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浅谈荧光在酶标仪上的应用以及新一代酶标检测系统（Paradigm+Tune）的优势
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
前言 我们知道目前生命科学及现代分子生物学主要集中在对核酸和蛋白质等生物大分子的分析以及进行一些细胞水平的研究。传统的分析方法是采用放射性同位素作为一种示踪剂，标记在各种生物大分子或者细胞中来研究它们之间的相互作用和变化，但是放射性同位素对环境具有一定的破坏性，对人体健康也具有一定的损害，所以各国的科学家都致力于研究和应用高灵敏度的非同位素检测方法，利用荧光探针作为一种标记物，以其自身的一些优势而得到广泛的应用。目前对荧光进行检测的仪器种类很多，例如我们常见的荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、流式细胞仪、多功能读板仪（酶标仪）等，普通的荧光显微镜只能观察物质形态，不能给出量化指标，而流式细胞仪又因其价格昂贵和操作复杂不能得到广泛的应用。酶标仪作为一种荧光信号检测仪器，具有很多优势，不但价钱便宜、个头小、操作简便，而且还可以根据荧光信号特点和强弱来对物质进行定性和定量的分析。目前市面上支持荧光检测的多功能酶标仪种类很多，例如的系列的，，和，和目前市面上唯一一款可以完成快速动力学实验的等。 荧光产生机理 荧光探针（荧光染料分子）在光的照射下，物质的电子吸收能量后，可由低能级的电子层（内电子层）跳到高能级的电子层。此时，电子由低能态进入高能态。高能态的电子是不稳定的，他会在极短的时间（10-8s）内，以辐射光量子的形式释放能量后，再回到原来的能态。这时发射出的波长比激发光的波长要长，如果在可见光波长的范围内，为人眼所能看见的光，这种光称之为荧光。荧光是发光体分子中处于激发态的原子核外电子由高能级回到低能级所产生的辐射，因此是冷光。荧光的颜色多为蓝色、绿色、红色和黄色等。 荧光检测技术优势和影响因素 荧光检测技术具有灵敏度高、特异性好、动态范围宽、无放射性污染等优点；但也易受到反应体系中PH值和环境温度的影响，另外如荧光淬灭、光漂白等现象也会对荧光信号的检测产生较大的影响。 我们
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抗体保存注意事项和保存条件
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
抗体保存得当与否，直接决定了抗体的活性和使用效果！如果抗体保存得当，大部分抗体活性都可以维持数月甚至数年。以abcam 抗体保存方法为主，同样也可以应用到其他绝大部分的抗体产品！ 1. 收到抗体后请务必在12000rpm 离心1-5min 后再打开管盖进行分装和保存！质优的抗体使用非常特殊的储存管，只有在12000rpm 离心1-5min 才能将附着在管壁或盖内的抗体全部离心下来。即使是在10000rpm 离心也会导致离心不完全，导致出现抗体的量不足的现象！ 2. 对于大部分抗体，比较合适的保存方式是分装后保存在 -20 度 or -80 度对绝大多数抗体来说，保存在-20 度是完全足够了。没有任何证据显示保存在-80度 会有更多的好处！ (1) 分装可以最大程度的降低反复冻融对抗体活性的损害，同时也降低了由于多次从同一管中吸取抗体造成的污染可能性。 (2) 分装的量以一次实验用完为好，最少不能少于10ul 每份。因为分装体积越小，抗体的浓度越可能会受到蒸发以及管壁吸附的影响 (3) 复融后的分装抗体如果一次用不完，将剩余母液保存在4 度，避免再冻起来！ (4) 抗体工作液应该当天配制当天用完，在4 度 尽量不要超过1 天。 (5) 绝对避免将抗体保存在自动除霜冰箱中。尽量将抗体保存在冰箱里层，而不是门上 3. 大部分抗体收到后4 度短暂保存1-2 周对抗体活性是没有影响的。 如果抗体很快(1-2 周)会使用，推荐在4 度保存，这是为了避免反复冻融对抗体活性的损害。 如果要长期保存则**是在-20 度 or -80 度。最关键的一点是要根据说明书推荐的方式来正确的保存抗体！但是，腹水形式的产品请在收到后立即冻起来！因为该类产品含有大量的蛋白酶，长期在4 度保存会导致抗体的降解！ 4. 大部分抗体的运输条件：一般的运输过程需要1-2 周的时间，所以是在4 度的条件下来完成的。4 度运输最主要的目的是为了避免反复冻融对抗体活性的损害(如果使用干冰运输，那么收到时抗体是冻起来的，为了分装就需要解冻。这就多了一次冻融的过程)。所以
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进口内参抗体——在WB实验中为什么需要使用内参抗体？
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，**方法是Western Blot。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用的。 我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。艾美捷向您推荐使用内参抗体来检测您的实验系统，或者校准您的实验结果。内参即是内部参照(Internal Control)，对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。 实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差
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PriCells: Isolation of endothelial progenitor cells (EPCs)
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
PriCells: Isolation of endothelial progenitor cells (EPCs) 1. Twenty-four mL venous blood was collected at each time point into Vacutainer CPT Mononuclear Cell Preparation Tubes. 2. MNCs recovered by density-gradient centrifugation in these tubes were washed twice with PBS and once in EPC growth media consisting of medium199 supplemented with 20% fetal bovine serum, penicillin (100 U/mL), and streptomycin (100 μg/mL). 3. Cells were resuspended in media, plated at a density of 5x106 per well on dishes coated with human fibronectin, and incubated at 37°C in humidified 5% CO2. 4. After 48 hours, nonadherent cells suspended in the growth media were replated onto fibronectin-coated 24-well plates at a density of 106 per well. 5. Media was changed every 3 days. EPC colony-forming units after 7 days in culture (Figure A). Cell clusters alone without emerging spindle cells (Figure B). Reference Tiffany M. Powell, Jonathan D. Paul, Jonathan M. Hill, Michael Thompson, Moshe Benjamin, Maria Rodrigo, J. Philip McCoy, Elizabeth J. Read, Hanh M. Khuu, Susan F. Leitman, Toren Finkel, Richard O. Cannon III. Granulocyte Colony-Stimulating Factor Mobilizes Functional Endothelial Progenitor Cells in Patients With Coronary Artery Disease. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 2005; 25: 296-301
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PriCells: Questions
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
PriCells: Questions Questions 1: Isolation of hepatocytes from other species The basic two-step perfusion procedure can be used for obtaining hepatocytes from various rodents, including mouse, rabbits, guinea pig, or woodchuck, by adapting the volume and the flow rate of the perfused solutions to the size of the liver. The technique has been adapted for the human liver by perfusing a portion of the whole liver (usually with 1.5 L HEPES buffer and 1 L collagenase solution at 70 and 30 mL/min, respectively) or by taking biopsies (15-30 mL/min, depending on the size of the tissue sample). A complete isolation into a single-cell suspension can be obtained by an additional collagenase incubation at 37oC under gentle stirring for 10-20 min (especially human liver). Fish hepatocytes can be obtained by cannulating the intestinal vein and incising the heart to avoid excess pressure. Perfusion is performed at room temperature at a flow rate of 12 mL/min Question2: Maintenance and differentiation of liver parenchymal cells 1. Isolation liver parenchymal cells can be maintained in suspension for 4-6 h and used for short-term experiments 2. When seeded in nutrient medium supplemented with 1X106 M dexamethasone on plastic culture dishes (7X105 viable cells/mL), the liver parenchymal cells survive for a few days. 3. Survival for several weeks is obtained by seeding the liver parenchymal cells onto a biomatrix. However, the cells rapidly lose their specific differentiated functions. 4. Higher stability (2 months) can be obtained by co-culturing hepatocytes with liver e
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法测效靶细胞杀伤——用流式细胞术
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
做免疫学特别是肿瘤学实验，总免不了要测淋巴细胞或其他细胞对肿瘤细胞的杀伤，国外最常用的是Cr51放射实验，但这个方法在国内的不少地方都不能做，而MTT这个方法又太老，而且也不准确，那么替代方法就用流式细胞术，又方便，又准确。 具体参照如下： 1、计数靶细胞，并加入CFSE，使CFSE终浓度达到2uM,37度30分钟。 2、拿出后，1000rpm,5min,可隐约看到细胞染成黄色，PBS洗三次 3、与效应细胞混培，作用4-6小时。 4、将细胞混合液消化取出，洗二次，PI工作液5ul，避光30分钟后上流式 5、CFSE，PI双阳性的细胞为被杀伤的靶细胞，除以靶细胞总数，即为杀伤率。 注意事项： 1、CFSE及PI的浓度必须注意，宁低勿高，个人感觉，如果标高的话，在4度放一晚好像会好一些 2、必须设全阴，CFSE单标，PI单标，CFSE＋PI双标并同步化的靶细胞的参照. 3、作用时间不能太长，不要超过8个小时。 你可能感兴趣的生物试剂： 肿瘤/凋亡研究相关抗体 人、大小鼠等Elisa检测试剂盒 生长因子 趋化因子 蛋白酶 神经营养素
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Fluorescent Staining of Cells
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
1. Fluorescent phalloidin in methanol. Phallacidin does not work as well. Dilute 10 ul 330 nM stock into 500 ul PBS for each large coverslip. 2. PBS, solution A. Procedure: 1. Fix and permeabilize cells (see other protocols). Mount coverslip onto a plastic frame reserved for fixed samples. Apply some vacuum grease to the frame before use, if necessary. 2. Turn off light. Dilute fluorescent phalloidin 50x into PBS. 3. Gently pipet phalloidin solution onto coverslip. Stain for 30 min at room temperature. 4. Rinse coverslip 3x with PBS. 5. Fill the chamber with PBS or an antibleaching solution and observe. Dishes may be stored at 4o in a sealed, light-tight container. Immunofluorescence Staining Materials: 1. PBS/BSA: PBS solution A with 1% BSA (Boehringer Mannheim 100 350) and 0.1% NaN3, stored at 4oC. Bring to room temperature before use. 2. Primary antibody, diluted appropriately with PBS/BSA. Need 200 ul per 45x50 coverslip. Clarify in a Eppendorf for 15 min (minimal requirement) or in an ultracentrifuge with the Type 42.2Ti rotor (or Airfuge) if necessary. 3. Secondary antibody, prepared as for the primary antibody. 4. Coverslip boxes. Procedure (do not allow coverslips to dry out anytime): 1. Fix and permeabilize cells (see other protocols). Wash with PBS/BSA for 10 min in a fixation box. 2. Cut a small piece of parafilm to match the area of staining and put 200 ul antibody solution on the piece. Shake off most of the liquid from the coverslip but do not let it dry out. Invert the coverslip onto the parafilm. Prepare a 100 mm plastic petri dish containing a
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Fusion and Cloning
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
本文章来源于SciMall科学在线 Reagents Medium A - Pre-fusion Medium and Hybridoma Expansion Medium Medium B - Fusion Medium Medium C - Hybridoma Recovery Medium Medium D - Hybridoma Selection Medium Medium E - Hybridoma Growth Medium PEG Solution Materials 50 ml Sterile conical tubes 15 ml Sterile conical tubes 10 ml sterile pipets 1 ml sterile pipets Pasteur Pipets, sterile 100 mm sterile Petri Dishes 96-well culture dishes 24-well culture dishes Forceps Scissors Multi-channel pipettor, 50-200μl Pipet tips, sterile Reagent Reservoir, sterile Tupperware container Myeloma Cells 1. One week prior to the fusion, split myeloma cells into Medium A to ensure that they are well adapted. 2. Grow up approximately 2 x 107 healthy cells, in mid-log phase, for each fusion Fusion 1. Count the myeloma cells and resuspend to 2 x 107 cells in 30 ml Medium A in a 50 ml tube. 2. Sacrificed the mouse, saturate in ethanol, and remove the spleen. 3. Place the spleen in a Petri dish containing 10 ml of Medium A. 4. Prepare a single cell suspension of the spleen. 5. Using a Pasteur Pipet, transfer the spleen cells to a 50 ml tube. 6. Rinse the Petri dish with another 10 ml of Medium A and add to the tube. 7. Allow the tube to sit for approximately 1 minute to settle the larger pieces of tissue. Transfer the cell suspension to a clean tube, leaving behind the larger pieces of tissue. 8. Add 10 ml of Medium A to the tube to wash the tissue pieces. Allow to settle. Transfer the medium to the clean tube, co
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3H-Thymidine Uptake by Cultured Cells
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
Materials Fibroblast cells in log phase growth Ca , Mg free-phosphate buffered saline (PBSA) 5% (w/v) Glutaraldehyde (GTA) 2% (w/v) Perchloric Acid (PCA)Subbed slides (coated with chrom alum gelatin) and Permount Nuclear Track Emulsion (Kodak or Ilford) Darkroom and chemicals for photographic processing Dektol developer Kodak Fixer Giemsa stain, graded series of alcohols, xylol Procedure Grow either L cells (Mouse fibroblasts) or chick embryo fibroblasts on coverglasses and then give them H-thymidine for a short period of time. At the end of the labeling period, wash the coverslips in PBSA by gently grasping a coverslip with forceps and passing it through a beaker of saline. Fix cultures in glutaraldehyde for 15 minutes. Wash in several changes of water. Wash in cold 2% PCA for 5 minutes to remove unincorporated labeled precursors to DNA. Repeat twice. Wash in water 5 minutes. Repeat. Dry the backs of the coverslips with filter paper, and mount CELL SIDE UP on slides with Permount.The slides should be very clean. Coat the slides beforehand with chrom alum gelatin (CAG) by dipping the slides into CAG solution and draining until dry. This coating, and the gelatin coating on the coverslips, help to prevent the emulsion layer (below) from pulling away from the slide during later development. Allow Permount to dry overnight. In a darkroom, spoon out a small amount of gel into a suitable vessel, and slowly melt it at 45° C in a water bath.Kodak NTB-3 emulsion is stored refrigerated as a gel in a screw cap bottle inside a double light-tight box. Dip the slide in the
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肌动蛋白（Actin）动力学调节机制
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
细胞骨架的定义分为狭义和广义两种，前者是微丝，微管和中间纤维的总称，它们存在于细胞质内，又被称为“胞质骨架”。后者还包括细胞外基质（extracellular matrix）、核骨架（nucleoskeleton）和核纤层（nuclear lamina）。细胞骨架是细胞内运动，细胞器固定，细胞外型维持，信号传导和细胞分裂的物质基础之一。 信号分子结合到膜上受体，或者是激活与受体偶联的蛋白质—大G蛋白，或者先是激活受体酪氨酸激酶，再激活下游的小G蛋白Ras。G蛋白是一个很大的家族，包括Rho，Rac，Ras等小家族，它们在细胞中扮演着信号传导开关的角色。当它们与GDP结合时，呈现失活状态。在鸟嘌呤交换因子（英文：Guaninexchangefactor，简称GEF）的帮助下，G蛋白脱离GDP并与GTP结合，进入激活状态。G蛋白的GTP会被GTP酶激活蛋白（英文GTPase-activatingproteins，简称GAP）水解，并释放出其中的能量，让G蛋白行使其功能。就是说，G蛋白通过这一GTP/GDP循环在激活/失活状态中回旋，传递信号。当G蛋白被激活后，它下游的多种分子会被激活。这些下游分子本身会形成网络，相互制约，或者是相辅相成。它们调控着细胞迁移中各个方面。它们作用的详细情况请见文章中的相应章节。 本信号转导涉及的信号分子主要包括： Sema1a，PlexinA，Mical，Integrin Recaptor，Src，Paxillin，FAK，PI3K，PI3Kα，GRB2，GEF，Ras，P130，GIT1，GIT2，PIP2，PIP3，Cofilin，Crk，PIX，TIAM1，Vav，MEKK，Cartactin，WAVE，PI5K，ROCK，RTK，PLCβ，PLCγ，Nck，WASP，CaM，GPCR，PKA，PKCα，Fascin，Ena，VASP，PIX，cdc42，Filamin，MEK，MLCK，RhoGEF，Rho，ROCK，mDIA，MBS，Profilin，MLC，Arp2，Arp3，IP3，CaM，LIMK，PKD1，Calcineurin，SSH，14-3-3ζ，CIN，Cofilin，Hsp90，Gelsolin，ADF，CapZ，Tmod，Tropomyosins等。 点击图中信号分子，自动寻找相关产品
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血管生成（Angiogenesis）信号通路图
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
血管生成是通过人体中存在的诸多互补和复杂的信号途径调节的.血管内皮生长因子(VEGF)-血管内皮生长因子受体(VEGFR)、血管生成素(Ang)-Tie2轴和Dll4-Notch这3个复杂的、相辅相成的信号传导通路可在调节血管生成中发挥重要作用. VEGF与内皮细胞上的两种受体KDR和Flt-1高亲和力结合后，直接刺激血管内皮细胞增殖，并诱导其迁移和形成官腔样结构；同时还可增加微血管通透性，引起血浆蛋白（主要是纤维蛋白原）外渗，并通过诱导间质产生而促进体内新生血管生成。VEGF在血管发生和形成过程中起着中枢性的调控作用，是关键的血管形成刺激因子。碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）。TNF-α是一类具有血管活性的细胞因子，可诱导异位子宫内膜炎性细胞因子MCP-1，IL-6和IL-8等的释放，促进异位内膜及基质细胞增殖及炎性细胞浸润，新生血管形成，组织粘连，从而形成异位病灶。 本信号转导涉及的信号分子主要包括： HIF1α，PHDs，HIF1β，PI3K，Akt，mTOR，S6K，4E-BP1，eIF4E1，elF4E1，Ras，MEK1，MEK2，Erk1，Erk2，MNK，CBP，P300，TCEB1，TCEB2，Rbx1，Cul2，VHL，MMP，Cox2，PAI-1，VEGF，PDGFR-β，VEGFR2，Tie2，FGFR，IGFR，TGFα-R，SLIT，ROBO，Src，FAK，p38，MAPK，Smad2，Smad3，PLCγ，NOS等。 点击图中信号分子，自动寻找相关试剂
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RNA探针的合成方法和合成效率检测
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
RNA探针的合成方法和合成效率检测 在RNA的杂交检测实验中，应用标记的RNA 探针将获得高灵敏度的杂交检测结果，与DNA 探针相比，检测灵敏度提高10-100倍。因为对于不同的杂交体类型来说，RNA-RNA杂交体的结合强度高于RNA-DNA和DNA-DNA杂交体。对于通过Northern blots检测低浓度mRNA，以及原位杂交的核酸定位检测等应用，RNA探针是一种理想选择。RNA探针同样也适用于Southern blots，文库筛选，斑点杂交等应用。但是，在RNA探针制备过程和整个杂交实验过程中，必须注意RNAse的防污染操作。 制备RNA探针的常用方法是构建含探针标记模板的重组质粒，将克隆子的转录区下游进行限制性酶切线性化后，进行体外转录的探针合成反应。当然，采用的质粒上必须含有SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。体外转录法合成的探针量很大，通常情况下，1μg的DNA模板进行反应，将得到20μg的标记RNA探针。 另一种更加直接的体外转录标记法，是先通过PCR方法制备DNA探针模板。扩增引物需要特殊设计，包含SP6，T3或T7 RNA聚合酶的启动子序列。 对于原位杂交的应用，为了更好地进行杂交反应的质控，建议在制备反义链探针的同时，也制备正义链的探针，用作杂交实验的阴性对照。在原位杂交实验前，首先通过Northern blots实验验证探针的有效性和目标转录子在不同样本中的表达模式，有助于简化后续原位杂交实验的优化流程和结果解释。 模板制备和探针标记 以地高辛（DIG）的探针标记方法为例，罗氏DIG Northern Starter Kit的操作指南中建议，如果直接通过PCR方法制备DNA探针模板，反义链端的反向扩增引物应包括T7 RNA聚合酶的启动子序列5'-AATACGACTCACTATAGG-3'（后续通过T7 RNA转录），或T3启动子序列5'-ATTAACCCTCACTAAAGG-3'（通过T3 RNA转录）。 通过此方法获得的特定PCR产物，无需经过纯化，即可用于下游探针合成。对于地高辛标记系统，在体外转录合成的探针片段中，大约每隔3个UTP位点会插入一个DIG标记的UTP分子（DIG-11-UTP
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显微镜测微尺使用方法
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
相信大多数使用者对显微测微尺的使用并不是十分了解和熟悉，所以我将显微测微尺的使用说明整理一下，现在放出来供广大显微镜使用者学习，希望对他们有所帮助。 显微测微尺是用来测量显微镜视场内被测物体大小、长短的工具, 包括目镜测微尺(分划目镜)和测微台尺。用时需两者配合使用。目镜测微尺系在目镜的焦面上装有一刻度的镜片而成, 其每一刻度值为0.1mm, 测微台尺为一特制的载玻片, 其中央有刻尺度, 每一小格的值为0.01mm, 使用时, 先将目镜测微尺插入目镜管, 旋转前透镜将目镜内的刻度调清楚, 在把测微台尺放在载物台上, 调焦点到看清楚台尺的刻度。观察时先将两者的刻度从“0”点完全重叠, 在向右找出两尺又在何处重叠, 然后记下两尺重叠的格数, 以便计算出测微尺每小格在该放大率下的实际大小。测量时不再用测微台尺, 如改变显微镜的放大赔率, 则需对目镜测微尺重新进行标定. 通过以上的显微测微尺的简单介绍，不知显微镜使用者学会了没有？如果还有不懂的地方，也可以继续关注我以后的文章。
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Elis实验结果管理
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
1．固相载体的选择 载体的种类很多，其中包括纤维素、交联右旋糖酐、葡萄球菌聚苯乙烯、聚丙烯酰胺等。从使用形式上可有凹孔平板、试管、珠粒等。 聚苯乙烯凹孔板是应用最广泛的一种载体。聚苯乙烯塑料微量滴定板吸附蛋白的性能好，操作简便、用量小，适于大批检查。 由于聚苯乙烯的工艺过程不够稳定,造成各批次差异较大。所以进行ELISA之前，必须进行筛选。检查方法： ⑴ 吸附性能的检查：先加抗体包被，然后加入同一稀释度的酶标抗体，最后加底物、显色、测OD值,求出总平均OD值,再求出每相邻两孔的OD平均值,此均值在总均值的±10%以内为合格,若中间孔与四周孔OD值相差太大，或一侧与另一侧孔OD值相差较大均属不合格。 ⑵ 对比测定阳性血清与阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者OD值相差于10倍以上者为合格。 板的处理。新板一般不用处理,用蒸馏水冲洗即可应用。板用一次即废。但不少实验工作者认为用超声波处理，清洁液Tritonx100、20%乙二醇处理仍可应用。但发现空白对照显色较深和阳性样品显色结果不理想时，应弃去不用。 2．载体的吸附条件 载体的吸附均为物理吸附。吸附的多少取决于PH值、温度、蛋白浓度、离子强度以及吸附时间等。 较好的吸附条件是：离子强度为0.05Mol/L～0.10Mol/L，pH9.0～pH9.6碳酸盐缓冲液，蛋白浓度为1µg/ml~100µg/ml，4℃过夜或37℃3h。 3．酶标抗体使用浓度的确定 于聚苯乙烯板孔中加足够量的抗体包被,温育一定时间，冲洗、把酶标结合物倍比稀释，每个稀释度加2孔,温育、冲洗、再加底物显色、比色。以OD值为纵坐标,酶标结合物的稀释度为横坐标，制作曲线。找出OD值为1时，相对应的酶标抗体稀释度为最适酶标抗体稀释度。 这个稀释度是指在这种条件下的最适稀释度，换个条件就不是最适的了。如1﹕400的酶标抗体稀释度温育6h可与1︰6 400稀释度温育24h结果相同。所以一旦条件确定之后，就不要变更，以保证结果的重复性和相对的准确性。 此最适酶标抗体稀释度可做为工作浓度，也可提高半个
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志贺氏菌检测新国标厌氧条件增菌的解决方案
作者：德尔塔 日期：2022-05-02
2012年5月17日，中华人民共和国卫生部颁布GB 4789.5-2012《食品安全国家标准食品微生物学检验 志贺氏菌检验方法》，新国标将于2012年7月17日起实施。 该标准实施之日起，原GB/T4789.5-2003标准作废。 解读新国标GB4789.5-2012 为了提高食品中志贺氏菌检出率，降低操作者的操作要求，增菌过程的调整是本次新标准最大的变动之处。 两份国标方法之间增菌部分的主要区别如下表所示： GB4789.5-2003 GB4789.5-2012 增菌培养基 GN增菌肉汤 志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素 取样操作 无菌均质器或研钵 无菌均质器或拍击式均质器 增菌培养条件 37℃，有氧培养6~8小时 41.5℃，厌氧培养16~20小时 …… …… …… 更改增菌培养方式的最终目的是最大程度消除食物样品中的杂菌背景对于检测培养的影响。 1、厌氧环境41.5℃培养，可排除需氧菌和大部分不耐热的厌氧菌与兼性厌氧菌干扰； 2、使用志贺氏菌增菌肉汤-新生霉素进行增菌，可排除革兰氏阳性菌和部分革兰氏阴性肠杆菌（如变形杆菌等）的干扰； 减少杂菌背景的同时，也降低了杂菌在增菌过程中对于数量很少的志贺氏菌的竞争抑制作用，可有效地提高志贺氏菌的扩增量，有助于进一步的分离与鉴定。 厌氧增菌的解决方案 不同于常规厌氧培养，新国标中的增菌培养是在无菌三角烧瓶或无菌匀质袋中进行，故厌氧袋因容积限制而无法使用，故我们推荐如下解决方案： 解决方案一： 每日样品检测量80-120份的实验室，建议配备AW500SG/TG全能型厌氧工作站。 型号 AW500SG/TG 最大培养容量： 120只（250ml标准三角烧瓶） 80 只（500ml标准三角烧瓶） 传输舱容量： 6只（250/500ml标准三角烧瓶） 解决方案二： 每日样品检测量70~90份的实验室，建议配备AW400SG/TG全能型厌氧工作站。 型号 AW400SG/TG 最大培养容量： 90只（250ml标准三角烧瓶） 70只（500ml标准三角烧瓶） 传输舱容量： 6只（250/5
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