐的用量，但许多蛋白质的b 和Ks常数十分接近，若蛋白浓度过高，会发生严重的共沉淀作用；在低浓度蛋白质溶液中盐析，所用的盐量较多，而共沉淀作用比较少，因此需要在两者之间进行适当选择。用于分步分离提纯时，宁可选择稀一些的蛋白质溶液，多加一点中性盐，使共沉淀作用减至最低限度。一般认为2.5%-3.0%的蛋白质浓度比较适中。 2．离子强度和类型 一般说来，离子强度越大，蛋白质的溶解度越低。在进行分离的时候，一般从低离子强度到高离子强度顺次进行。每一组分被盐析出来后，经过过滤或冷冻离心收集，再在溶液中逐渐提高中性盐的饱和度，使另一种蛋白质组分盐析出来。 离子种类对蛋白质溶解度也有一定影响，离子半径小而很高电荷的离子在盐析方面影响较强，离子半径大而低电荷的离子的影响较弱，下面为几种盐的盐析能力的排列次序
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单克隆抗体的克隆化方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
的时间一般说来越早越好。因为在这个时期各种杂交瘤细胞同时旺盛生长，互相争夺营养和空间，而产生指定抗体的细胞有被淹没和淘汰的可能。但时间也不宜太早，太早细胞性状不稳定，数量少也易丢失。 克隆化的阳性杂交瘤细胞，经过一段时期培养之后，也还会因为细胞突变或特定染色体的丢失，使部分细胞丧失产生抗体的能力，所以需要再次或多次克隆化培养。克隆化次数的多少由分泌能力强弱和抗原的免疫性强弱而决定。一般说，免疫性强的抗原克隆次数可少一些，但至少要3～5次克隆才能稳定。 克隆化的方法很多，包括有软琼脂克隆化、显微操作法、荧光激活分离法及限稀释法等。 （一）软琼脂克隆化 借助撒在软琼脂上单个细胞定位生长，而达到克隆化，具体操作如下： 1．配2.5％的琼脂糖30ml，水浴溶化后，移入45℃水浴中。 2．将117ml完全DMEM液和3ml 10倍浓度的DMEM液混合，置45℃水浴预热。 3．将琼脂糖与DMEM液混合，即为含0.5％琼脂糖的完全DMEM液，并加75×108 脾细胞。 4．每块平皿加10ml，于室温中凝固。 5．DMEM中的细胞与DMEM—琼脂1:1混合，将细胞琼脂混合物2ml铺于凝固的平板上，使其全部覆盖。 6．放入CO2箱饱和湿度，37℃培养10天。 7．用PBS配制0.6％琼脂糖，于沸水浴溶解后，置45℃，在保温情况下取一试管，迅速加入0.1ml 25％羊红血球，0.2ml豚鼠补体，2.7ml 0.6％琼脂糖。 8．用3ml琼脂糖—羊红血球混合液覆盖克隆。于37℃CO2箱孵育1h~2h。从克隆上部溶解羊红血球的溶血范围，可筛选抗羊红血球Ig。 （二）显微镜操作法 在直径6cm培养皿中，加入1ml 1.0×108细胞悬液放置5％CO2饱和湿度，37℃温箱中放置30min以上，倒置显微镜下，寻找那些与周围相距甚远的单个细胞，将毛细管口（一头有直角弯头毛细管，一头连接一尺长乳胶管，用口控制液体进入）水平置放于液面上，左右微动，直到看见管口，对准细胞，吸入毛细管，将管中细胞移到预先加有2.0×104~5.0×104饲养细胞96孔板内
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oligos纯化方法的比较
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
为了纯化合成的寡核苷酸，将采取方法有脱盐、BioRP、PAGE、HPLC等进行oligos纯化的工作。各种方法的侧重点不同，需根据具体实验的要求来选择最适合的纯化方法： 脱盐 寡核苷酸合成后，为了纯化寡核苷酸成为天然的DNA结构，首先必须去除保护基团。通过浓氨水处理，合成的寡核苷酸从固相载体上分离，2-氰乙氧基――磷酸二脂键的保护基团，以及碱基的保护基团基（苯甲酰基和异丁基）被去除，从而形成了天然的DNA结构。然而，必要的去保护步骤完成后，寡核苷酸混合物还包含几种必须被去除的小分子有机化合物。所有非必须有机化合物被移除的过程通常叫做脱盐。脱盐纯化可以借助反向硅胶柱进行。尽管脱盐纯化可以移除所有的非必须有机杂质，但它不能有效移除合成中产生微量的提前终止的寡核苷酸杂链。然而，脱盐的寡核苷酸还是能够满足ＰＣＲ检测等基础生物研究。 BioRP 如果寡核苷酸以“三苯甲基”的形式合成，则N-甲基寡核苷酸包含5’-DMT基团，提前终止的寡核苷酸不包含该基团。因为DMT基有强的亲脂的特性，有5’-DMT基团的寡核苷酸与反相树脂有亲和性，因此反相亲和树脂通常被用于寡核苷酸的纯化。利用反向树脂和5’－DMT寡核苷酸存在强亲和力，但是提前 终止的寡核苷酸不包含DMT基团，所以，我们能够成功的把想要的N-甲基寡核苷酸从提前终止的寡核苷酸杂质中分离出来。 PAGE 对于长的寡核苷酸的纯化（50-100mer），我们推荐PAGE纯化法，它使用交连的聚丙烯酰胺凝胶(电泳)作为纯化基质。尽管PAGE显示出高的纯化效率（＞98%），但它在额外的步骤方面有一些缺陷，比如在PAGE之后需要提取和脱盐，继而将导致纯化产率的下降。 HPLC 如果合成的寡核苷酸应用于克隆，定向诱变或定量的基因探测，那么对其纯度要求较高。脱盐或OPC纯化的寡核苷酸可能达不到要求，则HPLC纯化被广泛地用于这个目的。作为一种纯化树脂，阴离子交换树脂或反向树脂被用于寡核苷酸纯化。阴离子交换树脂的HPLC通常显示95-98%纯化效率，对于达到35-me
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原代细胞基本实验技术小结
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
A 原代细胞分离技术 取人或动物体内（或胚胎）的组织，将其剪碎至1mm3的组织块，再采用的如下方法进行分离培养： 一、悬浮细胞的分离方法 1、将血液、羊水、胸水或腹水等悬液直接转至离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。 2、去掉上清，离心沉淀用无钙、镁的PBS清洗后1000rpm/分钟离心5分钟。此步重复两次。 3、用培养基重悬，调整适当细胞浓度后分瓶培养。 4、如选用悬液中某种细胞，可采用离心后的细胞分层液收获目的细胞。 二、实体组织材料的分离方法 （一）机械分散法 1、纤维成分很少的脑组织，部分胚胎组织，用剪刀剪碎至1mm3的组织块。 2、用PBS清洗两次后 ①用吸管吹打，分散组织细胞。 ②或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出。 ③或在不锈钢纱网内用钝物（注射器钝端）压挤使细胞从网孔中压挤出。 3、收集细胞转入离心管中，1000rpm/分钟离心5分钟。 4、去上清，加入含血清的培养基，重悬后移至培养瓶中培养。 （二）消化分离法 1、酶消化分离法（过夜冷消化法） ①细胞间质较少的软组织，如肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等，用Hanks液清洗组织三次，剪成碎块大小为4毫米左右。 ②再用Hanks液洗2-3次以除去血球和脂肪组织。 ③加入0.25%的胰蛋白酶，摇匀后放4℃过夜。 ④次日再用Hanks液洗涤，弃去上清，共洗2-3次。 ⑤加入少量含血清的培养基吹打分散，细胞计数，按适当的浓度分瓶培养。 2、非酶消化法（EDTA消化法） ①把组织块剪碎，呈1mm3大小的组织块。 ②将碎组织块在平皿中用无钙镁PBS洗2-3次。 ③加入消化液（胰蛋白酶或胶原酶或EDTA）于37℃水浴中作用适当时间（中间可轻摇1~2次），若组织块膨松呈絮状可终止，若变化不大可更换一次消化液，继续消化直至膨松絮状为止。 ④弃去上清，加入含有钙、镁离子的培养基中止消化反应，并洗涤2-3次后，加入完全培养基。 ⑤用吸管吹打，使细胞充分散开后用纱网过滤后分瓶培养。 B 原代细胞无血清培养技术 1、弃去培养基废液
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原代细胞培养之--取材技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
细胞的来源多样，培养方法也各不相同，凡是来源于胚胎、组织器官及外周血，经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化，经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群，称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础，只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法,本章重点叙述常用的基本技术。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件，是进行细胞培养的第一步，若取材不当，将会直接影响细胞的体外培养，现将取材的基本要求和注意事项叙述如下： 一、取材的基本要求 （1）取材要注意新鲜和保鲜 新鲜组织易于培养成功，取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞，尽快入箱培养，若不能即时培养，应将组织浸泡于培养液内，于4℃存放。若组织块较大，应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后，切碎于培养液内4℃存放，但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基，按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 （2）取材应严格无菌 所取标本材料应在无菌条件下进行，为了确保无菌，对所取材料若疑有污染的可能，应将所取组织在含高浓度抗菌素（400单位/mL）甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上，再用PBS洗2~3次，以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液（内含400单位/mL抗菌素）的小瓶等便于携带的物品来取材，所取材料应避免接触有毒有害的化学物质，如碘、汞等。 （3）取材和原代细胞制作时，要用锋利的器械，如手术刀或剃须刀片切碎组织，尽可能减少对细胞的机械损伤。 （4）要仔细去除所取材料上的血液（血块）、脂肪、坏死组织及结缔组织
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原代细胞培养之--细胞分离技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
原代细胞的分离和制作 人或动物体内（或胚胎组织）由于多种细胞结合紧密，不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖，即使采用1mm3的组织块，也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长，若需获取大量细胞，必须将现有的组织块充分散开，使细胞解离出来，常采用的方法如下： 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min的低速离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。 二、实体组织材料的分离方法 对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法（物理裂解）和消化分离法。 （一）机械分散法 所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内（用九号针），使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤（常用注射器钝端）使细胞从网孔中压挤出。此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。 （二）消化分离法 组织消化法是把组织剪切成较小团块（或糊状），应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分
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原代细胞培养之--培养技术
作者：德尔塔 日期：2022-05-01
原代细胞的培养方法 原代细胞的培养也叫初代培养 是从供体取得组织细胞在体外进行的首次培养，是建立细胞系的第一步，是一项基本技术。原代细胞因刚从组织中分离开，生物学特性未发生很大变化，仍保留原来的遗传特性，也最接近和反映体内生长特性，适宜用于药物敏感性试验、细胞分化等实验研究。 原代细胞往往有多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比性实验研究，还需进行短期传代培养。 1、组织块培养法 组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，故原先被称为组织培养。其方法：为将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其培养方法如下： (1)按照前述方法取材，将组织剪成或切成1mm3大小的小块，并加入少许培养基使组织湿润。 (2)将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2 cm~0.5cm，一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20～30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 (3)培养2~4小时，待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，严禁摇动和来回振荡，以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败，若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24小时后再补液
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